Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Биомолекулярные системы и методы их исследования 9
1.1 Объекты исследования и их основные физико-химические свойства 9
1.2 Методы исследования структуры и основных физико-химических свойств флавоносодержащих соединений
1.2.1 Экспериментальные методы изучения структуры и оптических характеристик флавоносодержащих соединений 15
1.2.2 Теоретические методы расчета параметров молекул флавоноидов 17
1.3 Молекулярное моделирование 22
1.3.1 Базисные наборы .22
1.3.2 Метод функционала плотности 25
1.3.3 Метод теоретической колебательной спектроскопии .32
Глава 2. Структурно-динамические модели фрагментов молекул флавоноидов 35
2.1 Моделирование структуры и колебательных спектров -замещенных пирона 35
2.2 Моделирование структуры и спектров -замещенных бензо--пирона .43
2.3 Моделирование структуры и колебательных спектров флавона 50
Глава 3. Структурно-динамические модели гидроксизамещенных флавона ..
3.1 Моделирование структуры и спектров моногидроксифлавонов 55
3.2 Моделирование структуры и спектров конформеров 3,4-дигидроксифла-вона .62
Глава 4. Структура и ИК спектры ряда представителей класса флавоноидов фармакологического назначения
4.1 Моделирование структуры и спектра апигенина .67
4.2 Моделирование структуры и спектра кризина .73
4.3 Моделирование структуры и спектра лютеолина 78
4.4 Моделирование структуры и спектра кверцетина .85
4.5 Моделирование структуры и спектра кемпферола 91
4.6 Экспериментальное и теоретическое исследование колебательных спектров сложных полимолекулярных соединений природного происхождения.98
Заключение 116
Список литературы .1
- Методы исследования структуры и основных физико-химических свойств флавоносодержащих соединений
- Моделирование структуры и спектров -замещенных бензо--пирона
- Моделирование структуры и спектров конформеров 3,4-дигидроксифла-вона
- Моделирование структуры и спектра кверцетина
Введение к работе
Актуальность темы
Установление связи «структура - спектр» в биоорганических соединениях, перспективных с точек зрения фундаментальной науки и их практического использования, является одной из актуальных проблем биофизики.
Определение особенностей строения и физико-химических свойств биомолекулярных систем с использованием методов колебательной спектроскопии предполагает их исходное описание как квантовых объектов. Подавляющее большинство биомолекулярных систем состоит из большого числа атомов и имеет сложное строение, что находит сво отражение в их колебательных ИК и КР - спектрах. В колебательных спектрах содержится первичная информация об их строении и физико-химических свойствах. Извлечь из них в полном объме необходимую информацию о структуре и свойствах таких систем и дать их интерпретацию, не опираясь на результаты молекулярного моделирования, использующего современные квантово-механические методы расчта равновесной конфигурации и структуры, практически невозможно. Это определяет актуальность применения молекулярного моделирования в исследованиях биоорганических соединений с целью установления в них связи «спектр - структура».
Объектами исследований, результаты которых представлены в диссертации, стали биоорганические соединения из класса флавоноидов, представляющих собой группу биологически активных соединений, интерес к которым в настоящее время возрос со стороны молекулярной биофизики и фармакологии.
Наиболее перспективными представителями исследуемого биомолекулярного класса соединений, с точки зрения медицины, являются: апигенин, кризин, лютеолин, кверцетин и кемпферол. Эти соединения обладают антивоспалительными и антиканцерогенными свойствами. Они не только препятствуют развитию опухолей, но и усиливают действие противораковых лекарственных веществ, обладают в отношении клеток опухолей цитотоксическим действием.
Цель и основные задачи работы
Цель проведенных исследований заключается в установлении связи структуры и спектров флавоносодержащих соединений, а так же в проведении экспериментального и теоретического исследования спектральных свойств сложных систем природного происхождения.
Достижение поставленной цели предполагает решение следующих задач:
Расчеты равновесных электронных конфигураций молекул флавоноидов и их составных элементов методом функционала плотности.
Анализ влияния конформационных изменений и внутримолекулярной водородной связи на структуру и колебательные состояния исследуемых биомолекулярных систем.
Экспериментальная регистрация ИК-спектров кожуры лимона на различных стадиях хранения плода в естественных условиях.
Теоретическое моделирование ИК спектра кожуры лимона в рамках супермолекулярного подхода с использованием метода теории функционала плотности и его детальная теоретическая интерпретация.
Научная новизна работы
Построены квантовые модели большого числа флавоноидов природного происхождения и установлено влияние конформационной мобильности на их колебательные спектры.
Исследованы возможности ИК - спектроскопии для экспериментального обнаружения флавоноидов в сложных природных соединениях, а также для идентификации временных изменений в составе кожуры лимона при длительном хранении плода в естественных условиях.
Предложена детальная теоретическая интерпретация ИК-спектра кожуры лимона на основе трех моделей полимерных структур растительных волокон -целлюлозы, пектина и лигнина, одной модели гликозида флавоноида апигени-на, а также шестимолекулярной модели кластера воды.
Практическая значимость результатов
Полученные результаты и выводы относительно основных физико-химических свойств исследованных биомолекулярных соединений, особенностей их структуры и межмолекулярных взаимодействий, проявляющихся в колебательных спектрах, и апробированные при этом подходы к решению задач могут быть использованы в аналогичных исследованиях родственных биомолекулярных систем. Результаты молекулярного моделирования колебательного спектра кожуры лимона могут быть использованы при разработке методик определения срока хранения цитрусовых плодов с помощью спектроскопических методов.
Достоверность результатов диссертации
Достоверность результатов обеспечивается комплексным подходом к проведению исследований, сочетающим эксперимент и теорию, использованием физически корректных моделей, обоснованных методов и приближений, согласием теоретических и экспериментальных данных по колебательным спектрам. Достоверность полученных результатов также подтверждена отсутствием противоречий между ними и результатами, опубликованными другими авторами.
Основные результаты и положения, выносимые на защиту
Результаты расчетов равновесных электронных конфигураций и спектральных характеристик с учетом конформационной мобильности гидроксиль-ных групп ряда биомолекул флавоноидов и их составных элементов.
ИК спектры кожуры лимона, зарегистрированные в течении 30 дневного срока хранения плода в естественных условиях, показывают, что в колебательном спектре отражаются только процессы дегидратации кожуры.
Использование трех моделей полимерных структур растительных волокон – целлюлозы, пектина и лигнина, одной модели гликозида флавоноида апигенина и модели шестимолекулярного кластера воды является достаточным для моделирования и детальной интерпретации экспериментального ИК спектра кожуры лимона.
Апробация работы
Результаты диссертационной работы докладывались на следующих Российских и международных научных мероприятиях:
- Всероссийская молодежная научная конференция «Новые материалы и техно
логии: состояние вопроса и перспективы развития», 2014, Саратов, Россия.
«Молекулярное моделирование», 2009, Москва, Россия.
- XVI (2012), XVII (2013) Международные школы для студентов и молодых
учных по оптике, лазерной физике и биофотонике (Saratov Fall Meeting).
- Saratov Fall Meeting SFM-14 - Symposium Optics and Biophotonics-II
Публикации
Содержание и основные результаты диссертации отражены в 21 научных публикациях: 12 статьях, опубликованных в периодических изданиях, входящих в список ВАК, из которых 2 статьи опубликованы в периодических изданиях, цитируемых в базе дынных Scopus и 9 – в материалах научных мероприятий различного уровня.
Личный вклад соискателя
Личный вклад соискателя состоит в участии в постановке задач, в проведении всех экспериментальных исследований и моделировании исследуемых биомолекулярных систем, анализе и обработке полученных результатов с последующим их использованием для интерпретации зарегистрированных спектров.
Структура и объем диссертации
Методы исследования структуры и основных физико-химических свойств флавоносодержащих соединений
Во многих случаях нелокальная обменная энергия описывается локальным обменным функционалом. Такое упрощение приводит к погрешностям, для снижения которых включают в точный обменный оператор Хартри-Фока, рассматривая его как одну из моделей для описания обменной энергии. Такой способ дает значительный выигрыш в точности, особенно, если комбинировать его с некоторыми другими обменными функционалами.
Бекке сформулировал функционал, который представлял собой линейную комбинацию обменного функционала Хартри – Фока (HF) и обменно-корреляционного функционала теории функционала плотности (DFT) [78]. где cHF и cDFT некоторые константы. Среди гибридных функционалов наиболее известен B3LYP [79] – функционал, включающий три компоненты обменного функционала: точный обменный функционал Хартри - Фока, функционал Бекке, функционал Слэй-тера, а корреляционная часть представляет собой комбинацию функционалов Ли - Янга - Парра (LYP) и Воско-Уилка-Нусара (VWN). Особенностью этого подхода является то, что три обменные компоненты берутся с весовыми коэффициентами, подобранными на основе сравнения с экспериментальными данными. В результате подход приобретает черты полуэмпирического метода, но его точность в большинстве случаев значительно выше, чем в случае методологически чистых функционалов. VXBC3LYP [= VXLDA + c0(VxHF - VXLDA + cxAVxB8Q + VCVWN3 + cc(VcLYP - VCVWN3 ) (45)
Функционалы v$DA, vB88, vc7WiV3, vcLrp, EXB88, ECVWN3 определены выше. Обменный функционал Хартри - Фока имеет вид [80]: где – подобранный параметр для каждого атома Периодической таблицы, для большинства атомов = 0,70,8. c0, cx, cc – параметры, значения которых определяются путем подгонки энергий, потенциалов ионизации и сродства к протону: c0 = 0,20, cx = 0,72, cc = 0,81. Рассмотренный метод функционала плотности с использованием B3LYP функционала реализован в программном пакете GAUSSIAN. Для получения оптимальных результатов построения структурно-динамических моделей молекулярных систем необходимо выбирать функционал и базисный набор с учетом их особенностей [81,82].
В работе моделирование структуры и спектров исследуемых соединений проведено методом функционала плотности с использованием функционала B3LYP в базисах 6-31G(d) и 6-31G(d,p). 1.3.3. Метод теоретической колебательной спектроскопии
Для системы точек, совершающих малые гармонические колебания около положений равновесия, в обобщенных колебательных координатах xi (i = 1,2,...,n), определяющих выход системы из положения равновесия (для которого все xi =0), кинетическая и потенциальная энергии имеют вид [14]: = (47) V = п KijXiXJ 4 где Ту - постоянные, зависящие от масс частиц и геометрии равновесной конфигурации, а Кц- - постоянные потенциальной энергии, характеризующие силовую структуру молекулы (силовые постоянные). Стандартный метод решения состоит в применении уравнений Лагран-жа: Решая вековое уравнение (50), находят частоты колебаний. Форма векового уравнения неудобна тем, что все элементы определителя содержат неизвестную 2. Его можно привести к более удобному виду, в котором 2 будет входить только в диагональные элементы. Для этого умножают систему уравнений на коэффициенты Аи, удовлетворяющие условиям: n
АК-ш2Е = 0, где А, К, Е - соответственно матрицы кинематических коэффициентов, силовых постоянных и единичная. Матрица кинематических коэффициентов вычисляется по известным геометрическим параметрам и массам атомов. Процедура оптимизации геометрии подробно описана в работах [83-87]. Матрица силовых постоянных рассчитывается квантовомеханически.
При диагонализации матрицы векового определителя получается 3N-6 частот нормальных колебаний. Подстановка полученных значений в систему уравнений Лагранжа позволяет найти для каждой частоты собственный вектор (амплитуду нормального колебания), компонентами которого являются 3N-6 коэффициентов формы колебания, представляющих собой вклады отдельных естественных координат в нормальное колебание с данной частотой.
Интегральная интенсивность полосы поглощения ИК спектра, соответствующей нормальному колебанию, пропорциональна квадрату матричного элемента дипольного момента молекулы для данного перехода [14].
Рассчитанные частоты нормальных колебаний оказываются завышенными не более чем на 5%. Максимальные расхождения имеют место для частот валентных колебаний с участием атома водорода. Это расхождение обусловлено ограниченностью модели гармонического осциллятора и может быть устранено масштабированием силовых постоянных и частот [88-95].
Моделирование структуры и спектров -замещенных бензо--пирона
С другой стороны, можно рассматривать ГП в качестве заместителя в монозамещенных представителях бензола. Факт локального влияния такого замещения на силовое поле бензольного цикла известен. Подчеркнем, что речь идет о спектральном диапазоне выше 600 см-1, в котором и располагаются полосы, отнесенные к фундаментальным колебаниям циклических фрагментов - замещенных ГП. При этом различие в положении полос, отнесенных к деформационным колебаниям валентных углов шестичленных циклов, определяется кинематикой заместителя.
Представленные результаты построения структурно-динамических моделей замещенных гамма-пирона, сопоставление полученных данных теоретической и экспериментальной интерпретации спектра фундаментальных колебаний дают основание утверждать следующее: метод функционала плотности позволяет получить достоверные предсказательные оценки параметров адиабатического потенциала исследуемого класса соединений. Подтверждается предполагаемый факт локального влияния заместителей на силовое поле шестичленного цикла гамма-пирона при монозамещении, соблюдаются свойства характеристичности фундаментальных колебаний указанного цикла в диапазоне 1600-1000 см-1. Этот факт следует учитывать при построении структурно-динамических моделей замещенных бензо-гамма-пирона, в том числе флавона.
Интерпретация колебательных спектров биомолекул является одной из задач известной фундаментальной научной проблемы физики молекулярных соединений, получившей название «Структура-Спектр». Для флавоноидов [1], решение этой задачи связано с квантовыми модельными оценками параметров адиабатического потенциала (силовых постоянных молекулярных объектов), поскольку имеющиеся экспериментальные данные по колебательным (ИК и КР) спектрам ряда соединений этого класса [110-113] касаются, как правило, отдельных спектральных диапазонов.
Предлагаемая интерпретация носит предсказательный характер и требует обоснования ее достоверности. Особенно это касается интерпретации колебаний бициклического остова флавоноидов в диапазоне 1700-1000 см-1, поскольку здесь проявляются и полосы деформационных колебаний бензольного фрагмента соединения и деформационные колебания связей гидро-ксильных групп.
Для обоснования предсказательных возможностей квантовомеханиче-ских методов молекулярной динамики в интерпретации спектра фундаментальных колебаний флавоноидов нами был осуществлен сравнительный анализ экспериментальных и расчетных данных для характеристик полос гармонических колебаний бициклического фрагмента 1,4-нафтохинона, бензо гамма-пирона (рис.2) и ряда его -замещенных.
Модельные расчеты выполнены в рамках методики, предложенной в публикации [101] с использованием программного приложения [64].
В качестве заместителей атома водорода нами были выбраны следующие известные фрагменты: СH3, F, Cl, Br, NH2, NO2, HC=O. Такой выбор продиктован тем, что интерпретация фундаментальных колебаний указанных фрагментов считается устоявшейся, сами колебания являются характеристическими по форме, что позволяет их отделить от полос, отнесенных к колебаниям бициклического фрагмента.
Исходным этапом исследования являлась интерпретация колебательного спектра базовой молекулы – бензо-гамма-пирона. Предлагаемое отнесение сильных по интенсивности полос представлено в таблице 6, достоверность которого обосновывается хорошим совпадением с результатами теоретической интерпретации спектра фундаментальных колебаний 1,4-нафтохинона.
Интерпретация колебаний бициклического фрагмента в молекулах 1,4-нафтохинона и бензо-гамма-пирона ФК экс[108] 1,4-нафтохинона 6-311G 6-311+G БГП 6-311G 6-311+G выч ИК КР ИК КР выч ИК КР ИК КР 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Qc=o 1680 1675d 360 213 428 305 1681 344 57 424 90 Продолжение Таблицы Примечание. Индексами d помечены дублеты полос Налицо характеристичность колебаний по форме и частоте, а для ряда полос и по интенсивности в спектрах ИК и КР. Этот факт дает основание говорить, что замена атома углерода (С1) пиронового цикла на атом кислорода (О1) несущественно влияет на положение полос, отнесенных к колебаниям бициклического фрагмента. Различие в интенсивностях полос, характерное для колебаний связей кольца (Q), следует отнести к электродонорным свойствам атомов кислорода и углерода в пироновом цикле.
Отметим, что валентные колебания связей С=О в 1,4-нафтохиноне проявляются в виде дублета, представленного в таблице 6 в виде полосы усредненной частоты ( 10 см-1) и суммарной интенсивности в спектрах ИК и КР. Деформационные колебания связей С=О проявляются в диапазоне ниже 700 см-1. Они имеют слабую интенсивность и по этой причине в таблице 6 не представлены.
Подчеркнем и тот факт, что выбор базиса расчета (учет диффузионных параметров +G ) принципиального значения для данного класса бицикличе-ских соединений не имеет. При этом оценки ангармонического смещения частот хорошо согласуются между собой ( 20 см-1).
Согласно модельным расчетам образование димеров бензо-гамма-пирона не приводит к заметному смещению полос по отношению к мономеру (Таблица 7).
Максимальное расщепление полос имеет место для валентного колебания связи С=О ( 20 см-1), участвующей в образовании слабой водородной связи ( 2.26 ). Отметим только, что димер бензо-гамма-пирона обладает симметрией С2h и для него имеет место правило альтернативного запрета для интенсивностей в ИК и КР спектрах.
В таблице 8 предложена интерпретация колебаний бициклического фрагмента ряда -замещенных бензо-гамма-пирона. Приведенные расчетные значения положения полос являются усредненными данными. Отклонение от них для каждого заместителя не превышает величины 10 см-1, что позволяет выделить полосы, характеристические по частоте, форме колебаний и интенсивности в спектрах ИК и КР. Отметим ожидаемую согласованность данных для Cl и Br заместителей. Расхождение в положении полос валентных колебаний связей бициклического остова (Q,,) объясняется кинематическим эффектом (в первую очередь массой заместителя). Этим можно объяснить и расхождение полос деформационных колебаний в диапазонах 1400-1300 см-1 и 1000-900 см-1 (форма колебаний Q, и Q,). Проявляется кинематический эффект, связанный с различием в длинах связей С-Х и массах заместителя.
Моделирование структуры и спектров конформеров 3,4-дигидроксифла-вона
В таблице 27 на основании квантовых расчетов предложена интерпретация фундаментальных колебаний фрагмента кризина, состоящего из двух сопряженных шестичленных циклов. Слабые по интенсивности полосы, отделенные щелью размером более 20 см"1 от соседних полос, из рассмотрения исключены. Для спектральной идентификации конформеров можно использовать существенное различие в теоретической оценке интенсивности полос. Для конформеров К1 и К2 это полосы 1420, 780 и 750 см"1, для конформеров К3 и К4 к таковым следует отнести полосы 1210, 1190, 1140 см"1.
Поскольку имеющиеся экспериментальные данные по колебательным спектрам кризина весьма ограничены, то представленные данные по интерпретации спектра фундаментальных колебаний соединения надо рассматривать как исследование, носящее предсказательный характер. Поэтому представляет интерес результаты расчета в базисах, учитывающих диффузионные эффекты атомных орбиталей, например базис 6-311+G [64]. Проведенные модельные расчеты дали следующий результат: имеет место смещение полос, интерпретированных как крутильные колебания (хOH) гидроксильного фрагмента в длинноволновый диапазон. Для связи ОН, участвующей во внутримолекулярном взаимодействии (ОівНгв) указанное смещение оценивается величиной 30 см"1, для связи (О2оН29) оно достигает значения 40 см"1. Отметим, что аналогичная зависимость расчетного значения частоты крутильного колебания связи ОН от базиса имеет место, к примеру, для карбо-новых кислот. На интерпретацию колебательного спектра конформеров кризина выбор базиса не влияет, поскольку в диапазоне ниже 900 см"1 полосы, отнесенные к крутильным колебаниям связей ОН, на порядок отличаются по интенсивности от других полос указанного спектрального диапазона. 4.3 Моделирование структуры и спектра лютеолина
Моделирование геометрической структуры и спектра фундаментальных колебаний возможных конформеров лютеалина (Рис.8) проводилось в рамках метода функционала плотности DFT/b3LYP/6-311G [64].
Оптимизация геометрии лютеолина осуществлялась для всех 16-ти предполагаемых конформеров соединения, отличающихся друг от друга взаимным расположением гидроксильного фрагмента относительно атомов бензольного кольца и сопряженных шестичленных циклов. Для плоской конфигурации молекулы (симметрия Cs) не удалось воспроизвести низкочастотное крутильное колебание бензольного и сопряженного фрагментов относительно связи С2С1. Понижение симметрии позволило устранить указанный недостаток и оценить частоту крутильного колебания ( 30 см-1). Это достигается при величине двугранного угла между плоскостями фрагментов 15. При этом некомпланарностью бензольного и сопряженного фрагментов можно пренебречь, число возможных конформеров сокращается до 12-ти (не реализуются модели, когда связи фрагментов ОН в положениях 3и 4 направлены друг к другу). Смещение фундаментальных частот колебаний не превышает величины 10 см-1. Исключение составляют крутильные колебания ОН связей в диапазоне ниже 400 см-1 ( 25 см-1). Качественная оценка интенсивности полос сохраняется. Сказанное имеет место и при учете диффузионных параметров атомного базиса (6-311+G ) [64]. Этот факт дает основание при выявлении признаков спектральной идентификации представлять близкие полосы ( 15 см-1) одной полосой с усредненной частотой и суммарной интенсивностью.
Отметим и тот факт, что изменение геометрических параметров циклических фрагментов по сравнению с молекулами кризина и апигенина [103,122] не превосходит величины 0.01 для валентных связей и 1.5 для валентных углов. Сохраняются и закономерности в поведении валентных углов ССО для гидроксильных фрагментов [103,123]. Данный факт позволяет предположить, что влияние гидроксифрагмента на силовое поле шестичлен-ных циклов носит локальный характер.
Для решения задачи спектральной идентификации конформеров люте-олина примем во внимание, что может иметь место внутримолекулярное взаимодействие между гидроксильной группой в положении 5 (5-ОН) и фрагментом С4=О. Механизм взаимодействия - сильная водородная связь между атомом водорода связи 5-ОН и атомом кислорода фрагмента С4=О. Здесь полная аналогия с результатами модельных расчетов структуры и спектров кризина и апигенина [103,122]. Длина водородной связи 1.7 . Частота валентного колебания связи ОН смещается в длинноволновый диапазон на величину 600 см-1. В этот же частотный диапазон попадают и валентные колебания связей СН (3122-3083 см-1). Однако их суммарная интенсивность в ИК спектрах лютеолина на два порядка меньше. Частота крутильного колебания этой связи, наоборот, смещается в коротковолновый диапазон на величину 450 см-1. Характер поведения полос валентных и крутильных колебаний ОН фрагментов иллюстрируется результатами модельных расчетов, приведенными в таблице 28. Таблица 28 Интерпретация колебаний гидроксильных фрагментов конформеров лютеолина
Весь набор возможных конформеров делится на две группы, явным признаком спектральной идентификации которых является положение полос, интерпретированных как валентное и крутильное колебания связи 5-ОН. Первые шесть конформеров, в которых проявляется внутримолекулярное взаимодействие, отнесены к группе А. Цифры 0 и 1 в обозначении конфор-меров указывают на положение связей ОН относительно циклических фрагментов (против и по часовой стрелке соответственно).
Согласно данным таблицы 28, для ряда конформеров щель между полосами, отнесенным к крутильным колебаниям связей ОН, может достигать величины 100 см-1, что также можно использовать в задаче их спектральной идентификации.
Результаты теоретической интерпретации колебательных спектров конформеров лютеолина представлены в таблицах 29, 30. Из рассмотрения исключены полосы низкой интенсивности в ИК и КР спектрах, а также полосы, характеристичные по интенсивности (относительная к максимуму интенсивность для всех конформеров превышает значение 0.7). Для задачи спектральной идентификации конформеров соединения указанные полосы интереса не представляют. Выбор такого порогового значения продиктован тем, что при смене базиса расчета расчетные модельные значения интенсивностей не выйдут за его рамки.
Моделирование структуры и спектра кверцетина
Экспериментальные исследования проводились на ИК-Фурье спектрометре Frontier фирмы Perkin Elmer в диапазоне 650 см-1 – 3800 см-1. ИК-спектры были сняты на приставке НПВО. Для исследований была выбрана кожура лимона, выращенная в домашних условиях г. Астрахань (РФ).
При исследовании зависимости вида ИК спектра кожуры лимона от времени его хранения сам лимон хранился в закрытом от света шкафу в течении месяца дней при средней температуре 27С. ИК спектры верхних срезов кожуры регистрировались один раз в семь дней.
При исследовании зависимости вида ИК спектра кожуры лимона от степени ее искусственной дегидратации были зарегистрированы экспериментальные спектры свежего среза лимона и того же среза после 90 минутной сушки в сушильном шкафу ES-4620 фирмы (НПП Экрос) при температуре 60С.
При исследовании влияния на ИК спектр верхней окрашенной кожицы лимона был зарегистрирован спектр среза кожуры, который делался на глубине 100 мкм под поверхностным слоем.
Общие условия проведения экспериментов были следующие: толщина среза образца – 100 мкм, атмосферное давление – 762 мм.рт.ст., температура – 27С, относительная влажность – 72%, разрешение прибора – 4 см-1, режим – 32 scan.
Экспериментальные ИК спектры различных по глубине срезов кожуры лимона и в разных стадиях высушивания показаны на рис.11 и 12.
Как видно из рис.1 изменение глубины среза на 100 мкм не приводит к значимым изменениям колебательного ИК спектра, это говорит о том, что содержание пигментных флавоноидов, например, апигенина в верхней части кожицы лимона относительно низкое, чтобы оказать на спектр заметное влияние. Заметное ухудшение проявления полос в области 2800-3000 см-1, которые согласно проведенному моделированию образованы валентным колебания C-H связей на насыщенных углеродных кольцах полисахаридов и валентными колебаниями этих связей в CH2 группах можно объяснить большим содержанием воды в нижнем слое кожуры по сравнению с верхней кожицей. Это подтверждается при сравнении спектров одного и того же среза нижнего слоя при различных степенях дегидратации (см. рис. 2).
Как видно из рис.12 при искусственной дегидратации среза кожуры лимона в ИК спектре происходят следующие изменения: во-первых, происходит понижение интенсивности широкой полосы в области 3200 см-1, которая образована валентными колебаниями O-H связей молекул воды, а также всех других присутствующих в кожуре лимона соединений с гидроксильны 102
ми группами; во-вторых, несколько понижается интенсивность полосы поглощения в области 1630 см-1, куда так же попадают (деформационные) колебания воды и колебания связей C=C сопряженных углеродных циклов; в третьих, происходит рост интенсивностей полос поглощения в области 650-1500 см-1 и в области 2800-3000 см-1.
Такие изменения в ИК спектре можно объяснить следующим образом: o падение интенсивности полос в области 3200 см-1 и 1630 см-1 является следствием дегидратацией образца, т.е. уходом из него значительного количества свободной воды (проведенное взвешивание среза кожуры лимона до и после высушивания в течении 90 минут, показало, что за это время массовая доля образца уменьшается на 62%); o рост интенсивностей полос поглощения в области 650-1500 см-1 и полос в области 2900 см-1 обусловлен стягиванием и деформацией образца при сушки в результате которого увеличивается плотность вещества на единицу объема (проведенное измерение поперечных размеров среза кожуры лимона до и после высушивания показало, что стягивание образца составляет 23%).
Следует заметить, что повышение интенсивности полос поглощения при изменении плотности образца происходит по всему спектру, но при этом колебания молекул воды дают наибольший вклад в две полосы поглощения, а уход свободной воды является более значительным фактором чем изменение плотности образца, поэтому для этих двух полос наблюдается понижение интенсивности. Аналогичные изменения наблюдаются в ИК спектрах срезов кожуры при длительном хранении плода в естественных лабораторных условиях см. рис.3. На рис. 3 представлены экспериментальные ИК спектры верхних срезов кожуры лимона (свежего и после двухнедельного хранения), для наглядного сравнения на рис. 4 показаны ИК спектры верхних срезов до и после искусственной 90 минутной дегидратации. Как видно из рис.13 и 14, в обоих случаях, изменение ИК спектров носят очень сходный характер. Проведенная интервальная регистрация ИК спектров срезов кожуры лимона в течение 30 дней показала, что в колебательном спектре отражается только процессы последовательной дегидратации. Таким образом, можно заключить, что определять сроки хранения лимона в течение месяца с помощью ИК спектров кожуры возможно только по степени ее дегидратации (например, по отношению пиковых интенсивностей полос поглощения 1013 см-1 и 3200 см-1). Практическая реализация такой методики является непростой задачей, так как она требует учета многих факторов, как связанных с условиями хранения плодов (температура, влажность и др.), так и связанных с химической обработкой плодов, которые могут применяться для повышения сроков их хранения.
Для решения задачи связанной с интерпретации сложного колебательного ИК спектра кожуры лимона были построен и рассчитан ряд молекулярных моделей, включающих в себя модели пищевых волокон с учетом связанной воды, модель гликозида флавоноида апигенина и модель кластера свободной воды. Молекулярная структура и подробное описание построенных моделей приведены ниже.
В качестве модели полимерных молекул целлюлозы и гемицеллюлозы была построена модель из двух остатков Р-глюкозы в которых концевые соединительные C-O мостики были достроены до гидроксильных групп. Для учета молекулярного окружения (связанной воды) в модель были добавлены две молекулы воды, которые образовывали по две водородные связи с гидро-ксильными группами обоих колец. Структура модельного соединения цел 105 люлозы и гемицеллюлозы и его теоретический ИК спектр в области 650-3800 см-1 рассчитанный методом DFT/B3LYP/6-31G(d) показаны на рис.15, 16.
Модель полимерной молекулы пектина была построена из двух остатков галактуроновой кислоты в которых концевые соединительные C-O мостики были достроены до гидроксильных групп и на каждом кольце имелась одна метокси-группа. Для учета молекулярного окружения в модель были добавлены две молекулы воды, одна из которых образовывала водородные связи с гидроксильными группами, а вторая образовывала дополнительную водородную связь с атомом кислорода метокси-группы. Структура модельного соединения пектина и его теоретический ИК спектр в области 650-3800 см-1 рассчитанный методом DFT/B3LYP/6-31G(d) показаны на рис.7 и 8.