Взаимодействие эритроцитов в средах, индуцирующих их агрегацию: исследование с помощью лазерных пинцетов Ли Кисун

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 12

1.1. Определение агрегации эритроцитов 12

1.1.1. История открытия агрегации эритроцитов 13

1.1.2. Физиологическая роль агрегации эритроцитов 14

1.1.3. Агрегация эритроцитов при патологии 15

1.2. Факторы, изменяющие параметры агрегации эритроцитов 16

1.2.1. Факторы среды в агрегации эритроцитов: макромолекулы как проагреганты и ингибиторы агрегации 17

1.2.2. Факторы клетки в агрегации эритроцитов. «агрегируемость» эритроцитов 19

1.2.3. Другие факторы, влияющие на агрегацию эритроцитов 21

1.3. Методы изучения агрегации эритроцитов 23

1.3.1. Оптическая агрегометерия 24

1.3.2. Методы и результаты изучения агрегации эритроцитов на уровне индивидуальных клеток 27

1.3.3. Использование лазерных пинцетов для изучения агрегации эритроцитов 32

1.4. Гипотетические модели механизмов взаимодействия эритроцитов 38

1.4.1 Модель «мостиков» 39

1.4.2 Модель «обедненного слоя» 41

Глава 2. Материалы и методы 45

2.1 Материалы 45

2.1.1 Выбор растворов и крови 45

2.1.2 Подготовка образца 46

2.2 Лазерный пинцет 48

2.2.1 Калибровка лазерного пинцета 50

2.2.2 Принцип измерения сил взаимодействия между эритроцитами с помощью лазерного пинцета 51

2.2.3 Обработка данных 53

2.3 Сравнение измерений агрегации эритроцитов в образцах цельной крови и на

индивидуальных клетках 54

Глава 3. Измерение параметров агрегации эритроцитов с помощью лазерного пинцета 56

3.1 Измерение параметров спонтанной агрегации эритроцитов 56

3.2 Измерение параметров дезагрегации эритроцитов (прочности агрегатов) 60

3.3 Сравнение параметров агрегации и дезагрегации эритроцитов, измеренных на образцах цельной крови и на индивидуальных клетках 66

Заключение по главе 3 68

Глава 4. Механизм взаимодействия эритроцитов при их агрегации 69

4.1. Модель «подвижных мостиков» 70

4.2 Оценка энергии взаимодействия эритроцитов с помощью лазерного пинцета 71

4.3 Заключение по главе 4 75

Результаты и выводы

Благодарности

Список использованной литературы

• История открытия агрегации эритроцитов
• Гипотетические модели механизмов взаимодействия эритроцитов
• Принцип измерения сил взаимодействия между эритроцитами с помощью лазерного пинцета
• Сравнение параметров агрегации и дезагрегации эритроцитов, измеренных на образцах цельной крови и на индивидуальных клетках

Введение к работе

Актуальность работы

Способность к агрегации является одним из важнейших свойств эритроцитов. Агрегация эритроцитов (АЭ) – это обратимый процесс образования агрегатов эритроцитов. АЭ в значительной мере определяет вязкость крови при низких сдвиговых напряжениях, и, как следствие, ее микроциркуляцию и эффективность доставки кислорода к тканям. Поэтому исследование АЭ является важной задачей реологии крови.

Исследования АЭ интенсивно проводятся на протяжении нескольких последних десятилетий. В основном АЭ изучается в условиях in vitro. Эксперименты по ее изучению в условиях in vivo сложны в реализации и мало распространены. В большинстве случаев исследования АЭ проводят с помощью анализа сигнала светорассеяния от образца крови в покое или в условиях сдвигового потока и анализа микроскопных изображений.

АЭ наблюдается только при наличии в окружающей среде макромолекул плазмы крови, среди которых основную роль играет белок фибриноген, или некоторых других макромолекул, например, декстранов высокой молекулярной массы. Степень АЭ зависит от концентрации этих макромолекул. Роль белков плазмы крови при АЭ подтверждается корреляцией измеряемых параметров АЭ с концентрацией белков. Однако до сих пор остается неясным вопрос о том, как именно белки участвуют в АЭ.

В экспериментах с использованием растворов отдельных белков для индуцирования АЭ наблюдается синергетический эффект разных белков плазмы крови, например, альбумина с фибриногеном или -глобулином. Альбумин, не индуцирующий АЭ отдельно от других белков, в значительной степени изменяет ее в присутствии фибриногена или -глобулина. Синергетическое влияние на АЭ наблюдается и для неплазменных макромолекул.

Известно, что процесс АЭ зависит также от свойств самих эритроцитов. Способность эритроцитов к агрегации называют агрегируемостью эритроцитов. Для разделения вклада среды (плазмы) и свойств самих эритроцитов характеристики агрегации изучают в модельных растворах нейтральных макромолекул. Знание агрегируемости эритроцитов особенно важно при патологических состояниях. Агрегируемость эритроцитов может значительно изменяться при патологиях, в то время как АЭ в плазме может практически не

изменится. Таким образом, агрегируемость эритроцитов служит индикатором изменений свойств самих эритроцитов.

Наиболее широко АЭ изучена в растворах синтетических нейтральных макромолекул. Для описания взаимодействия эритроцитов при агрегации в растворах макромолекул используют две модели. Первая - модель «мостиков» («cross-bridges») - описывает взаимодействие эритроцитов образованием связей между ними за счет адсорбции макромолекул на мембранах соседних клеток. Агрегация происходит за счет сил связывания макромолекул. Вторая - модель «обедненного слоя» («depletion layer») - описывает прижимание эритроцитов друг к другу за счет возникающих осмотических сил (осмотического давления).

Эти модели все еще не получили согласованную экспериментальную проверку. Более того, остается неизвестной применимость разработанных моделей для нативной среды (плазмы). Таким образом, до сих пор нет модели, которая полностью описывала бы взаимодействие клеток при их агрегации. Отсутствие такой модели в большой степени связано с недостатком ключевых экспериментальных данных, которые можно получить только прямым измерением параметров взаимодействия эритроцитов.

Лазерный пинцет является одним из тех средств, которые могут быть использованы для получения необходимых экспериментальных данных. Изобретение лазерного пинцета (ЛП) способствовало прорыву в исследованиях в области биофизики. Появилась возможность измерять силы взаимодействия отдельных клеток и макромолекул с точностью до долей пиконьютонов (пН). В ряде работ ЛП использовался для изучения взаимодействия эритроцитов при их агрегации. Были получены данные о динамике взаимодействия клеток, которые до этого были неизвестны. Тем не менее, систематического изучения агрегации эритроцитов данным методом еще не проводилось.

Таким образом, к началу выполнения диссертационной работы не были до конца изучены механизмы взаимодействия эритроцитов при их агрегации в таких близких к нативным средах, как плазма и сыворотка крови, растворы белков крови. Не ясна была роль отдельных белков и их комплексов в АЭ. Не существовало данных сравнения агрегации эритроцитов в модельных растворах нейтральных макромолекул и в нативных средах.

Диссертационная работа посвящена изучению биофизики взаимодействия эритроцитов в процессе их обратимой агрегации. Параметры, характеризующие взаимодействие эритроцитов при их агрегации между собой, измерялись с помощью лазерных пинцетов in vitro.

В данной работе ЛП использован для систематического изучения взаимодействия эритроцитов при их агрегации и дезагрегации в зависимости от состава среды, в которой находятся клетки. Измерения сил взаимодействия были проведены в аутологичной плазме и сыворотке крови, в модельных растворах белков плазмы крови (фибриногена и альбумина) и нейтральных макромолекул (декстрана с м.м. 500 кДа и 70 кДа). Проведен анализ результатов измерения, сделана оценка их согласованности с существующими моделями взаимодействия эритроцитов. Было развито представление о взаимодействии эритроцитов при их агрегации посредством образования подвижных мостиков.

Целью работы является изучение механизмов взаимодействия отдельных эритроцитов при их агрегации и дезагрегации с использованием лазерных пинцетов и выявление роли отдельных макромолекул среды в этом процессе.

Достоверность, полученных в работе результатов подтверждается их
согласованностью с данными экспериментов, проведенных в нашей

лаборатории с помощью других методов изучения АЭ; соответствием
результатов теоретическим оценкам, приведенным как в литературе, так и в
диссертационной работе; соответствием экспериментальных результатов с
данными, опубликованными в работах других авторов. Результаты

исследований были апробированы и представлены более, чем на десяти
международных конференциях, обсуждены на нескольких профильных
семинарах. Результаты диссертационной работы опубликованы в

рецензируемых журналах из списка ВАК. Представленные результаты являются новыми и получены впервые.

Научная новизна работы

Разработана новая методика измерения с помощью лазерных пинцетов силы взаимодействия между двумя эритроцитами при их агрегации в различных средах: растворах белков плазмы крови и нейтральных макромолекул (декстранов), а также в цельной плазме и сыворотке крови. При этом:

1. Впервые обнаружено значительное отличие между силой, развиваемой при спонтанной агрегации пары эритроцитов, и силой, необходимой для дезагрегации парного агрегата эритроцитов, при разных составах окружающей среды.

2. Предложена новая гипотетическая модель для описания полученных экспериментальных данных по взаимодействию пары эритроцитов при их агрегации в различных растворах.

3. Впервые сделано сравнение параметров процесса агрегации эритроцитов, измеренных в образцах цельной крови и на уровне отдельных клеток.

4. Впервые проведено исследование зависимости динамики взаимодействия пары эритроцитов в различных растворах от длительности и площади их взаимодействия. Показаны особенности взаимодействия, характерные для различных растворов.

Научная и практическая значимость

Применение разработанной методики измерения сил взаимодействия эритроцитов человека с помощью лазерных пинцетов позволит продвинуться в исследовании биофизических механизмов агрегации эритроцитов как в норме, так и при различных заболеваниях.

1. Разработанная методика измерения сил взаимодействия эритроцитов может быть применена для исследования физических закономерностей взаимодействия других живых клеток.

2. Разработанная методика измерения сил взаимодействия эритроцитов может быть эффективно использованы для исследования связи микрореологических свойств эритроцитов с параметрами микроциркуляции крови человека и малых лабораторных животных в норме и при различных патологиях.

3.Полученные в работе новые данные о характере взаимодействия эритроцитов на уровне одиночных клеток могут быть использованы для разработки новых биофизических моделей взаимодействия живых клеток.

Положения, выносимые на защиту

3. Спонтанная агрегация двух одиночных эритроцитов с образованием парного агрегата не происходит в растворах, содержащих только молекулы альбумина или только молекулы фибриногена вплоть до концентрации двойне превышающей физиологическую норму.

4. Значительная роль фибриногена в процессе спонтанной агрегации эритроцитов проявляется только в совокупности с другими компонентами крови.

5. Спонтанная агрегация эритроцитов (САЭ) и дезагрегация эритроцитов (ДАЭ) в плазме не являются абсолютно обратными процессами. Сила взаимодействия эритроцитов при САЭ уменьшается пропорционально площади взаимодействия эритроцитов. При ДАЭ она, напротив, возрастает по мере разделения клеток.

6. Процесс взаимодействия клеток в плазме и сыворотке отличается от того, что наблюдается в модельных растворах нейтральных макромолекул. В растворах нейтральных макромолекул силы взаимодействия клеток как при спонтанной

агрегации, так и при дезагрегации уменьшаются пропорционально площади взаимодействия.

5. Модель «подвижных мостиков» применима для описания взаимодействия эритроцитов в плазме. Возрастание энергии взаимодействия клеток по мере их разделения описывается подвижностью связей (мостиков) и их аккумуляцией.

6. Энергия взаимодействия эритроцитов в растворе декстрана остается постоянной по мере их разделения.

Личный вклад диссертанта заключается в построении автоматизированной установки, включающей два независимо управляемых лазерных пинцета и систему компьютерной обработки данных, разработке методики и протокола измерения силы взаимодействия клеток, проведении экспериментов, обработки и интерпретации данных экспериментов, организации сбора крови и подготовки образцов, пригодных для проведения измерений.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации докладывались на следующих международных конференциях: «15^th International Congress of Biorheology and 8^th International Conference on Clinical Hemorheology» (Сеул, Корея, 2015), «Ломоносов – 2015» (Москва, Россия, 2015), «Laser Applications in Life Science» (Ульм, Германия, 2014), «Ломоносов – 2014» (Москва, Россия, 2014), «Saratov Fall Meeting 2014» (Саратов, Россия, 2014), «Russian Photonics and Laser Symposium 2014» (Куопио, Финляндия, 2013), «Saratov Fall Meeting 2013» (Саратов, Россия, 2013), «Topical Problems of Biophotonics 2013» (Нижний Новгород, Россия, 2013), «Hemorheology and Microcirculation« (Ярославль, Россия, 2013), «Оптические методы исследования потоков» (Москва, Россия, 2013), «Russia-Taiwan School-Seminar on Nonlinear Optics and Photonics» (Владимир, Россия, 2013), “Photonics and Imaging in Biology and Medicine” (Ухань, Китай, 2013), «Ломоносов – 2013» (Москва, Россия, 2013), «Saratov Fall Meeting 2012» (Саратов, Россия, 2012), «IV Съезд Биофизиков России» (Нижний Новгород, Россия, 2012), «Ломоносов – 2012» (Москва, Россия, 2012)

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 3-х статьях в международных научных изданиях и журналах из списка ВАК России.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав,

заключения и списка цитируемой литературы из 143 наименований. Работа

изложена на 96 страницах машинописного текста и включает 36 рисунок и 2
таблицы.

История открытия агрегации эритроцитов

Агрегация эритроцитов является одним из основных процессов, определяющих вязкость и, тем самым, микроциркуляцию крови. Этот процесс особо интересен тем, что он в значительной степени изменяется при патологиях [2,12,19,20]. С точки зрения взаимосвязи с распространенными методами клинической диагностики, АЭ тесно связана со скоростью оседания эритроцитов (СОЭ), измерение которой широко используется в клинической диагностике [21,22]. АЭ, является главным процессом, определяющим СОЭ, но в отличие от СОЭ может быть измерена быстро и содержит больше специфической диагностической информации. Таким образом, изучение АЭ является перспективным для диагностики и мониторинга заболеваний.

В настоящее время к физиологической роли АЭ относят её участие в следующих процессах: 1) комплексная регулировка вязкости крови при низких сдвиговых скоростях [23,24] 2) регулировка периферического гематокрита [2,5] 3) локализация клеток крови относительно стенок сосудов [25] 4) поддержание давления в кровеносных сосудах [26] Как один из примеров, на рисунке 1.2 показана локализация клеток крови, медленно протекающих через цилиндрическую трубку. Наблюдается изменение распределения клеток относительно стенок сосуда, образование маргинального слоя у стенок трубки и большее или меньшее скопление клеток в приосевой части сосуда в зависимости от степени АЭ. Рис. 1.2. Фотография потока крови, протекающей со скоростью 3.3 мм/с через стеклянную трубку диаметром 95 мкм: (а) бычья и (б) человеческая. В бычьей крови АЭ практически не происходит, и образуется лишь тонкий маргинальный слой. В человеческой крови происходит более интенсивная АЭ, и наблюдается скопление клеток у оси трубки и образование более толстого маргинального слоя около стенок [17].

При патологиях, включая большинство социально значимых заболеваний [5,27], таких как сахарный диабет [28-33], гипертензия, серповидная анемия [34,35], сепсис [36], ишемия [37], сердечнососудистые заболевания [38], различных типов воспалений [39,40], и других заболевании [41] наблюдается усиленная АЭ. Различия в параметрах, характеризующих АЭ при некоторых заболеваниях, представлены на рисунке 1.3. При патологиях может возникать так называемый «гиперагрегационный синдром», при котором эритроциты аномально быстро и прочно агрегируют. Изменение АЭ при патологиях связывают в основном с изменением концентрации белков плазмы крови и, в меньшей степени, с изменением свойств самих эритроцитов. Агрегация эритроцитов может служить диагностическим параметром для патологических состояний. Последствием усиленной агрегации являются в первую очередь закупоривание участков кровеносных сосудов, в которых должно было бы произойти сдвиговое разрушение агрегатов, и тем самым возникает локальная ишемия, повышение давления и пр.

Различие параметров M и M11, характеризующих агрегацию эритроцитов, для групп: контроль (Control), стабильная стенокардия (SA), нестабильная стенокардия (UA), острый инфаркт миокарда (AMI) [38]. Наблюдается значительное усиление агрегации эритроцитов при наличии патологии.

Известно, что АЭ происходит только в наличии в окружающей их среде крупных макромолекул. При этом степень АЭ определяется в основном двумя факторами: первый – это фактор среды, определяемый концентрацией и типом макромолекул; второй – это фактор клетки, определяемый склонностью клетки к образованию агрегата [42,43]. 1 M и M1 – это параметры, измеряемые с помощью агрегометра Myrenne. Они измеряются по изменению интенсивности лазерного излучения, рассеянного на суспензии образца крови. Образец помещается в тонкий зазор между вращающимся конусом и пластиной. Сначала эритроциты полностью дезагрегируются приложением сдвиговой скорости 600 с-1. Измеряется M – как интенсивность через 10 секунд после снятия сдвиговой скорости и M1 – как интенсивность через 10 секунд после уменьшения сдвиговой скорости до 3 с-1. 1.2.1 Фактор среды в агрегации эритроцитов: макромолекулы как проагреганты и ингибиторы агрегации

АЭ сильно зависит от типа и концентрации белков плазмы крови в окружающей их среде. Сейчас известно порядка 10 белков, играющих роль в АЭ. Это такие белки, как фибриноген [44-49], -глобулин [45-47,50], с-реактивный белок [51], гаптоглобин [51], альбумин [46-48] и другие [52], среди которых основную роль играет фибриноген. В таблице 1.1 показана роль белков в АЭ, изученная разными авторами. Для некоторых белков, таких как альбумин, имеющиеся данные о роли в агрегации не согласуются. Причину различий адресуют к комплексному участию белков в агрегации эритроцитов и различием в использованных методах [5].

Альбумин 66 20-50 ,,нет эффекта АЭ может происходить и в растворах нейтральных синтетических макромолекул [53]. Растворы нейтральных макромолекул широко используются для изучения механизмов взаимодействия эритроцитов [54-56]. Взаимодействие эритроцитов индуцированное нейтральными макромолекулами является более простым по сравнению с взаимодействием в плазме, которая является электролитом. Степень выраженности индуцирующей или ингибирующей роли макромолекул в АЭ можно выстроить по гидродинамическому радиусу (Rh) макромолекул, как показано на рисунке 1.4 [57]. Макромолекулы с Rh 4 нм ингибируют АЭ, а с Rh 4 нм являются проагрегантами. Белки плазмы крови могут быть выстроены аналогичным образом. Но такой подход имеет недостаток в связи с тем, что он не учитывает наблюдаемый синергетический эффект макромолекул в АЭ, как показано на примере нескольких макромолекул на рисунке 1.5.

Гипотетические модели механизмов взаимодействия эритроцитов

В данной работе для исследования АЭ были использованы следующие среды, индуцирующие АЭ: (1) аутологичная плазма; (2) аутологичная сыворотка, (3) модельные растворы на основе PBS (фосфат-буферного раствора), содержащие белки крови (фибриногена и альбумина как по отдельности, так и в совокупности), (4) модельный раствор на основе PBS, содержащий нейтральные макромолекулы (декстран 500 кДа). Такой выбор сред был обусловлен тем, что фибриноген является одним из основных белков, определяющих реологию крови [44,45], и наблюдается синергетический эффект фибриногена с альбумном и -глобулином, усиливающий АЭ [45,46]. Декстран рассматривался как пример нейтральных макромолекул, широко используемых для изучения механизмов взаимодействия при АЭ, а также «агрегируемости» эритроцитов [54,105].

Кровь для экспериментов забиралась из пальца или из локтевой вены человека, в зависимости от эксперимента. В качестве антикоагулянта использовался ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота). В основном во избежание разброса параметров за счет индивидуальных отличий для набора значимой статистики использовалась кровь одного клинически здорового донора мужского пола. Качественные измерения проводились и на пробах крови других доноров для проверки наблюдаемых зависимостей. Большинство экспериментов проводились при комнатной температуре. Эксперименты проводились in vitro в течение нескольких часов после взятия крови согласно рекомендациям международного общества клинической гемореологи, т.к. в пределах четырех часов отклонения параметров АЭ со времени минимальны [87].

Плазма крови подготавливалась очищенной от тромбоцитов согласно следующему протоколу. Цельная кровь сразу после забора крови центрифугировалась в течение 10 минут при 2,000 g при комнатной температуре. Эритроцитарная масса отделялась от плазмы. Очищенная от эритроцитов плазма дважды центрифугировалась в течение 10 минут при 11,000 g при комнатной температуре для удаления остатков клеток, в частности, тромбоцитов. Удаление тромбоцитов являлось одной из важнейших процедур для успешного проведения измерений. Тромбоциты, будучи захваченными в оптическую ловушку при медленном оседании, препятствовали точным измерениям сил.

Сыворотка крови подготавливалась в специальной пробирке (BD Vacutainer) по стандартной процедуре. В пробирке содержался гель, разделяющий тромб от сыворотки, а также активатор на базе тромбина, ускоряющий тромбообразование. Кровь забиралась в пробирку и отстаивалась при комнатной температуре в течение 20 минут до образования тромба. Затем кровь центрифугировалась в течении 20 минут при 1,500 g при комнатной температуре и тромб отделялся от сыворотки крови слоем разделительного геля. Сыворотка крови забиралась и отмывалась повторным центрифугированием в течение 10 минут при 11,000 g при комнатной температуре для удаления возможных остатков клеток.

Модельные растворы белков или нейтральных макромолекул подготавливались в PBS (10 мМ Na2HPO4, 1.76 мМ KH2PO4, 2.7 мМ KCl, 137 мМ NaCl, осмолярность 300 мОсм/кг, pH 7.4,). Растворы белков и нейтральных макромолекул хранились при температуре 4C и могли использоваться в течение 1 недели после подготовки. Подготовка образца В подготовленные растворы добавлялась малое количество крови, доля эритроцитов в растворе составляла порядка 0.05%. Такое сильное разбавление эритроцитов в растворе было необходимо для работы с одиночными клетками. Кровь, взятая из пальца, помещалась сначала в PBS и отмывалась дважды путем центрифугирования в течение 10 минут при 3,000 g. После каждого центрифугирования заменялся PBS. Затем забиралось малое количество эритроцитарной массы и добавлялось в нужный модельный раствор. Подготовка экспериментальной кюветы Для проведения экспериментов подготавливалась специальная кювета, состоящая из предметного и покровного стекол, разделенных двухсторонним скотчем. Схематически кювета показана на рисунке 2.1. Высота кюветы измерялась микрометром и составляла порядка 100 мкм, объем помещаемого образца составлял порядка 60 мкл. Две стороны кюветы состояли из разделяющего двухстороннего скотча, а две другие стороны герметизировались вазелином. Стекла перед использованием обрабатывались 98% этиловым спиртом и высушивались.

В растворах, не содержащих альбумин, наблюдалось прикрепление эритроцитов к стеклу и постепенное превращение их в эхиноциты. Для предотвращения этого процесса, поверхность предметного стекла обрабатывалась 1% раствором человеческого альбумина в PBS. 5 мкл раствора распределялось по поверхности кюветы и высушивалось в течение 10 минут. Таким образом, эритроциты не превращались в эхиноциты и не прикреплялись к поверхности стекла. В случае работы с раствором декстрана, не смотря на покрытие альбумином, эритроциты продолжали прикрепляться к поверхности стекла. Однако покрытие альбумином предотвращало превращение эритроцита в эхиноцит. С силу этого концентрация эритроцитов в растворе макромолекул бралась в 10 раз выше (0.5%). Таким образом создавалось множество слоев эритроцитов на поверхности стекла, и отделять эритроциты для измерений было легче.

Принцип измерения сил взаимодействия между эритроцитами с помощью лазерного пинцета

Процедура экспериментов схематически показана на рисунке 3.6. Измерения FD при маленьком «начальном перекрытии» (S0 10 мкм2) совпадают с процедурой показанной на рисунке 3.4 (а). При большом «начальном перекрытии» (S0 30 мкм2) измерения проводились следующим образом: (1) два эритроцита сводились и удерживались в контакте в течение некоторого времени с этим перекрытием; (2) эритроциты разводились до перекрытия порядка 10 мкм2 и удерживались в течение некоторого времени; (3) при этом измерялась FD.

Как показано на рисунке 3.6 (в), при большем «начальном» перекрытии FD значительно выше и возрастает пропорционально перекрытию эритроцитов для плазмы [139]. Таким образом, наглядно наблюдается эффект возрастания силы взаимодействия эритроцитов. Этот эффект скорее всего связан с «эффективной» площадью взаимодействия эритроцитов. Не исключено, что через некоторое время этот эффект релаксирует, но в данной работе это не исследовалось. Этот вопрос требует более детального изучения и наша дискуссия по наблюдаемому эффекту в рамках механизмов взаимодействия клеток приведена в главе 4.

Наши экспериментальные результаты показывают, что эритроциты в растворах белков, хотя и не агрегируют спонтанно, но сильно взаимодействуют друг с другом, будучи приведенными в контакт с помощью ЛП. Для растворов белков, плазмы и сыворотки крови наблюдается эффект возрастания силы взаимодействия FD по мере разведения клеток. Следует отметить, что для процесса САЭ в плазме сила FA была пропорциональна «текущей» площади взаимодействия эритроцитов и эффект возрастания силы не наблюдается. В то же время в растворах нейтральных макромолекул наблюдается одинаковая зависимость как для САЭ, так и для ДАЭ, и эффект возрастания силы взаимодействия также не наблюдается. Рис. 3.6 Измерение силы при дезагрегации эритроцитов (FD) при различных значениях «начальной» площади взаимодействия эритроцитов. (а) Случай малого «начального перекрытия» (около 10 мкм2): два эритроцита сводятся и удерживаются в контакте в течение некоторого времени с этим перекрытием, при этом измеряется FD; (б) Случай большого «начального перекрытия» (около 30 мкм2): два эритроцита сводятся и удерживаются в контакте в течение некоторого времени с этим перекрытием, затем эритроциты разводятся до перекрытия порядка 10 м2 (20%) и удерживаются в течение некоторого времени, при этом опять измеряется FD. (в) В результате измерений наблюдается значительный рост FD при увеличении начального перекрытия (синий столбец 21 мкм2, красный – S 30 мкм2).

Результаты измерений временной зависимости силы при спонтанной агрегации и дезагрегации эритроцитов показали, что для характерных времен от 10 до 100 секунд изменений силы нет. По литературным данным результаты, полученные с помощью лазерных пинцетов для плазмы и с помощью атомного силового микроскопа для раствора декстрана, показывают, что силы взаимодействия эритроцитов резко возрастают течение первых 5 секунд контакта. Однако результаты дальнейших измерений имеют значительный разброс и являются недостоверными. В то же время наши результаты наглядно показывают, что сила взаимодействия эритроцитов насыщается уже по прошествии первых 10 секунд взаимодействия клеток. В плазме также наблюдается отличие абсолютных величин FA и FD почти на порядок. Это может означать, что природа сил, собирающих эритроциты в агрегат (FA) и удерживающих агрегат от разрушения (FD) отличается. Более детальному обсуждению полученных данных в свете механизмов взаимодействия эритроцитов посвящена глава 4.

Как отмечалось в первой главе, существуют два коммерческих прибора, позволяющих измерять динамические характеристики взаимодействия эритроцитов на образцах цельной крови. В частности, мы сравнили силы FA и FD, измеряемые с помощью ЛП, с параметром CSS, измеряемым с помощью агрегометра RheoScan [141]. Параметр CSS по физическому смыслу коррелирует с FA. В литературе он определяется как минимальное сдвиговое напряжение, удерживающее эритроциты от спонтанной агрегации или необходимое для разрушения агрегата. В то же время FA измеряется путем сопоставления FTRAP с минимальной силой, необходимой для удерживания эритроцитов от агрегации. Сдвиговое напряжение по определению является отношением силы, приложенной в нормальном направлении к некоторой площади, к величине этой площади. Сдвиговое напряжение, создаваемое ЛП, можем получить, поделив FA или FD на площадь взаимодействия эритроцитов друг с другом. Обозначим его как SASS (single cell aggregating shear stress) и SDSS (single cell disaggregating shear stress), соответственно.

Для сравнительных измерений использовались кровь 10 молодых клинически здоровых доноров мужского пола. Измерения производились одновременно на ЛП и на агрегометре - RheoScan. На рисунке 3.7 показаны результаты сравнения, параметр CSS сопоставим и практически совпадает с SASS. В случае SDSS (S 10 мкм2) измеренное значение превышало 1000 мПа (не показано на графике), что и следовало ожидать, исходя из разницы между FA и FD. Наши результаты показывают сравнимость параметров, измеренных на популяционном уровне (CSS) и на уровне отдельных клеток (SASS). Также показано, что определение CSS как минимального сдвигового напряжения, необходимого для дезагрегации эритроцитов является неверным. Параметр SDSS значительно больше, чем SASS, при этом с увеличением перекрытия эритроцитов SDSS значительно возрастает. С другой стороны наши результаты объясняют независимость CSS от гематокрита и температуры [86]. Также мы подтверждаем предположение о том, что в ротационной системе сдвиговое напряжение прикладывается менее эффективно, чем в проточной схеме [111]. Измерения, сделанные с помощью ЛП, можно считать наиболее прямыми и могут считаться контрольными.

В данной главе изложены экспериментальные результаты исследования взаимодействия эритроцитов при их агрегации в различных средах, индуцирующих агрегацию клеток. Показано значительное отличие процесса спонтанной агрегации эритроцитов от процесса дезагрегации эритроцитов. Сделано сравнение параметров, которое необходимо для рассуждения об механизмах взаимодействия эритроцитов. Результаты измерений на уровне индивидуальных клеток сравнены с измерениями на цельной крови, найдена хорошая корреляция результатов. Показано, что известные коммерческие агрегометры способны измерять параметры только САЭ, но не ДАЭ.

Сравнение параметров агрегации и дезагрегации эритроцитов, измеренных на образцах цельной крови и на индивидуальных клетках

Оценка энергии взаимодействия эритроцитов по измерениям ЛП проводилась следующим образом. Рассматривалось измерение силы взаимодействия, представленное в главе 3 на рисунке 3.5. Мы имеем параметры: F - сила взаимодействия эритроцитов и A - относительное линейное смещение эритроцита. Для вычисления работы использовалась простая механическая модель, представленная на рисунке 4.1 (а). Работа для передвижения эритроцита (U) получалась как U = F X A. Такой подход был возможен в виду того, что измерялись минимальные силы, характеризующие ДАЭ. Работа, затрачиваемая для разделения пары эритроцитов, рассчитывалась поэтапно, для каждых Fv и А, как показано на рисунке 4.1 (б). Для полного разделения эритроцитов в плазме затрачивалась энергия U = 148 ± 49 аДж.

Расчет плотности энергии взаимодействия эритроцитов Плотность энергии взаимодействия эритроцитов (Е, мкДж/мкм2) была получена как отношение работы к площади взаимодействия эритроцитов. Была рассчитана Е для процесса ДАЭ в плазме и в растворе декстрана (рисунок 4.2). Хорошо видно, что в растворе декстрана E остается постоянной, а плазме, напротив, E возрастает по мере разделения клеток.

Зависимость, наблюдаемая для ДАЭ в плазме, похожа на ту, которая имеет место в модели «подвижных мостиков». Получая параметры b и m0 численным методом и рассчитывая энергию взаимодействия по формуле 4.1, мы наблюдаем высокую корреляцию экспериментальных результатов (рис. 4.2) с моделью «подвижных мостиков». Основание использования модели «подвижных мостиков» для описания взаимодействия эритроцитов в плазме, следующее: (1) белки, в частности, фибриноген могут связываться специфически и неспецифически с мембраной эритроцита; (2) мембрана эритроцита является подвижной; (3) практически все элементы мембраны эритроцитов могут перемещаться. Из этого следует, что подвижность точек связывания вполне может иметь место при взаимодействии эритроцитов. При этом эффект возрастания силы, наблюдаемый при ДАЭ, объясним аккумуляцией «мостиков». Экспериментальные факты, полученные в данной работе, также служат дополнительными аргументами в пользу использования данной модели для описания взаимодействия эритроцитов.

Аргументы такие: (1) Зависимости сил взаимодействия эритроцитов при их дезагрегации (а следовательно и энергии их взаимодействия) в растворе белков (фибриногена с альбумином) и в плазме совпадают, как можно видеть из рис. 3.5. При этом в растворе белков САЭ отсутствует. Это согласуется с литературными данными. В отсутствии сторонних сил мембраны эритроцитов не могут приблизиться достаточно близко, чтобы образовать «мостик». Мы показываем, что эритроциты в растворах белков действительно спонтанно не агрегируют, но будучи приведенными в контакт друг с другом, они прочно связываются. Следует отметить, что взаимодействие, наблюдаемое в растворе белков, трудно представить результатом действия осмотических сил, т.к. механизм «обедненного слоя» исключает возможность отсутствия САЭ. Таким образом, экспериментальные результаты подтверждают роль фибриногена с альбумином в качестве «мостиков», удерживающих агрегат.

Сравнение сил в плазме и сыворотке крови (рис. 3.2), показывают значительную роль фибриногена в САЭ, но только в комплексе с другими компонентами плазмы. Можно предположить, что осмотические силы проявляются в комплексе с другими компонентами крови и фактически являются силами, приближающими эритроциты достаточно близко, чтобы образовывались «мостики», которые в свою очередь крепко удерживают агрегат. (3) Энергия взаимодействия клеток в растворе декстрана коррелирует со значением по модели «обедненного слоя» (рис. 4.2). Это означает, что в отличие от случая в плазме энергия взаимодействия клеток в растворе декстрана распределена равномерно во всем процессе агрегации эритроцитов. Физический принцип взаимодействия согласуется с механизмом «обедненного слоя», т.к. осмотическое давление пропорционально площади «обедненного слоя». В плазме, напротив, наблюдается другой характер взаимодействия.

Тем не менее вопрос о том, как именно белки взаимодействуют друг с другом и с эритроцитом, остается не ясным. Остается открытым и вопрос о том, как при САЭ преодолевается столь сильное взаимодействие клеток, наблюдаемое при ДАЭ. Особенно, имея в виду отсутствие эффекта возрастания силы при САЭ, и наличие сильного эффекта при ДАЭ.

На базе полученных результатов мы можем заключить, что имеющиеся модели не способны описать взаимодействие эритроцитов в нативной среде (плазме). Для адекватного описания взаимодействия клеток предлагается расширенная модель «подвижных мостиков» и ее комбинация с моделью «обедненного слоя». Тем не менее нельзя исключить возможность того, что САЭ реализуется за счет других типов мостиков, которые легко формируются и являются малоподвижными. Таким образом, механизм взаимодействия эритроцитов требует дальнейшего детального изучения.

В данной главе изложены результаты развития моделей, описывающих механизмы взаимодействия эритроцитов. На базе экспериментальных результатов рассчитаны энергии взаимодействия и сопоставлены с теоретическими результатами из литературы. Предложено использование комбинации моделей «подвижных мостиков» и «обеднённого слоя» для описания взаимодействия эритроцитов в плазме.