Содержание к диссертации
Введение
I Обзор литературы 8
1. Структура органов дыхания 8
1.1 Строение стенки воздухоносных путей 9
1.2 Носовая полость, глотка и гортань 10
1.3 Трахея и бронхи 11
1.4 Лёгкие 13
1.5 Регенерация респираторного эпителия 14
2. Окислительный стресс и активные формы кислорода 18
2.1 Активные формы кислорода и свободные радикалы 18
2.2 Типы и источники активных форм кислорода и свободных радикалов 20
2.3 Действие АФК в норме 24
2.4 Повреждающее действие АФК 26
2.5 Роль АФК в патогенезе органов дыхания 28
2.5.1 Острый респираторный дистресс-синдром 29
2.5.2 Хроническая обструктивная болезнь лёгких 30
2.5.3 Ингаляционные травмы 31
2.5.4 Другие заболевания 32
3. Антиоксидантные системы в органах дыхания 34
3.1 Супероксиддисмутазы 36
3.2 Каталаза 37
3.3 Глутатионпероксидазы 37
3.4 Тиоредоксины 38
3.5 Пероксиредоксины
3.6 Пероксиредоксин 6 40
3.7 Химерные ферменты-антиоксиданты 42
4. Факторы, регулирующие процессы регенерации в эпителиальных тканях 43
5. Паракринное действие мезенхимальных стволовых клеток 45
Постановка задачи исследования 48
II Материалы и методы 50
1. Материалы 50
1.1 Реактивы 50
1.2 Ферменты-антиоксиданты 50
1.3 Белки культуральной жидкости мезенхимальных стволовых клеток 52
1.4 Токсичность экзогенных белков 53
1.5 Антитела 53
2 Методы 54
2.1 Термический ожог дыхательных путей крысы 54
2.2 Химический ожог дыхательных путей крысы 55
2.3 Эндотрахеальное введение препаратов 56
2.4 Изготовление парафиновых срезов 56
2.5 Гистологический анализ 57
2.6 Выявление муцин-секретирующих клеток 58
2.7 Иммуногистохимический анализ 58
2.8 Получение соскоба респираторного эпителия трахеи крысы 59
2.9 Определение цитокинов в соскобе трахеи крысы 59
2.10 Мечение пероксиредоксина 6 флуоресцентным красителем 60
2.11 Электрофорез белков 60
2.12 Иммуноблоттинг III Результаты 62
1. Сравнительный анализ моделей термического и химического ожогов дыхательных путей крысы 62
2. Проницаемость респираторного эпителия для экзогенных белков в норме и после химического ожога 72
3. Эффект ферментов-антиоксидантов и паракринных факторов МСК на регенерационные процессы в эпителии трахеи после химического ожога 74
4. Механизм регенерации эпителия после химического ожога 86
5. Интерлйкиновый профиль соскоба эпителия после химического ожога 89
6. Особенности регенерационных процессов в респираторном эпителии 92
6.1 Исследование эпителиальных включений в подслизистом слое трахеи 92
6.2 Идентификация клеток, входящих в замкнутые структуры подслизистого слоя 93
6.3 Определение предшественников включений в подслизистом слое 97
6.4 Новый механизм регенерации респираторного эпителия 98
IV Обсуждение 101
Выводы 105
Благодарности 106
Список литературы 1
- Носовая полость, глотка и гортань
- Острый респираторный дистресс-синдром
- Пероксиредоксины
- Белки культуральной жидкости мезенхимальных стволовых клеток
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема регенерации эпителиальных тканей является одной из ключевых при лечении различных патологических состояний, в частности, повреждения эпителия трахей, бронхов, кишечника. Выявление основных факторов, влияющих на регенерационные процессы, необходимо для создания нового класса лекарственных препаратов эндотелий-протекторного типа.
Ожоги дыхательных путей относятся к категории наиболее тяжёлых патологий, поиск путей лечения травм этого вида - одна из актуальных проблем современной медицины. В 50% случаев ожогов дыхательных путей наблюдается летальный исход. В настоящее время в терапии ожогов органов дыхания самым распространённым и практически единственным лекарственным препаратом является преднизолон - дегидрированный аналог гидрокортизона, подавляющий активность лейкоцитов и макрофагов, что приводит к снижению воспаления. Лечение этим препаратом носит неспецифический характер и сопровождается рядом побочных эффектов: остеопороз, стероидная язва желудка, диабет и изменение массы тела и психического состояния. Кроме того, лечение преднизолоном не приводит к значительному ускорению регенерации эпителиальной ткани.
Одним из поражающих факторов, сопутствующих ингаляционным и многим другим травмам, является высвобождение сверхнормального количества активных форм кислорода (АФК). Лекарственные препараты антиоксидантного действия достаточно широко распространены, их базу составляют низкомолекулярные антиоксиданты, уступающие активностью ферментам-антиоксидантам. Данная работа может стать первым шагом к созданию лекарств на основе антиоксидантных ферментов, намного более эффективных, чем применяемые в настоящий момент препараты. Супероксид-анион и гидроперекиси являются первичными типами АФК. В соответствии с этим был сделан выбор антиоксидантов, включённых в исследование: Mn-SOD, утилизирующая 02*, Ргхб, обладающий пероксидазной активностью, и химерный белок PSH, совмещающий субстратные специфичности этих двух ферментов.
Помимо минимизации повреждений, вызываемых гиперпродукцией АФК сразу после травмы, важное значение для эффективной терапии имеет максимальное ускорение регенерации ткани. Принимая во внимание имеющиеся данные о паракринных факторах мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и об их прогенераторных свойствах, мы сделали вывод о возможном позитивном эффекте этих белков на скорость регенерации респираторного эпителия.
Цель исследования. Целью данной работы является изучение эффекта, оказываемого ферментами-антиоксидантами и белками культуральной среды
мезенхимальных стволовых клеток при лечении ожоговых травм органов дыхания.
Основные задачи исследования.
-
Разработать экспериментальную модель контролируемого ожога респираторного эпителия с воспроизводимыми параметрами, определяющими степень поражения.
-
Оценить эффекты, оказываемые различными ферментами-антиоксидантами (супероксиддисмутаза, пероксиредоксин 6 и химерный белок с совмещёнными супероксиддисмутазной и пероксидазной активностями - PSH) при лечении химического ожога на модели острого респираторного поражения.
-
Оценить эффективность применения паракринных факторов мезенхимальных стволовых клеток в качестве активатора пролиферации при лечении поражений респираторного эпителия трахеи.
-
Выявить особенности регенерационных процессов в респираторном эпителии после ожоговой травмы.
Научная новизна работы. В работе показано, что химический ожог приводит к массовой гибели клеток респираторного эпителия и одновременному снижению экспрессии всех ферментов-антиоксидантов. При этом гибель клеток происходит как вследствие некроза, так и по апоптотическому пути. Проницаемость для экзогенных белков эпителия трахеи после химического ожога выше, чем в норме.
Эндотрахеальное введение супероксиддисмутазы после ожога оказывает выраженный негативный эффект на эпителий трахеи, в то время, как применение таким же способом Ргх 6 и химерного белка PSH, обладающего одновременно супероксиддисмутазной и пероксидазной активностями, привело к заметному ускорению регенерации ткани и лучшему её сохранению после ожога. Показан синергизм действия ферментов-антиоксидантов и белков культуральной жидкости МСК.
Описаны два механизма регенерации респираторного эпителия, один из них ранее исследован не был. Классический механизм заключается в пролиферации и дифференцировке базальных клеток, сохраняющихся после ожога благодаря их расположению в нижней части эпителиального слоя. Второй путь, описанный впервые, заключается в образовании в подслизистом слое замкнутых эпителиальных структур и встраивании их в респираторный эпителий. Научно-практическая ценность. Полученные результаты позволяют расширить понимание механизмов регенерации респираторного эпителия. Данные о синергизме терапевтического действия ферментов-антиоксидантов и паракринных факторов мезенхимальных стволовых клеток могут стать основой для разработки эффективного лекарственного средства для лечения повреждений эпителиальной ткани. Результаты исследования особенностей регенерации респираторного эпителия могут стать базой для нового
направления терапии ингаляционных травм.
Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на конференциях: 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА, г. Пущино, 21-26 апреля 2013 г.; Международная конференция молодых учёных Экспериментальная и теоретическая биофизика, г. Пущино, 21-23 октября 2013 г.; Стволовые клетки и регенеративная медицина, г. Москва, 18-21 ноября 2013 г.; Ломоносов-2014, г. Москва, 7-11 апреля 2014 г.; Биология - наука 21 века, г. Пущино, 21-26 апреля 2014 г.; Конгресс Европейского респираторного общества, г. Мюнхен, 6-10 сентября 2014 г.; Биология - наука 21 века, г. Пущино, 20-24 апреля 2015 г.
Носовая полость, глотка и гортань
Правое лёгкое короче и шире левого и состоит из трёх долей, в отличие от левого, имеющего две доли. Респираторный отдел осуществляет функцию газообмена. Респираторный отдел лёгкого является совокупностью ацинусов, включающие в себя бронхиолу, альвеолярные ходы и альвеолярные мешочки. Каждая бронхиола разделяется на два альвеолярных хода, а каждый альвеолярный ход переходит в два альвеолярных мешочка. Между ацинусами имеются тонкие прослойки соединительной ткани, в состав лёгочной дольки входят 12-18 ацинусов.
Эпителий альвеол лёгких представлен клетками двух типов. Альвеолоциты I типа обеспечивают газообмен и покрывают почти 95% альвеолярной поверхности, альвеолоциты II типа продуцируют лёгочный суфрактант, образующий защитную липидную плёнку на границе раздела газовой и жидкой фаз. Массовая доля липидов в суфрактанте млекопитающих составляет 90%, остальное приходится на белки [115]. Функции сурфактанта - снижение сил поверхностного натяжения альвеол и повышение эластичности лёгочной ткани. Кроме этого, сурфактант предотвращает непосредственный контакт альвеолоцитов с вредными частицами и инфекционными агентами, обволакивает пылевые частицы, регулирует количество макрофагов, мигрирующих в альвеолы из межальвеолярных перегородок, и стимулирует их активность. Сурфактант присутствует в секрете, покрывающем эпителий бронхов.
Кровоснабжение лёгких происходит при работе малого круга кровообращения, который начинается лёгочной артерией; в неё поступает кровь из правого желудочка. Затем лёгочная артерия ветвится до артериол, идущих к центрам лёгочных долек. Артериолы распадаются на капилляры, выстилающие стенки альвеол, через стенки капилляров происходит газообмен. Обогащенная кислородом кровь собирается в систему лёгочных вен и направляется в левое предсердие. В лёгких имеется вторая система кровообращения за счёт ветвей бронхиальных артерий, отходящих от аорты.
В нормальных условия скорость обновления эпителия дыхательных путей невысока и схожа со скоростью обновления эпителиоцитов кожи и кишечника. Однако в органах дыхания существуют механизмы активной регенерации, запускаемые в случае повреждения тканей и ведущие к быстрому восстановлению. Механизм регенерации эпителия дыхательных путей в последние годы является объектом пристального внимания научного сообщества. Показано, что ключевую роль в процессе регенерации играют стволовые клетки, присутствующие в респираторном эпителии. В органах дыхания грызунов базальные клетки имеются только в трахее, в то время как у человека этот тип клеток обнаружен во всех частях воздухоносных путей, включая бронхиолы [50]. Таким образом, регенерационные процессы именно в трахее крысы наиболее соответствуют процессам в воздухоносных путях человека. Базальные клетки имеют небольшой, по сравнению с другими эпителиоцитами, размер и плоскую форму. Они плотно прилегают к базальной мембране и не выходят в просвет воздухоносных путей. Благодаря этому обстоятельству, при ингаляционных травмах базальные клетки сохраняются, и, пролиферируя и дифференцируясь, дают начало новым реснитчатым, секреторным клеткам, а также клеткам Клара. Базальные клетки могут быть как унипотентными, так и мультипотентным, то есть только часть популяции клеток этого типа способна к дифференцировке в реснитчатые, секреторные клетки и клетки Клара, а также к самообновлению. Секреция базальной клеткой цитокератина 14 (К 14) является признаком наличия у этой клетки мультипотентной активности [69]. Большинство базальных клеток секретируют также цитокератин 5 (К5). При ингаляционных травмах трахеи наблюдается активная пролиферация К5- и К14-секретирующих базальных клеток. Секреция К14 возвращается в норму только спустя 14 дней после травмы, тогда как визуально эпителий трахеи мыши выглядит восстановившимся уже через 7 дней после ожога хлором. В восстановленном эпителии наблюдается возросшее по сравнению с нормой количество мукоз-секретирующих клеток. В случае нанесения ожоговой травмы достаточной для уничтожения базальных клеток силы, восстановления эпителия не происходит и развивается фиброз дыхательных путей [83].
Доказано, что клетки Клара также обладают мультипотентными свойствами, однако, в силу их расположения, при ингаляционных травмах дыхательных путей клетки Клара страдают в первую очередь. На модели ожога хлором показано, что сразу после ожога клетки Клара в эпителии практически отсутствуют, их популяция восстанавливается спустя семь дней. Количество базальных клеток в этом эксперименте не уменьшилось после ожога. Пролиферация клеток Клара не была зафиксирована, таким образом, восстановленная популяция клеток Клара произошла, вероятно, из продифференцировавшихся базальных клеток. При уменьшении мощности ожога выживает большее количество клеток Клара и их совокупный вклад в регенерацию эпителия увеличивается [100].
В бронхах грызунов, где базальные клетки отсутствуют, клетки Клара являются основным предшественником новых эпителиоцитов после ингаляционной травмы.
Существуют данные о том, что предшественниками клеток эпителия могут быть и другие типы клеток, при этом существует зависимость между типом наиболее пострадавших при травме клеток и типом клеток-предшественников. Evans, Shami и другие показали, что при массовой гибели реснитчатых клеток в результате воздействия оксида азота предшественниками новых эпителиоцитов выступают секреторные клетки. Базальные клетки в этом случае также проявили прогенераторные свойства, но их вклад оказался менее значительным [49]. Нейроэндокринные клетки, скопления которых находятся в точках ветвления воздухоносных путей, могут быть предшественниками клеток Клара, наряду с базальными клетками. Susan Reynolds и соавторы продемонстрировали это путём воздействия на крыс нафталином, что привело к массовой гибели клеток Клара [102]. Базальные клетки вносят наибольший вклад в регенерацию секреторных клеток эпителия. Интересно, что К14 секретируется базальными клетками только в трахее, но не в бронхах [53]. В бронхах больных ХОБЛ маркер пролиферации КІ67 секретируется только базальными клетками [32].
Острый респираторный дистресс-синдром
Хроническая обструкция органов дыхания - это медленно прогрессирующее и необратимое заболевание, характеризующееся недостаточным потоком воздуха в связи с ослаблением функций органов дыхания. Клинические проявления - эмфизема или хронический бронхит [67]. В этиологии ХОБЛ центральным фактором является прямое воздействие экзогенных оксидантов.
По статистике, 90% страдающих ХОБЛ курят. В бронхеальвеолярной жидкости курящих, больных ХОБЛ, обычно выявляется повышенное количество нейтрофилов. Это объясняется тем, что под действием табачного дыма происходит полимеризация актина нейтрофилов, что приводит к снижению их деформируемости. Вследствие этого нейтрофилы застревают в капиллярах лёгких и скапливаются в капиллярной сети альвеол [17]. В одной сигарете содержится около 0, 04 мкг. железа, его концентрация в бронхеальвеолярной жидкости курящих повышена. Как известно, наличие свободных ионов железа способствует образованию гидроксильного радикала и последующей деградации липидов и белков.
Наличие деструктивного дисбаланса между оксидантами и антиоксидантами в дыхательных путях больных ХОБЛ и курильщиков было показано путём идентификации повышенного уровня продуктов ПОЛ [90]. Существенная активация нейтрофилов и макрофагов в дыхательных путях при ХОБЛ свидетельствует о воспалительном процессе, сопровождающем данное заболевание. Показано, что экспрессия генов провоспалительных факторов может быть усилена избытком оксидантов. Факторы транскрипции провоспалительных цитокинов, таких, как интерлейкины 6 и 8 и фактор некроза опухоли ФНОа, являются оксидант-чувствительными [47]. Воспалительные процессы, в свою очередь, влияют на активность NO-синтаз. Как следствие, содержание оксида азота в воздухе, выдыхаемом больными ХОБЛ, туберкулёзом, инфекциями дыхательных путей увеличено относительно нормы [18].
Деструкции ткани органов дыхания способствуют и такие виды воздействия АФК, как снижение активности сурфактанта, стимуляция образования тромбоксана, повышение проницаемости эпителия, ухудшение функции ресничек [18].
Ингаляционные травмы - один из важных поражающих факторов, сопровождающий серьёзные ожоги. Повреждающее действие ингаляционных травм состоит из нескольких компонент: собственно ожог, гипоксия, вдыхание твёрдых частиц продуктов горения и токсичное воздействие вдыхаемых веществ. Таким образом, в основе ингаляционной травмы лежат термическое и химическое поражение дыхательных путей [82]. Первоначально возникшая воспалительная реакция в ответ на термический ожог усиливается прямым повреждением эпителиальных клеток токсинами. Конгломераты разрушенных клеток в комплексе с фибрином могут частично закупоривать бронхи, нарушая вентиляцию и способствуя спаданию лёгочных долей и развитию острого респираторного дистресс-синдрома [20]. Угнетение кашлевого рефлекса, а также снижение барьерной функции легких из-за повреждения бронхиального эпителия приводит к присоединению инфекции и развитию вторичных осложнений, таких как гнойный бронхит, пневмония, абсцессы легких. [7] Носовая полость, гортань и трахея обладают способностью поглощать тепло и увлажнять воздух: согласно данным Rong и др., при прохождении пути от губ до середины трахеи воздух остывает от 80-320 оС до 38-89 оС соответственно. При нанесении термической ожоговой травмы значительно усиливается кровообращение в органах дыхания, при этом температура крови у собак увеличивается на 0,5 - 2,9 градуса [105].
В большинстве случаев ожоги дыхательных путей возникают при вдыхании токсических продуктов горения. Угарный газ, проникая через мембраны альвеол, связывается с гемоглобином, блокирует его и вызывает гемическую гипоксию тканей. Показано, что гемическая гипоксия является промотором переключения окисления на менее рациональные пути, что сопровождается запуском свободно-радикальных процессов. Наибольшая концентрация продуктов ПОЛ в печени обнаружена при вдыхании токсических продуктов горения стеклопластика [19].
Показано, что у людей, подверженных воздействию поллютантов воздуха, повышен риск развития рака лёгких. Вероятно, механизм развития рака в этом случае основан на повреждении ДНК свободными радикалами, генерируемыми альвеолярными макрофагами в ответ на проникновение в слизистую частиц выхлопных газов [44].
Оксиданты могут вызывать воспаление и гиперчувствительность органов дыхания, являющиеся основными поражающими факторами астмы. У пациентов наблюдается повышенное содержание Н202 в конденсате выдыхаемого воздуха, а в клетках лёгких наблюдается увеличение концентрации супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы [108]. Экзогенные оксиданты способны вызвать обострение существующей аллергии. На модели аллергической астмы у мыши показано, что вдыхание озона усугубляет гиперчувствительность органов дыхания, повышает уровень ИЛ 5 и гранулоцитарного колоние-стимулирующего фактора, а также опосредованно вызывает увеличения срока жизни эозинофилов [62].
Бактерии туберкулёза способны сохранять жизнеспособность до нескольких дней, находясь на открытом воздухе. Это свидетельствует о наличии в них систем защиты от кислородного воздействия. Микобактерии туберкулёза обладают высокой устойчивостью к действию Н202 и гипогалогенитов, вырабатываемых фагоцитами слизистой органов дыхания. При этом функциональная активность альвеолярных макрофагов больных туберкулёзом снижена, по сравнению со здоровыми людьми. [8] Обнаружено, что бактерии туберкулёза синтезируют две изоформы SOD: Fe-SOD и Си, Zn-SOD. В структуре клеточных мембран М. Tuberculosis содержится большое количество SH-групп, что делает их устойчивыми к процессам перекисного окисления липидов. Таким образом, микобактерии туберкулёза имеют достаточно уникальную систему антиоксидантной защиты [24].
Пероксиредоксины
Химический ожог верхних дыхательных путей проводили путём выдерживания животного в атмосфере насыщенных паров соляной кислоты. Животных анестезировали с помощью анальгина, введённого внутрибрюшинно (20 мг/кг веса крысы) и спустя 15 минут помещали в эксикатор (объем 10 литров, температура воздуха - 200С) с насыщенными парами соляной кислоты на 15 минут. Для измерения рН в слизи трахеи животных декапитировали, выделяли трахею и измеряли приблизительное значение рН в слизи трахеи с помощью индикаторной бумаги (Табл. 3). Анализ рН слизи трахеи показал, что сразу после ожога насыщенными парами соляной кислоты (в пределах 5 минут) рН принимает очень низкие значения (2 - 2,5), что и является основным поражающим фактором при ожогах такого типа. В течение часа происходит возвращение рН к нормальному значению.
Растворы ферментов-антиоксидантов Ргхб, Mn-SOD и PSH, а также раствор белков, выделенных из кондиционированной среды МСК вводились непосредственно в трахею крысы после ожога. Введение проводилось посредством зонда, соединённого с пипеткой и с помощью подсветки и бинокулярной лупы вставляемого в трахею наркотизированной и зафиксированной на препарационном столе крысы (Рис. 4). Объём вводимого крысе раствора составлял 200 мкл, концентрация препарата в нём - 1 мг/мл. Аппликация раствора в трахею осуществлялась в момент вдоха, когда вход в трахею максимально раскрыт.
Выделенные образцы ткани фиксировались в фиксаторе «Mirsky s Fixative» (National Diagnostics, USA) в течение 48 часов при температуре +4С, при этом объём фиксатора в несколько раз превышал объём фиксируемой ткани. После этого образцы промывались под проточной водой в течение нескольких часов, затем промывались в смеси PBS-спирт (1:1). Далее ткани дегидратировались путём проводки через водные растворы спиртов восходящей концентрации: 70%, 80%, 96% и 100%, в каждом растворе образцы выдерживались дважды по 60 минут. После этого ткани последовательно проводились через раствор (1:1) ксилол-этанол (один раз на 30 минут) и ксилол (два раза по 60 минут).
Для заливки в парафин ткани выдерживались по 60 минут сначала в смеси ксилол-парафин (1:1), затем дважды в расплавленном парафине. Процедура проводилась в термостате при температуре 56 С (температура плавления парафина). После заливки ткани парафиновый блок оставляли остывать и затвердевать на ночь.
Изготовление срезов толщиной 2-5 мкм. осуществлялось на микротоме Thermo scientific micron НМ 325, Германия. Срезы помещались на предметные стёкла с адгезивным покрытием HistoBond (Marienfeld Laboratory Glassware, Germany) затем обсушивались и расправлялись на термостолике OTS 40 при t=42C (SMT, Germany). После этого стёкла со срезами на 10 часов помещались в шкаф для просушки при комнатной температуре.
Депарафинирование срезов на предметных стёклах проводилось посредством последовательного проведения стёкол через ксилол, спирты с убывающей концентрацией (100%, 96%, 70%) и дистиллированную воду. В каждом из растворов стёкла выдерживались по 2-5 минут. Затем на стёкла пипеткой наносили краситель эозин-гематоксилин (Hematoxylin-Eozin according to Ehrlich, Fluka, USA), оставляли на 1-2 минуты и промывали проточной водой в течение 10 минут. После этого стёкла выдерживали в дистиллированной воде в течение 1 минуты и затем снова проводили через батарею спиртов, но уже в направлении вода-ксилол. В каждом растворе стёкла держали не дольше нескольких секунд. Сразу же после этого на стёкла наносили смолу Histofluid (Marienfeld Laboratory Glassware, Germany) и накрывали покровными стеклами (Menzel-Glaser, Germany). Дальнейший анализ проводили на световом микроскопе Leica DM 6000 В, фотоснимки получены с помощью камеры Leica DFC 420 С.
Для выявления муцина и муцинсекретирующих клеток был использован краситель альциановый синий. На предварительно депарафинированные срезы наносили краситель и выдерживали 2-3 минуты. После этого предметные стёкла с окрашенными срезами промывали под струёй проточной воды в тчение 10 минут и заключали под покровное стекло. Муцин-секретирующие клетки в результате окрашивания приобрели тёмно-синий цвет. Дальнейший анализ проводили на световом микроскопе Leica DM 6000 В, фотоснимки получены с помощью камеры Leica DFC 420 С.
После депарафинирования срезов проводили блокировку 5%-ной фетальной сывороткой в течение 30-40 минут. Затем промывали в PBS трижды по 10-15 минут, наносили первичные антитела и оставляли на ночь в холодильнике (+4С). Затем снова промывали в PBS и наносили вторичные антитела. Держали 3-4 часа при комнатной температуре, затем промывали и инкубировали с субстратом к щелочной фосфатазе или к пероксидазе хрена (в зависимости от того, с чем были конъюгированы вторичные антитела). Дальнейший анализ проводили на световом микроскопе Leica DM 6000 В, фотоснимки получены с помощью камеры Leica DFC 420 С. 2.8 Получение соскоба респираторного эпителия трахеи крыс
Сразу же после выделения трахеи проводился сбор соскоба эпителия трахеи крыс. Эпителий выскабливался тонким шпателем, затем трахея промывалась физ. раствором в объёме 400 мкл, смыв использовался вместе с соскобом эпителия. После сбора соскоба эппендорф помещался в центрифугу на 10 минут при режиме 14000 оборотов. После отделения осадка смыв замораживался при температуре минус 80С до дальнейшего анализа.
После размораживания образцов соскоба эпителия трахеи проводили стандартный иммуноферментный анализ (ИФА). Образцы сорбировали на 96-луночный планшет в течение 1 часа при 37С. После четырехкратного промывания PBS, блокировали сайты неспецифического связывания 2% фетальной сывороткой, разведённой в PBS в течение 30 мин при 37С. Затем в лунки вносили кроличьи антитела к интерлейкинам ИЛ 1, ИЛ 8, ИЛ 10 и ФНОа, а также мышиные антитела к интерлейкину ИЛ 6 с разведением 1:500 в 2% растворе фетальной сыворотки в PBS. Планшет с первичными антителами оставляли на ночь при температуре +4С. Затем лунки промывали фосфатным буфером и наносили раствор антител к иммуноглобулинам мыши и кролика, конъюгированных с пероксидазой хрена в разведении 1:1000 и инкубировали в термостате при 37С в течение трёх часов. Планшет промывали, связавшиеся антитела детектировали с помощью субстрата для пероксидазы хрена - АВТС (2,2 -азинобис(3-этилбензиазолин-6-сульфоновая кислота), растворённого в цитратно-фосфатном буфере с добавлением 3% перекиси водорода. Затем измеряли оптическую плотность на мультискане при 450 нм (Labsystems Multiskan Plus, Финляндия).
Белки культуральной жидкости мезенхимальных стволовых клеток
Для того, чтобы убедиться в эпителиальной природе замкнутых структур в подслизистом слое трахеи, мы провели иммуногистохимический анализ с применением антител к а-Тубулину, содержащемуся в ресничках (Рис. 26). Анализ выявил наличие а-Тубулина в клетках включений, также как и в реснитчатых клетках респираторного эпителия, выстилающего внутреннюю поверхность трахеи. Как видно на рис. 26, реснички обнаружены во включениях разного размера. Таким образом, замкнутые структуры в подслизистом слое трахеи содержат реснитчатые клетки
Помимо реснитчатых клеток, включения содержат муцин-секретирующие клетки. Это было показано с помощью окрашивания срезов трахеи красителем альциановыи синий, выявляющим муцин и полисахариды (Рис. 27). Таким образом, была показана аналогичная респираторному эпителию клеточная композиция замкнутых структур подслизистого слоя.
В попытке определить предшественников эпителиальных включений в подслизистом слое трахеи мы провели иммуногистохимическии анализ на выявление способных к дифференцировке клеток Клара и базальных клеток в подслизистом слое. Окрашивание срезов трахеи антителами к цитокератину 5, секретируемому базальными клетками, не дало позитивного результата. Окрашивание антителами на выявление клеток Клара показало присутствие в подслизистом слое этих клеток, сгруппированных в небольшие кольцеобразные кластеры (Рис. 28). Как видно на рис. 28, группы клеток Клара соседствуют с более крупными по размеру эпителиальными структурами, в которых клеток этого типа не выявлено.
В здоровой трахее включения практически не встречаются. На первый день после ожога и аппликации в трахею фермента-антиоксиданта и белков среды МСК включения появляются в небольших количествах, на третий день число включений достигает максимума. К седьмым суткам подслизистый слой почти не содержит замкнутых эпителиальных структур. Снимки (Рис. 29) иллюстрируют встраивание эпителиальных структур в респираторный эпителий.
Пролиферация клеток Клара, обнаруженных в подслизистом слое трахеи, вероятно, простимулирована обильно содержащимися среди белков среды МСК факторами роста. Судя по всему, по этой причине мы наблюдали эпителиальные замкнутые структуры в трахее только при совместном использовании антиоксиданта и паракринных факторов мезенхимальных стволовых клеток. Под действием стимулирующих факторов группы клеток Клара разрастаются, образуя крупные конгломераты. Фактор, влияющий на активацию дифференцировки этих клеток, скорее всего, также содержится в смеси белков, выделенных из среды МСК. В данный момент мы не можем назвать его. Однако, среди белков культуральной жидкости МСК обнаружено большое количество интерлейкина 6, который выступает индуктором дифференцировки некоторых типов клеток, задействованных в иммунном ответе.
Образовавшиеся эпителиальные включения продвигаются к базальной мембране, отделяющей слизистый слой от подслизистого, и встраиваются в него. Как следствие, в респираторном эпителии появляется новый, здоровый участок. Описанный процесс является вторым путём регенерации респираторного эпителия, наряду с механизмом дифференцировки базальных клеток, сохранившихся после травмы в нижнем псевдослое респираторного эпителия (Рис. 30).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что при остром повреждении респираторного эпителия, сопровождающемся гибелью реснитчатых и секреторных клеток, происходит угнетение антиоксидантной системы, выраженное в существенном уменьшении экспрессии всех антиоксидантных ферментов. Одновременно с этим в тканях, подвергшихся разрушительному воздействию, запускается активизация продукции активных форм кислорода и развитие окислительного стресса. Таким образом, важнейшей задачей для сохранения ткани эпителия в первые сроки после ожога является восстановление антиоксидантного статуса в трахее. В данной работе для этого были применены ферменты-антиоксиданты, апплицированные непосредственно в трахею крысы после химического ожога. При этом аппликация марганцевой супероксиддисмутазы в обожжённую трахею спровоцировала ещё большие разрушения тканей стенки трахеи и гибель экспериментальных животных. С другой стороны, эндотрахеальное введение пероксиредоксина 6 оказало положительный эффект на сохранение и регенерацию эпителиальной ткани. Это означает, что именно гидропероксиды играют основную роль в разрушении эпителия.
Существует три класса ферментов, обладающих пероксидазной активностью: каталаза, глутатионпероксидазы (GSP1-GSP8) и пероксиредоксины (Prxl-Prx6). В настоящей работе были использованы Ргхб и PSH. С нашей точки зрения, выбор в качестве пероксидаз именно пероксиредоксинов является наиболее предпочтительным. Это определяется несколькими факторами:
Действительно, в экспериментах, проведенных в нашей лаборатории, была показана высокая эффективность пероксиредоксина 6 при лечении резаных ран, ишемически/реперфузионного поражения кишечника и почки, в качестве радиопротектора [12, 86]. С другой стороны, использование каталазы в качестве радиопротектора не дало никаких результатов [72, 95, 123].
Выбор второго эффективного фермента-антиоксиданта - фермента с совмещенными пероксидазной и супероксиддисмутазной активностями (PSH) - также оправдан. При создании такого химерного белка генно-инженерными методами активные центры как пероксиредоксина, так и супероксиддисмутазы остались открытыми. В результате этого полностью были сохранены как пероксидазная, так и супероксиддисмутазная активности и после эндотрахеальной инсталляции этого белка наблюдается лучшее, по сравнению со случаем применения Ргх 6, сохранение эпителия.