Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Конформационные особенности структур ДНК как мишень направленного поиска противоопухолевых препаратов . 10
Полиморфизм вторичной структуры ДНК 10
G-квадруплексы ДНК. 13
Противоопухолевая терапия . 24
Порфирины. 33
Глава 2. Методы исследования и технические средства решения задач . 42
Материалы. 42
Инструменты. 44
Методы. 45
Глава 3. Двойная спираль ДНК как мишень карбоксиметильных порфиринов и металлопорфиринов . 53
Аффинность производных порфирина к участкам двойной спирали ДНК
разного нуклеотидного состава. 53
Типы комплексов порфиринов с двойной спиралью ДНК 59
Флуоресцентные характеристики комплексов порфиринов P1 и P2 с ДНК
различной последовательности оснований. 62
Фоторазрушение двойной спирали ДНК. 67
Глава 4. Образование комплексов тетракарбоксиметильных порфиринов с G-квадруплексами ДНК 69
Изотермы адсорбции P1 и P2 на антипараллельном теломерном квадруплексе 69
Характеристка мест связывания Р1на TelQ по флуоресценции. 71
Изменение конформации квадруплексной структуры под действием модифицированных порфиринов. 73
Термостабильность теломерного квадруплекса в комплексе с модифицированными порфиринами. 76
Глава 5. Биологическая активность тетракарбоксиметильных порфиринов 78
Заключение 85
Результаты и выводы 86
Список работ, опубликованных по теме диссертации 87
Тезисы докладов на научных конференциях 87
Литература 90
- Противоопухолевая терапия
- Типы комплексов порфиринов с двойной спиралью ДНК
- Изменение конформации квадруплексной структуры под действием модифицированных порфиринов.
- Список работ, опубликованных по теме диссертации
Противоопухолевая терапия
Полиморфизм вторичной структуры ДНК. Генетическая информация организмов хранится в молекуле двухнитевой ДНК. Молекула полинуклеотида образована двумя комплементарными нитями, состоящими из четырех чередующихся азотистых оснований: аденин (А), тимин (Т), гуанин (G) и цитозин (C). Трехбуквенный код последовательности нуклеотидов обеспечивает ДНК способность хранить, передавать наследственные признаки из поколения в поколение и реализовывать генетическую программу функционирования живых организмов. Комплементарность позволяет исправлять ошибки, возникающие в процессе репликации ДНК.
В начале 50х годов 20 века начались исследования, давшие представления о структуре ДНК и механизмах ее биологической функции. Была получена рентгенограмма волокон B-формы ДНК, сыгравшая ключевую роль в определении структуры ДНК [47]. Крестообразное расположение дифракционных пятен служило прямым указанием на структуру в виде спирали (рис 1.1). Розалинд Франклин удалось обнаружить, что в зависимости от влажности в камере, в которой вытягивались волокна ДНК, можно получать две различные структуры ДНК: A-форму и B-форму [47]. Дальнейший анализ данных позволил сделать вывод, что спираль ДНК состоит из двух нитей, в которой фосфатные группы располагаются снаружи, а основания внутри спирали, также был определен шаг спирали (3.4 нм) и её периодичность (10 пар на виток). Рисунок 1.1. Рентгенограмма волокон натриевой соли тимусной ДНК в B-форме [47]
Дж. Уотсон и Ф. Крик определили тип образующихся пар нуклеотидов и построили модель правозакрученной двойной спирали ДНК. Структура двойной спирали ДНК определяется в значительной степени наличием водородных связей, стабилизирующих взаимодействие между двумя нитями ДНК при образовании пар нуклеотидов, которые связывают одну комплементарную нить с другой (рис 1.2).
Альтернативные структуры формируются главным образом определенной нуклеотидной последовательностью ДНК, которая, как правило, имеет повторяющийся мотив. Такие повторяющиеся элементы расположены в функционально важных областях различных геномов, указывая на возможное биологическое значение этих структур [99].
В последнее время исследования показали, что простые повторяющиеся последовательности ДНК, способные образовывать альтернативные структуры ДНК, являются мутагенными. Мутагенез участков ДНК связан именно с конформацией нуклеиновых кислот, а не с последовательностью ДНК как таковой в канонической, правой спирали, В-формы.
Генетические последствия неканонических структур обнаружены примерно в двадцати неврологических заболеваниях человека. Обнаружено около пятидесяти геномных нарушений, вызванных обширными делециями, инверсиями, дублированием и транслокациями. Показано, что несколько психических заболеваний сопровождаются полиморфизмом в простых повторяющихся последовательностях. По данным биохимических и геномных исследований сформулирована новая парадигма, которая объясняет связь появления альтернативных структур ДНК и возникновение заболеваний [144].
Возможность наблюдения альтернативных структур ДНК в растворе позволяет получить физико-химические и структурные характеристики ДНК, определить стабильность и обнаружить конформационные переходы между различными структурами ДНК. Так, охарактеризована структура А-формы ДНК в растворе, а также установлены условия перехода между А-, В-, и С-формами двойной спирали ДНК [68; 69; 91; 98]. G-квадруплексы ДНК. Более четырех десятилетий до того, как Дж. Уотсон и Фр. Крик предложили свою структуру ДНК, немецкий химик Ивар Банг обнаружил, что гуаниловая кислота в миллимолярных концентрациях образует гели [13]. Это необычное физическое свойство озадачивало исследователей в течение следующих 50 лет, до тех пор, пока Мартин Геллерт с коллегами получили данные рентгеновской дифракции на волокнах гуаниловой кислоты [51]. Они открыли самосборку тетрамерных единиц в большие спиральные структуры, которые обладали гелеобразными свойствами в водном растворе. Четыре молекулы гуаниловой кислоты образовывали квадратную плоскую структуру, в которой каждое из четырех оснований является и донором, и акцептором двух водородных связей (в настоящее время такая структура называется G-квартет) (рис. 1.4). G-квартеты образованы четырьмя основаниями гуанина, расположенными в квадратной плоской циклической структуре и стабилизированы водородными связями, а кислороды карбонильных групп гуанинов могут координировать катионы металлов. Рисунок 1.4. Структура гуанинового квартета, в котором каждый гуанин выступает в качестве донора и акцептора двух водородных связей. В центре показан координированный катион метала М+ [20]
G-квартеты ДНК могут образовываться как посредством межмолекулярных, так и внутримолекулярных взаимодействий G-богатых нитей нуклеиновых кислот. Образовавшиеся G-квартеты формируют стопки, лежащие в основе вторичной структуры, называемой G-квадруплексом (Рис. 1.5). Конформация G-квадруплекса полиморфна [110; 112]. Структура G-квадруплекса может формироваться взаимодействиями четырех G-богатых нитей ДНК (Рис. 1.5а), а также ассоциированием двух G-богатых шпилек (Рис. 1.5б). Внутримолекулярные G-квадруплексы образуются однонитевой ДНК, последовательность которой имеет чередующиеся G-блоки (Рис. 1.5в-е).
Типы комплексов порфиринов с двойной спиралью ДНК
В последнее время стало появляться все больше работ показывающих, что богатые гуанинами последовательности, способные образовывать G-квадруплексные структуры, широко распространены по геному. В общем виде всё разнообразие G-богатых последовательностей можно описать выражением: G3NxG3NxG3NxG3. Методами биоинформатики выявлено распределение G-богатых последовательностей в различных геномах [39; 62]. Большое количество этих последовательностей найдено в геноме человека: более 350 тысяч мотивов с длиной петель 1-7 нуклеотидов, и более 700 тысяч с петлями до 12 нуклеотидов в длину. Наблюдается неравномерное распределение последовательности по хромосомам, в некоторых хромосомных доменах, геномных областях, а также в генах.
Неизвестно, образуется ли квадруплексная структура каждым G-богатым участком ДНК, найденным в геноме. Тем не менее, эти последовательности имеют значительный потенциал для формирования различных структур, образование и разрушение которых может коррелировать с конкретными биологическими функциями [89].
В 1961 году американский геронтолог Л. Хейфлик установил, что человеческие фибробласты – клетки кожи, способные к делению, – «в пробирке» могут делиться не более 50 раз [60]. В честь первооткрывателя это явление назвали «пределом Хейфлика». В 1971 г. А.М. Оловников, предложил гипотезу, по которой «предел Хейфлика» объясняется тем, что при каждом клеточном делении хромосомы немного укорачиваются. У хромосом имеются особые концевые участки – теломеры, которые после каждого удвоения хромосом становятся немного короче, и в какой-то момент укорачиваются настолько, что клетка уже не может делиться. По мнению А.М. Оловникова, при матричном синтезе полинуклеотидов ДНК-полимераза не в состоянии полностью воспроизвести линейную матрицу, реплика получается всегда короче в ее начальной части. Таким образом, при каждом делении клетки ее ДНК укорачивается, что ограничивает пролиферативный потенциал клеток и, очевидно, является «счетчиком» количества делений и, соответственно, продолжительности жизни клетки [8; 10].
Одним из основных участников работы механизма «биологических часов» является фермент теломераза, отвечающий за удлинение теломерного окончания хромосом. Теломерный участок ДНК различных организмов имеет компактную упаковку, стабильность которой поддерживают G-квадруплексы. Кроме того, существует взаимосвязь между формированием G-квадруплекса теломерным участком ДНК и функционированием теломеразы. Длина теломерного участка хромосом напрямую связана со стабильностью генома и старением клетки, т.е. количеством её возможных делений. Поддержание стабильности длины теломер заключается в добавлении теломерных повторов к теломерному участку. Активация фермента теломеразы сопряжена с изменениями, приводящими к образованию злокачественной опухоли [80]. Прошло более десятилетия, прежде чем эту догадку подтвердила серия открытий, сделанных в конце 1980-х годов тремя учеными: Элизабет Блэкберн, Джеком Шостаком и Кэрол Грейдер. За работу «Открытие механизмов защиты хромосом теломерами и фермента теломеразы» они были удостоены Нобелевской премии в области физиологии и медицины в 2009 г.
В последнее время большой интерес вызывает изучение влияния образования G-квадруплексов на стабильность длины теломерного участка [95]. Исследование стабилизации теломерных участков ДНК открывает новый перспективный метод лечения онкологических заболеваний, основанный на использовании агентов, имеющих высокую селективность к G-квадруплексам теломер и стабилизирующих их структуру, ингибируя при этом функцию теломеразы [118; 133].
Заметным богатством G-квадруплексного мотива отличаются промоторы генов, что указывает на возможность их участия в регуляции транскрипции [38; 62]. Набор регуляторных элементов перед гомологичными генами обычно сохраняется, изменению в редких случаях подвергается только их локализация и иногда порядок расположения [42; 90]. Локализация G-богатых мотивов в регуляторных элементах экспрессии генов подтверждает, что образование G-квадруплексов может влиять на работу функциональных областей ДНК, воздействуя на её структуру. Анализ генома с эволюционной точки зрения дает возможность полагать, что появление и накопление предшественников и канонических мотивов в пределах регуляторных областей генов закрепилось путем естественного отбора. Наличие G-богатых последовательностей в промоторных участках генов, например гена c-Myc, может приводить к ингибированию его экспрессии при стабилизации структуры G-квадруплекса [128]. Мутации, дестабилизирующие G-квадруплекс в промоторе c-Myc, увеличивают его транскрипционную активность в 3 раза [127].
Изучение динамики образования G-квадруплексов в промоторных участках онкогенов, а также в теломерных областях хромосом поможет застопорить бесконтрольное деление раковых клеток, что приведет к их программируемой гибели. Накапливаются данные о роли квадруплексных структур ДНК в теломерных областях хромосом, в промоторах генов и особенно онкогенов, а также об их потенциале в качестве мишеней действия лекарственных препаратов [12].
Выявление регуляторной функции G-квадруплексов, входящих в состав сайтов связывания трансляционных факторов, открывает новые перспективы для медицины и фармацевтики [16]. Однако, изучение механизмов стабилизации этой молекулярной структуры однонитевой ДНК, а также влияние ее образования или разрушения на транскрипцию генов, стабильность генома, продолжительность жизни клетки и организма в целом имеет фундаментальное значение. Выявление физико-химических характеристик взаимодействия низкомолекулярных соединений с G-квадруплексами открывает перспективы для направленного синтеза новых лекарственных соединений.
Изменение конформации квадруплексной структуры под действием модифицированных порфиринов.
Для выяснения природы тушения и разгорания флуоресценции порфиринов при взаимодействии с ДНК различного нуклеотидного состава изучена кинетика затухания флуоресценции (рис. 3.8). Условия эксперимента были подобраны так, что концентрация адсорбированного лиганда соответствовала среднему заполнению r=0.04-0.05, при этом концентрация свободного лиганда не превышала 2% для P1.
Характеристика кривых затухания флуоресценции получена деконволюцией экспериментальных кривых и аппроксимацией одно- или двух-экспоненциальным уравнением затухания. Рассчитанные времена затухания флуоресценции первой и второй компоненты (г? и т2) и доли этих компонент (а і и аг), зависящие от концентрации флуоресцирующих молекул каждой компоненты, приведены в таблице 3.3. Для сравнения с квантовым выходом флуоресценции (q/q0) в таблице 3.3 дополнительно приведены значения т/т0 этих комплексов, рассчитанные относительно т0 свободного лиганда в растворе.
Времена жизни возбужденных состояний свободных молекул P1 и P2 различаются в пределах ошибки эксперимента, го=4.8±0.1 нс и го=4.6±0.1 нс, соответственно и соответствуют определенным выше абсолютным квантовым выходам флоуресцении молекул в растворе.
Кривые затухания флуоресценции порфиринов, адсорбированных на АТ-дуплексе, хорошо описываются одной экспонентой, но г увеличивается приблизительно в два раза относительно т0 свободных молекул порфиринов, и соответствует 10±0.2 нс для порфирина P1 и 8.6±0.1 нс для порфирина P2. Возрастание времени жизни флуоресценции в два раза коррелирует с увеличением квантового выхода флуоресценции и объясняется ограничением колебательных степеней свободы адсорбированных флуорофорофоров и их экранированием от молекул воды.
Кривые затухания флуоресценции комплексов порфиринов с GC-дуплексом хорошо описываются двухэкспоненциальным уравнением. Время затухания короткоживущей компоненты комплексов порфиринов P1 и P2 с GC-дуплексом равно 1P1=0.7±0.1 нс и 1P2=0.6±0.1 нс, соответственно, и характеризуется высоким весовым коэффициентом содержания короткоживущей компоненты (60-65%). Время жизни долгоживущей компоненты затухания флуоресценции (2) порфиринов P1 и P2, адсорбированных на GC-дуплексе (5.3 нс и 4.2 нс, соответственно), близко к о свободных лигандов в растворе. Появление короткоживущей компоненты не противоречит модели интеркаляционного комплекса с переносом заряда между GC-парой и интеркалированным порфирином.
Кривые затухания флуоресценции порфиринов при взаимодействии с ДНК тимуса теленка характеризуются наличием двух типов комплексов. Одна компонента имеет короткоживущее время жизни флуоресценции (0.7 и 0.6 нс, соответственно), что не противоречит взаимодействию лиганда с GC -участками ДНК и образованию комплекса с переносом заряда. Долгоживущие компоненты кривых затухания флуоресценции порфиринов P1 и P2 на ctDNA характеризуются временем жизни флуоресценции 2P1=10 нс и 2P2=8 нс, соответственно и совпадают со временем жизни флуоресценции комплексов порфиринов с АТ-дуплексом (см. Табл. 3.3). Несмотря на то, что вероятность тандемного расположения GC богатых участков относительно мала, более высокая константа связывания именно с такими участками объясняет примерно одинаковый вес двух компонентов комплексов на ctDNA.
Таким образом, флуоресцентные характеристики порфиринов различаются при связывании с участками ДНК различной последовательности, что определяет гетерогенный тип связывания порфиринов с ДНК смешанной последовательности. Фоторазрушение двойной спирали ДНК.
Поскольку исследуемые соединения являются перспективными для ФДТ, ключевую роль в ней играют активные формы кислорода. По деградации 1,3-дифенилизобензофурана (DPBF) определена генерация модифицированными соединениями активных форм кислорода. На рис. 3.9 представлены нормированные кривые фото деградации DPBF. Раствор ДМСО, содержащий DPBF (25 мкМ) и порфирин (1 мкМ) облучали в течение 20 мин белым светом с использованием галогенной лампы. Характерное время деградации DPBF () определено аппроксимацией экспериментальных зависимостей уравнением ABS=e , где ABS - поглощение DPBF при облучении образца в течение времени . Таблица 5 характеризует способность соединений разрушать DPBF. Явным преимуществом обладают P1 и ZnP1.
Так как ДНК является одной из мишеней для соединения P1 и его металлических модификаций, была изучена возможность фотодинамического повреждения двойной спирали ДНК. Фотоповреждение ДНК изучили на кольцевой замкнутаой ДНК (плазмида pBR322). Несмотря на сравнимую способность соединений P1 и ZnP1 генерировать синглетный кислород, оказалось, что эти соединения качественно по-разному разрушают ДНК под действием света (Рис.23).
В растворе плазмида находится в суперскрученной форме. При повреждении одной из нитей плазмида релаксирует и переходит в кольцевую форму. При повреждении обеих нитей ДНК плазмида переходит в линейную форму. После освещения образцов плазмиды в течение часа в присутствии порфиринов подвижность плазмиды изменяется (Рис.3.10).
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Поскольку расщепление белка PARP каспазами на ранней стадии апоптоза приводит к тому, что ДНК-связывающий домен отделяется от каталитического, то происходит инактивация фермента, т.е. он перестает выполнять функцию репарации. ДНК-связывающий фрагмент, образуя комплекс с межнуклеосомной ДНК, препятствует доступу ферментов репарации к участку повреждения. Достоверным подтверждением апоптотической гибели клеток является рост концентрации инактивированной, расщепленной формы белка PARP, которая показана на линии клеток HeLa (рис. 5.3). Таким образом показано, что имеет место отложенная фрагментация ДНК, характерная для апоптотического пути гибели клеток.
Выявление механизма гибели лпухолевых клеток.
В связи с тем, что ZnP1 проявляет наиболее выраженную активность, методом проточной цитофлуориметрии была определена концентрационная зависимость типа гибели клеток линии HeLa. Для чего были выбранны концентрации соединения 10, 25 и 50 мкМ. Время инкубации клеток с соединением 1 час, время освещения 20 минут. Фотографии клеток получены фазовоконтрастной микроскопией (рис 5.4): A) сразу после облучения белым светом в течение 20 минут, Б) темновой контроль сразу после инкубации с соединением ZnP1 в течение 1ч, В) через сутки после облучения белым светом, Г) темновой контроль через сутки после инкубации с соединением ZnP1. Фотографии клеток показывают изменение морфологии под дейсвтием порфирина ZnP1. Видно, что большие концентрации соединения вызывают изменение формы клеток как под дейсвтием света, так и в темновом контроле. Однако, следует отметить, что морфологические изменения клеток, облученных белым светом, через сутки после облучения сохраняются, в отличие от темнового контроля, в котором форма клеток практически полностью восстановилась. Для исследования механизмов гибели клеток была определена доля клеток гибнущих по апоптотическому и некротическому пути. mkM ZnPl
Фазовоконтрастная микроскопия клеток Hela, обработанных соединением ZnP1: A) сразу после облучения белым светом в течение 20 минут, Б) темновой контроль сразу после инкубации с соединением ZnP1 в течение 1ч, В) через сутки после облучения белым светом, Г) темновой контроль через сутки после инкубации с соединением ZnP1. 100 оля клеток, % а 100 оля клеток,
Дифференцирование типа гибели клеток определяли по степени одновременного прокрашивания клеток анексином-V и пропидием иодидом [154]. По специфическому связыванию анексина V/FITC с фосфотидилсерином, который появляется на поверхности апототических клеток, определяли ранний апоптоз. По окрашиванию пропидий иодидом определяли наличие клеток с поврежденной мембраной, через которую проникает пропидий и окрашивает ДНК. Такой тип клеток можно отнести к клеткам поздних стадий апаптоза или некротических клеток. Обнаружена прямая зависимость гибели клеток от концентрации соединения (рис.5.5). Следует отметить, что доля неповрежденных клеток (белые столбики) после освещения клеток значительно меньше, чем без освещения. После действия света, для уменьшения неповрежденных клеток в 2 раза необходимо менее 10 мкМ порфирина ZnP1, в то время как без освещения - около 50 мкМ. Полученные данные согласуются с результатами МТТ теста на разных клеточных линиях без освещения клеток. Без облучения светом клеточная гибель характеризуется главным образом повреждением клеточной мембраны. Напротив, после облучения светом наблюдалась значительная доля клеток, проявляющих апоптотическую гибель. При высоких концентрациях соединения ZnP1 доля аппоптотических клеток, прокрашенных только анексином V/FITC достигает 60%.
Обобщая полученные результаты можно сказать, что порфириновые соединения, взаимодействуя с ДНК, под действием света вызывают повреждения ДНК, вызывая апоптотический путь клеточной гибели. Заключение
Определены механизмы взаимодействия карбокисметильных производных порфирина Р1 и Р2, а также производных, содержащих в макроцикле цинк (ZnP1) или никель (NiP1). Получены качественные и количественные параметры взаимодействия и охарактеризованы спектральные параметры порфринов изменяющиеся при связывании с ДНК.
Порфрирны Р1 и Р2 интеркалируют преимущественно между GC парами ДНК, и связываются в малую бороздку двойной спирали в АТ-богатых участках. Введение ионов металла в макроцикл карбоксиметильных порфиринов определяют различные механизмы их взаимодействия с двойной и четверной спиралями ДНК. Соединение NiP1 взаимодействует с двойной спиралью по типу интеркаляции, в то время как ZnP1 образует преимущественно комплекс в малой бороздке ДНК. Порфририн ZnP1 образует комплекс с петлей теломерного квадруплекса и не искажает структуру квадруплекса. Связывание порфирина NiP1 с теломерным квадруплексом приводит к его разрушению и образованию несовершенной двуспиральной шпильки ДНК.
Соединение ZnP1 оказалось наиболее эффективным в фоторазрушении двойной спирали ДНК, причем его эффективность обусловлена механизмом связывания в бороздку ДНК, при средней для изученных соединений способности генерировать активные формы кислорода.
Показано, что повреждение клеток под действием света в присутствие порфринов Р1 и ZnP1 ведет клетку к гибели преимущественно по апоптотическому пути. В отсутствие света изученные порфирины являются малотоксичными, и клетки восстанавливаются после их действия с помощью репарационных процессов. Соединение ZnP1 предложено как наиболее перспективное для применения в фотодинамической терапии.
