Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 13
1.1. Основные принципы технологии мониторинга состояния растений 13
1.2. Агроэкосистемы и условия выращивания растений 18
1.3. Кинетические измерения фотосинтеза и влияние световой среды 20
1.4 Оптические свойства растений и спектрофотометрические методы их исследований 25
1.5. Роль углекислого газа и изотопных отношений углерода в жизнедеятельности растений 32
1.6. Генерация биоэлектрических потенциалов. Растительно-микробные топливные элементы 41
Выводы по главе 1. Обоснование направления исследования 54
Глава 2. Спектры поглощение светочувствительных пигментов in vitro и листьев растений in vivo в зависимости от спектрального состава освещения 57
2.1. Параметры выращивания растений: выбор световой среды 57
2.1.1 Лабораторный фитотрон 57
2.1.2 Создание спектров освещения с физиологически значимыми характеристиками 59
2.2 Спектрофотометрический анализ поглощения светочувствительных пигментов в зависимости от спектральных характеристик освещения 63
2.2.1 Методика регистрации спектров поглощения пигментов растений 63
2.2.2 Спектры поглощения светочувствительных пигментов в зависимости от суточной доли ФАР 67
2.2.3 Поглощение светочувствительных пигментов в зависимости от спектров освещения 69
2.3 Спектрометрический анализ поглощения листьев in vivo 73
2.3.1 Экспериментальная установка 75
2.3.2 Карта поглощения листовой поверхности 77
2.3.3 Влияние спектральных особенностей световой среды на поглощение света листьями салата и его нетто-продуктивность 80
2.3.3.1 Условия выращивания и вариации световой среды 80
2.3.3.2 Влияние спектра освещения на продуктивность и биохимический состав 84
2.3.3.3 Влияние спектральных характеристик освещения на поглощение листовой поверхности 89
2.4 Модель поглощения квантов различной энергии растениями 96
Выводы по главе 2 99
Глава 3. Фракционирование изотопов углерода из окружающей среды в углеродный пул растений в условиях вариации спектральных характеристик световой среды 102
3.1 Масс-спектрометрический анализ изотопного состава углерода 102
3.2 Методика и аппаратный комплекс пробоподготовки для изотопного анализа углерода, участвующего в жизнедеятельности растений 103
3.2.1 Установка для обогащения углекислого газа и определения изотопного отношения углерода в атмосфере 104
3.2.2 Методика для определения изотопного отношение углерода глюкозы в тканях растений 110
3.2.3 Каталитическая ячейка для определения изотопного отношения углеродного пула растений 113
3.3 Фракционирование изотопов из атмосферы в углеродный пул листьев растений в зависимости от световой среды 120
3.4 Скорость ассимиляции изотопов углерода 12С и 13С из углекислого газа атмосферы в углеродный пул 123
Выводы по главе 3 124
Глава 4. Биоэлектрические потенциалы, генерируемые в системе корнеобитаемая среда – растение 127
4.1 Измерение биоэлектрических потенциалов 127
4.1.1 Инвазивное измерение биоэлектрических потенциалов растений 128
4.1.2 Создание неинвазивной автоматической системы регистрации 130
4.1.3 Биосовместимость электродных систем 133
4.2 Биоэлектрические потенциалы растений в условиях различного водного режима, глубины грунта и освещения 139
4.2.1 Влияние водного режима на величину биоэлектрического потенциала 139
4.2.2 Градиент биоэлектрических потенциалов в зависимости от глубины почвы 142
4.2.3 Вариации электрофитограмм в зависимости от спектральных характеристик освещения 145
4.3 Модель изменения динамики биоэлектрического потенциала в системе почва-растение, зависящей от водного режима 151
4.4 Растительно-микробный топливный элемент 154
4.5 Эффективность конверсии света в электрическую энергии в ризосферной зоне 159
Выводы по главе 4 159
Заключение 161
Выводы 164
Список сокращений 165
Благодарности 166
Список литературы 167
- Основные принципы технологии мониторинга состояния растений
- Поглощение светочувствительных пигментов в зависимости от спектров освещения
- Установка для обогащения углекислого газа и определения изотопного отношения углерода в атмосфере
- Вариации электрофитограмм в зависимости от спектральных характеристик освещения
Основные принципы технологии мониторинга состояния растений
Фитомониторинг – информационная технология, основанная на автоматизированной, непрерывной и не нарушающей условий среды регистрации характеристик интактных растений и параметров фитоклимата; его основным методологическим принципом является системный анализ временного хода характеристик растения и среды [1]. Данная технология позволяет не только получать, обрабатывать, анализировать и хранить информацию о физиологическом состоянии растения, но и принимать решение об управлении его развитием.
Исследования в области физиологических процессов в интактных растениях с применением систем автоматической регистрации и созданию на их основе систем управления жизнедеятельностью растений были начаты В.Г Карманов еще в 1950-х годах [2]. На начальном этапе это направление называлось «физиологический мониторинг», термин «фитомониторинг» был введен в 1987 году, а в качестве базовых физиологических показателей, поддающихся непрерывной автоматической регистрации, были предложены: ксилемный поток, тургор, рост [3]. Основными принципами методики, используемой в фитомониторинге, являются непрерывность регистрации информации, безвредность для растения, сохранность условий внешней среды и синхронность получения информации о разных физиологических процессах, происходящих в растительных организмах [4,5].
Системный анализ физиологических процессов в растении основан на многоканальности и разнообразие регистрируемых параметров. Наиболее информативными и репрезентативными являются не абсолютные значения регистрируемых параметров, а формы кривых, образованных в результате суточной регистрации, а также многосуточные тренды изменений параметров [6]. В фитомониторинге используют как первичные характеристики растения и окружающей, регистрируемые непосредственно в опыте, так и вторичные показатели, рассчитываемые на основе первичных данных по соответствующим формулам [7].
Фитомониторинг часто рассматривают и как раздел биофизики растений или биокибернетики, и как новую методологию физиологии растений, и как информационную технологию в растениеводстве [7,8] Основные направления использования включают в себя фундаментальные исследования в области биофизики и физиологии растений, диагностику свойств генотипа, относящуюся к генетике и селекции растений, и диагностику состояния растений, используемую для совершенствования технологии культивирования растений [7]. Методология фитомониторинга позволяет развить представление о фундаментальных закономерностях взаимодействия системы «генотип-среда» как основы повышения продуктивности и устойчивости агроэкосистемы (см. табл. 1.1).
Мониторинг состояния и функций растения с помощью информационо-измерительных систем в первую очередь направлен на исследование процессов обмена веществ на границах раздела корень-почва и лист-атмосфера [10]. Кроме того, большое внимание уделяется процессам транспорта воды, солей и ассимилятов внутри растения, регистрация которых не повреждающим методом более сложна и трудоемка. Под состоянием растения понимается уровень и направление изменения контролируемых параметров растения – интенсивности фотосинтеза, роста, тургор, разность температур лист-воздух, разность потенциалов, скорость ксилемного потока и т.д. [9]. Рост является интегральным показателем жизнедеятельности, ксилемный поток чувствителен к разнообразным внешним воздействиям, тургорное давление находится в причинно-следственной связи как с потоком, так и с ростом [5]. Алгоритм функциональной диагностики таких состояний включает в себя выявление потребностей растения и создание оптимальных условий окружающей среды; диагностика свойств включает в себя дозированное стрессовое воздействие, регистрацию реакции растения и обработку данных по определенному алгоритму.
Фитомониторинг нашел широкое применение для диагностики состояния растения не только в фундаментальных исследованиях в области биофизики и физиологии растений, но и используется как элемент агротехнологий для диагностики стрессовых ситуаций и корректировки условий выращивания. Использование многоканальных информационно измерительных систем может внести серьезный вклад в решение таких комплексных задач, как проблемы продуктивности и устойчивости растений [5].
Способность растения переносить стрессовые условия с наименьшими потерями или физиологическая устойчивость связана с сохранением гомеостаза, а также более глубинных характеристик – ультраструктуры пластид, активности ферментов и т.д. В качестве критериев для исследования устойчивости рекомендовано использовать изменения проницаемости мембран, водно-осмотического режима клетки, уровня образования энергии в клетке, интенсивности ростовых процессов [11]. Одним из важнейших критериев устойчивости растения к стрессу является урожайность, однако при этом организм должен поддерживать адаптивный потенциал – то есть сохранять на довольно высоком уровне процессы метаболизма в некотором диапазоне субоптимальных условий. Изменения, происходящие в организме под действием стресса можно разделить на две группы признаков: одна характеризуется как процесс, интенсивность, динамика, обмен, скорость, другая – как содержание, концентрация, напряженность, емкость [9].
Продуктивность связана с интенсивностью энерго- и массобмена растения со средой. Рост и развитие растения сопряжены не только с поглощением лучистой энергии и химических веществ в воздушной и корневой средах, но и их выделением в среду обитания. Контрольными параметрами для диагностики продуктивности могут выступать водный обмен, тургор и рост [12]. К более продуктивным относятся те сорта с более высоким содержанием (массой) сухого вещества, уровень которого обусловливается особенностями осуществления фундаментальных физиологических процессов.
Все внутренние процессы, протекающие в ходе жизнедеятельности растений, их состояние, ход развития и важнейшие физиологические процессы, такие как транспирация, фотопериодизм, фотосинтез тесно связаны с условиями внешней среды – температурой и влажностью воздуха, спектральным составом и мощностью лучистого потока, режимом теплообмена, минерального и водного питания и т.д. [4]. Поэтому наряду с наблюдением за параметрами окружающей среды, а в условиях закрытого грунта и их регуляцией, важным представляется развитие технологии мониторинга основных эндогенных процессов, протекающих в интактных растениях.
Одной из первых разработок в области фитомониторинга была серия высокочувствительных датчиков – полупроводниковых микротерморезисторов [4]. Принцип использования терморезисторов сводится к регистрации изменения потребляемой мощности, частично рассеиваемой в окружающую среду, частично идущей на изменение его теплосодержания, и вызванной изменением условий теплообмена терморезистора с окружающей средой. То есть датчик реагирует на изменение скорости обтекания терморезистора окружающей средой, ее плотность, давление, концентрацию раствора и т.д. Преобразование регистрируемых величин в изменение электрической величины (сопротивления) вошло в основу следующих приборов для непрерывного мониторинга состояния растений [4]: 1) микротермометр – позволяет измерять температуру отдельных листьев, транспирацию с помощью регистрации разности температур между листом растения и сухой бумагой; 2) микрогигрометр – для измерения влажности воздуха и регистрации изменения транспирации, основанного на зависимости максимальной упругости паров над поверхностью водного раствора гигроскопической соли (хлористого лития) от температуры; 3) прибор для регистрации изменений скорости водного потока по растению – состоит из двух микротермосопротивлений, служащих плечами моста постоянного тока и микронагревателя в центре, при этом разбаланс моста зависит от массотеплопереноса (скорости движения воды по черешку); 4) микробалансомер – для изучения оптических свойств листа и регистрации его радиационного баланса с приемной поверхностью в виде полупроводниковой пленки.
Поглощение светочувствительных пигментов в зависимости от спектров освещения
На рисунке 2.6 представлены морфологические показатели овса, выращенного в условиях различного по спектральному составу освещения. Для образцов из каждой группы видна корреляция всхожести, массы и суммарной длины листьев, причем с увеличением интенсивности излучения в красной области наблюдается тенденция к росту их значений. Как показал эксперимент, растения лучше всего развиваются при наличии длин волн, соответствующих полному диапазону видимого света.
Имеется выраженная связь между спектром освещения растений и спектром поглощения выделенных из него светочувствительных пигментов. На спектрах поглощения общей фракции светочувствительных пигментов (табл. 2.2), выделенных из 14-дневного овса, выращенного под освещением с разными спектральными составами, видны 4 максимума поглощения. Значения оптических плотностей на длинах волн 433 и 662 нм характерны для максимума поглощения хлорофилла а, а на длинах волн 465 и 616 нм для хлорофилла b. Низкая интенсивность поглощения в зеленой области, характерной для поглощения каротиноидов, говорит об их низкой концентрации. Видимо, они работают только в качестве собирающих свет пигментов, а не выполняют защитные функции предохранения различных органических веществ, в первую очередь молекул хлорофилла, от разрушения на свету в процессе фотоокисления [185]. Скорее всего, это означает, что выбранные условия выращивания и освещения благоприятны для растений, стрессовых реакций не наблюдается.
На наш взгляд, хорошей комплексной характеристикой поглощения растениями света и работы фотосинтетического аппарата является содержание общей фракции светочувствительных пигментов и отношение максимумов поглощения (рис. 2.7), типичных для хлорофилла a и b. С увеличением возраста растений, освещаемых теплым белым и красно-бело-синим светом, количество пигментов растет и падает для образцов, выращенных под светом с большей долей синего света. Для 12-дневного овса разброс в значениях отношений оптических плотностей не велик (6 – 7%), но увеличивается до 15 – 17% на 14-й день роста. С 12 по 14 день длина листьев растений увеличивалась в среднем на 50%, а в условиях выращивания в гидрогеле 15 день без добавления дополнительного минерального питания может рассматриваться как конец вегетационного периода. Соответственно, 12 день – это период максимальной скорости роста растения, а 14 – начало увядания первых листьев. Большие изменения в поглощение в зависимости от условий освещения наблюдается для хлорофилла b. По литературным данным известно [186], что этот пигмент реагирует на недостаток света в какой-либо области
Изменение отношений максимумов поглощения показывает, что при избытке излучения в каком-либо диапазоне длин волн видимой области, пигментный аппарат растения поглощает большее количество фотонов с энергией, характерной для доминирующей области излучения. Это хорошо вписывается в представления о способности к адаптации ответственной за фотосинтез пигментной системы растительных культур. Например, при освещении синим светом, растение более приспособлено к переработке квантов, характерных для этого диапазона; соответственно, и пигментный аппарат поглощает больше синий составляющей спектра, по сравнению, в частности, с красной. Однако имеется и противоположный процесс: при отсутствии длинноволновой части спектра освещения, фотосинтетические пигменты пытаются их уловить, повышая тем самым чувствительность к красному свету. Это соответствует принятому в литературе представлению о том, что фотосинтетическая эффективность поглощения квантов в области 650-680 нм выше, чем для области 400-460 нм, и значительной роли длин волн 680 нм и 700 нм, как максимумов поглощения пигментов P700 фотосистемы I и P680 фотосистемы II – реакционных центров, используемых для первичной фотохимической реакции переноса электронов [65]. Также в ходе исследования было показано, что вариация интенсивности красной составляющей в освещении изменяет относительное поглощение пигментов. Это соответствует представлениям о значительной роли красного диапазона спектра освещения в процессах фотоморфогенеза.
По результатам спектрофотометрического анализа оптимальным спектром для освещения растений является спектр похожий на спектр поглощения хлорофилла, так как при его использовании видимо, не наблюдается адаптивных эффектов и содержание хлорофилла находится на стабильно высоком уровне. При сравнении содержания хлорофилла a, хлорофилла b, и общего содержания пигментов с всхожестью, массой и площадью поверхности листьев овса посевного выявлено, что более эффективным является использование спектра освещения с излучением во всей области длин волн от 400 до 700 нм и с доминированием красной составляющей. Оптимальная интенсивность освещения, полученная в ходе проведенных экспериментов, составляет 70-100 мольм-2с-1 для овса посевного при облучении в сине-бело-красном диапазоне.
Установка для обогащения углекислого газа и определения изотопного отношения углерода в атмосфере
Для реализации изотопного масс-спектрометрического анализа углерода в атмосферной среде необходимо обогатить газовую смесь углекислым газом воздуха. Одним из способов концентрирования CO2 является его вымораживание. При абсолютном давлении 760 мм рт. ст. и при температуре —78,9С углекислота переходит в твердое состояние.
Процесс вымораживания СО2 осуществляется при тепловом режиме, обеспечивающем кристаллизацию СО2 на стенках накопительного сосуда и при отсутствии снега в потоке воздуха. При этом разность температур между воздухом и стенками не должна превышать 30С, а скорость потока газа во избежание срыва и уноса осажденных кристаллов СО2 должна быть не выше 3 м/с.
С учетом описанных условий нами была реализована методика обогащения газовой смеси углекислым газом: в теплоизоляционный сосуд, наполненный на 1/3 жидким азотом, помещали пробирку, через которую осуществлялась прокачка малых потоков атмосферного воздуха. Пробирка располагалась в парах азота таким образом, чтобы температура ее дна составляла —100С. Цикл длился 15 минут, после чего пробирку с концентрированным CО2 вынимали, при комнатной температуре газ переходил в газообразное состояние, после чего осуществлялся масс-спектрометрический анализ.
В результате для лабораторного воздуха получено значение 13С=-19,85±3 (рис. 3.2), при этом по литературным данным значение дельты для атмосферного варьирует от 7 до 13 [110].
В связи с этим для верификации методики необходимо исключение возможной интерференции осколочных ионов органических микропримесей с ионами СО2+, используемых для изотопных измерений. Для устранения влияния наличия органических веществ в пробе на результаты изотопного анализа углерода было выбрано каталитическое сжигание примеси. В качестве катализатора использовали платину, измерения на пирометре показали, что Pt катализатор в виде нагревательной ленты 35х1мм достигает температуры 1200-1250К, достаточной для сжигания органических веществ, при токе 3.5А.
Произведен расчет времени, необходимого для сгорания органических примесей в закрытом объеме V на поверхности катализатора S. В приповерхностной области создается градиент концентрации и возникает направленный поток частиц. В изотермическом приближении поток примеси на поверхность определяется
Где n=N/V - плотность числа молекул, v - средняя скорость молекул, Р - давление примеси, k=l,3810"23 Дж/К постоянная Больцмана, Т - температура газа, NA=6,022-1023 моль"1 число Авогадро, 7Г=3,14 математическая постоянная.
Для экспериментальной проверки создана ячейка с объемом камеры V=550CM3 И площадью поверхности катализатора S=20MM2. Подставляя имеющиеся параметры ячейки в рассчитанную формулу получаем т=2,4с.
С помощью квадрупольного масс-спектрометра МС7-100 проведено тестирование скорости сгорания паров органических веществ в созданной ячейке. Для этого в ячейку помещена капля ацетона ( 0,02мл), сняты полные масс-спектры до и после сжигания (рис. 3.3), а также изменение интенсивности сигналов для m/z=43, соответствующего осколку ацетона С2Н30, 12С02 с m/z=44, 13С02 с m/z=45, ацетона СзН60 m/z=58 в реальном времени протекания реакции (рис. 3.4).
Основываясь на проведенных измерениях, установка для концентрирования углекислого газа модифицирована и имеет следующий вид (рис. 3.5). В качестве герметичной камеры для тестируемого растения использован эксикатор. Система вымораживания состоит из двух контуров, в одном витке которого поддерживается температура чуть ниже нуля и обеспечивается осаждение воды и осушение газовой смеси, в другом холодильнике-теплообменнике, выполненном в виде стеклянной пробирки объемом 235 см3, температура в области куда подается газовая смесь ниже —100С, что позволяет перевести углекислый газ в твердую фазу. Скорость потока не превышает 0,5 м3/ч, что позволяет CO2 десорбироваться на стенках пробирки. Система пневмотрубок, соединяющая все составляющие установки, и побудитель расхода обеспечивают циркуляцию газовой смеси от растения через систему емкостей обратно в камеру с исследуемым объектом. После цикла вымораживания, длящегося 15 минут, концентрированный CO2 в пробирке переводится в газообразное состояние нагреванием при комнатной температуре. Пробирка оснащена платиновым катализатором 35х1мм при токе накала 3,5 А обеспечивающем температуру 900С. После оттаивания в пробирке осуществляется каталитическое сжигание примесей за время =545с согласно теоретическому расчету и поправочному коэффициенту, вычисленному экспериментально.
Вариации электрофитограмм в зависимости от спектральных характеристик освещения
Для выявления роли освещения в генерации биоэлектрических потенциалов был проведен следующий эксперимент.
Мы предположили, что чем больше в исследуемой системе тестируемых объектов и, соответственно, объем корнеобитаемой среды, тем выше величина БЭП и тем заметнее ее изменение. В связи с этим в емкость объемом 16л, высотой 160мм, длиной 780мм, ширина 200мм было посажено 12 хлорофитумов. Электроды выполнены в виде сетки с ячейками 5х5мм, толщиной проволоки 0,7мм и расстоянием 50 мм друг от друга. Часть дна сосуда занимал дренаж. Исследуемый образец помещали в фитотрон с фиолетовым освещением 12 часов в сутки с 6:00 до 18:00.
Динамика биоэлектрических потенциалов показана на рис. 4.11. Первые 3 дня наблюдается рост значений, скорее всего связанный с адаптацией растений к условиям выращивания, запуском физико-химических реакций, установлением электрического градиента. Начиная с 3 дня и во все последующие видно увеличение БЭП с включением света до середины светового дня и затем симметричное снижение до уровня, соответствующего темновому периоду. Начиная с 13 дня уровень потенциалов падает, однако все так же наблюдается волновой рост с включением света и достижение пика 75мВ в середине светового дня. В период с 13 по 35 день интенсивность процессов, связанных с изменением электрических параметров в системе почва-растение наиболее заметны из-за большой амплитуды БЭП в период «бодрствования» растительных организмов. Через некоторое время полярность меняется и верхний электрод становится электроотрицательным.
Описанная динамика БЭП в ответ на световой режим показала рост активности растения при включении света – возможно связанное с поглощением воды и движением минеральных веществ вместе с водным потоком, и постепенное угасание до начального уровня с середины светового дня. Такая волновая природа биоэлектрических потенциалов позволяет предположить наличие биоритмов и определенной «программы» метаболизма растений в ответ на освещение. Смена полярности электродов может говорить о запуске процессов выделения ризодепозитов корнями наряду с поглощением минерального питания.
Кроме длительности освещения на динамику БЭП могут влиять спектральные характеристики фотосинтетически активной радиации. Было исследовано воздействие тремя различными спектрами освещения: на образцы 1-4 смесью красного и белого света, на образцы 5-8 смесью зеленого и белого света, на образцы 9-12 смесью синего и белого света. Таким образом, в каждом варианте преобладал один из диапазонов видимого спектра – красный, зеленый или синий. Исследуемые хлорофитумы помещались в емкость высотой 80мм и диаметром 110мм. Образцы делились на контрольные без растения (1,5,9) с электродами в виде сетки из нержавеющей стали с ячейками 5х5мм и толщиной проволоки 0,7мм, содержащие хлорофитум и электроды с ячейками 5х5мм, толщиной проволоки 0,7мм (2,6,10) и повторяющие их варианты (3,7,11), а также содержащие хлорофитум и электроды с ячейками 8х8мм, толщиной проволоки 1,2мм (4,8,12). Схематичное расположение образцов показано на рисунке 4.12.
На рисунке 4.13 отражена динамика биоэлектрических потенциалов в зависимости от спектра освещения, и площади контактной поверхности с электродами. Как и в эксперименте с изучением БЭП с зависимости от глубины почвы видно уменьшение разности потенциалов со временем для контрольных образцов. На всех кривых виден аналогичные волновые изменения в начале светового дня. Предположительно рост биопотенциалов при включении освещения связан с запуском световой стадии фотосинтеза и активным движением питательных веществ из почвы в растение, однако не исключено влияние источников питания светодиодов.
Одинаковые варианты в плане условий роста и электродных систем 2 и 3, 6 и 7 схожи по динамике БЭП, но не полностью идентичны. Можно сказать, что для вариантов 4,8 с большей площадью контакта электродов и корней по вертикальной составляющей, биопотенциалы немного больше, а для 8 и стационарней.
Наличие участков с постепенным ростом БЭП, а затем резким падением, вероятно связаны с поливом, осуществляемым раз в семь дней. Такие изменения величины биопотенциалов характеризуют увеличение сопротивления почвы по мере осушения, и его уменьшение при обильном увлажнении.
Влияние на величину БЭП узких диапазонов спектра (красного и синего), а также вариантов белого света схожи (рис. 4.14). При этом генерации биопотенциалов при освещении их комбинацией практически не наблюдается.