Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Аналитический обзор 8
1.1 Химический состав и биофизические свойства биологических мембран эритроцитов 8
1.2 Ионный состав эритроцитов и механизм регуляции ионного состава 17
1.3 Участие ионов Са2+ в регуляции биофизических свойств и состава мембран эритроцитов 27
1.3.1. Локализация ионов Са2+ в клетке и их участие в процессах функционирования клетки (в норме и при патологии) 28
1.3.2 Участие фосфоинозитидов и продуктов их метаболизма в регуляции свободного и связного кальция в крови (эритроцитах) 36
1.4 Механизмы защиты клеток при действии повышенной концентрации кальция 42
Глава 2. Объект и методы ислледования 48
2.1 Объект исследования и постановка опыта 48
2.2 Методы исследования
2.2.1 Экстрагирование фосфолипидов из мембран эритроцитов голубя 48
2.2.2 Экстрагирование полифосфоинозитидов из мембран эритроцитов голубя 49
2.2.3 Тонкослойная хроматография фосфолипидов и полифосфоинозитидов и их идентификация 50
2.2.4 Количественное определение ФЛ и ФИ 53
2.2.5 Исследование морфометрических характеристик эритроцитов голубя с помощью лазерноого интерференционного микроскопа (ЛИМ) 55
2.2.6 Изучение состояния мембран эритроцитов голубя методом спектроскопии комбинационного рассеяния з
2.2.7 Изучение повреждений ДНК эритроцитов голубя при помощи метода «ДНК-комет» 59
2.2.8 Определение внутриклеточной концентрации кальция с помощью красителя Fura Red 62
2.3 Математическая и статистическая обработка результатов 64
Глава 3. Результаты и обсуждения 65
3.1 Исследование изменений внутриклеточной концентрации Са2+ в эритроцитах 65
3.2 Исследование фосфолипидного и фосфоинозитидного состава мембран эритроцитов при действии повышенной концентрации ионов Са2+ 3.2.1 Исследование фосфолипидного состава мембран эритроцитов 68
3.2.2 Исследование содержания фосфоинозитидов и их метаболитов в мембране эритроцитов при действии повышенной концентрации ионов Са2+ 76
3.2.3 Исследование свойств фосфолипидов с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния 79
3.3 Исследование морфологических характеристик эритроцитов и свойств гемоглобина при действии повышенной концентрации ионов Са2+ 83
3.3.1 Исследование морфологических характеристик эритроцитов с помощью лазерной интерференционной микроскопии 83
3.3.2 Исследование свойств и распределения гемоглобина в эритроцитах голубя при действии высокой концентрации ионов Са2+ 89
3.4 Повреждение клеточного ядра эритроцитов голубя при действии повышенной концентрации ионов Са2+ 93
Заключение 100
Выводы 102
Список сокращений и условных обозначений 103
Список использованных источников 104
- Локализация ионов Са2+ в клетке и их участие в процессах функционирования клетки (в норме и при патологии)
- Участие фосфоинозитидов и продуктов их метаболизма в регуляции свободного и связного кальция в крови (эритроцитах)
- Изучение повреждений ДНК эритроцитов голубя при помощи метода «ДНК-комет»
- Исследование свойств фосфолипидов с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния
Локализация ионов Са2+ в клетке и их участие в процессах функционирования клетки (в норме и при патологии)
Деформируемость эритроцитов – одно из наиболее важных свойств этих клеток. Форма эритроцитов в конечном итоге определяется мембранными белками, особенно спектрином, а также зависит и от содержания липидов в плазматической мембране. Эритроциты могут поддерживать свою форму, но проходя через узкие капилляры они перестраивают свой скелет, а затем снова восстанавливают его. Липиды имеют решающее значение в поддержании формы эритроцита. (Pasini E.M., Kirkegaard M., Mortensen P. [et al.] In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells // Blood. 2006. Vol. 108. Р. 791-801).
Липиды, входящие в состав мембраны, образовывают специальные мембранные домены. Полярные группы этих доменов взаимодействуют с водой и другими полярными группами, что приводит к стабильности в водной среде. Липиды в доменах как правило обогащены насыщенными углеводородными цепями (Simons K., Sampaio J.J. Membrane Organization and Lipid Rafts // Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011. Vol. 3. Iss. 10. P. 1-17). Размеры липидных доменов ниже предела разрешения светового микроскопа и могут бы зарегистрированы с помощью электронной микроскопии (Pike J.L. Lipid rafts: bringing order to chaos // Journal of Lipid Research. 2003. Vol. 44. P. 655 12 667). Данные структуры обладают высоким уровнем организации и обогащены холестерином и гликосфинголипидами с насышенными жирнокислотны-ми остатками (Han B.G., Nunomura W., Takakuwa Y. [et al.] Protein 4.1R core domain structure and insights into regulation of cytoskeletal organization // Natural Structural Biology. 2000. Vol. 7. Iss. 10. P. 871-875). В структуру доменов входят белки. Основными мембранными белками в их составе являются стома-цин, flotillin-1 и flotillin-2, белки группы 4.1 и 4.2 могут быть частично связанны с мембранными доменами (Pike J.L. Lipid rafts: bringing order to chaos // Journal of Lipid Research. 2003. Vol. 44. P. 655-667; Salzer U., Prohaska R. Sto-matin, flotillin-1 and flotillin-2 are major integral proteins of erythrocyte lipid rafts // Blood. 2001. Vol. 97. Iss. 4. P. 1141-1143).
Липидные домены играют специфическую роль в сигнализации клеток. В последние годы было показано, что эти домены играют важную роль в регуляции паразитных иинфекций, например, таких как малярийная инфекция (Samuel B.U., Mohandas N., Harrison T. [et al.] The role of cholesterol and glyco-sylphosphatidylinositol-anchored proteins of erythrocyte rafts in regulating raft protein content and malaria infection // The Journal of Biological Chemistry. 2001. Vol. 276. Iss. 31. P. 29319-29329; Murphy C.S., Hiller L.N., Harrison T. [et al.] Lipid rafts and malaria parasite infection of erythrocytes // Molecular Membrane Biology. 2006. Vol. 23. Iss. 1. P. 81-88).
Одним из важных свойств мембраны является её текучесть. Текучесть мембран зависит от свойств фосфолипидов, а именно таких как класс фосфо-липидов, степень насыщенности жирных кислот, длина ацильных цепей, типа холестерина (свободный или связный), а также от наличия или отсутствия амфипатичных соединений (Халилов Э.М., Ли В.С., Азизова О.А. [и др.] Структурно-функциональный анализ мембран эритроцитов с различным содержанием холестерина // Вопр. мед. химии. 1982. Т. 28. Вып. 1. С. 81-86; Ли В.С., Халилов Э.М., Сабуров В.И. [и др.] Липидный состав и структурно-функциональные свойства мембран эритроцитов разного возраста // Вопр. мед. химии. 1982. Т. 28. Вып. 6. С. 66-71; Горшинская И.А., Глотина Л.Ю., Горло Е.И. [и др.] Изменение микровязкости мембран лимфоцитов и эритроцитов крови у онкологических больных // Вопр. мед. химии. 1999. Т. 45. Вып. 1. С. 53-57; Бордюшков Ю.Н., Горошинская И.А., Франциянц Е.М. [и др.] Структурно-функциональные изменения мембран лимфоцитов и эритроцитов под воздействием переменного магнитного поля //Вопр. мед. химии. 2000. Т. 46. Вып. 1. С. 72-80). Например, увеличение коэффициента насыщенности жирных кислот ведет к нарушению упаковки липидного бислоя, тем самым, повышая его текучесть. Состав жирных кислот в мембране эритроцитов млекопитающих имеет огромное влияние на клеточную агрегацию.
По мимо липидов в состав мембраны входят белки. Белки плазматической мембраны можно разделить на два вида:
1) белки, которые можно легко отделить от плазматической мембраны, так называемые периферические белки, например спектрин;
2) вторую группу белков представляет белки полосы 3 (Кленова Н.А., Кленов Р.О. Строение, метаболизм и функциональная активность эритроцитов человека в норме и патологии / Самара.: Изд-во Самарский университет. 2009. 116 с.). Их трудно отделить от мембраны, так как они пронизывают мембрану насквозь. Данный класс белков называется – интегральными.
Как было сказано выше, белок полосы 3 – это интегральный белок, который представляет собой гликопротеид с молекулярной массой 90-100 кДа. В мембране этот белок образует анионный канал, по которому происходит избавление эритроцита от СО2, и обогащение эритроцита Cl-. Полипептидная цепь данного белка пронизывает мембрану несколько раз. N-конец белка связан с гликолитическими ферментами, гемоглобином, актином. Белок полосы 3, также как и спектрин, имеет олигомерную структуру, которая дает возможность связываться с другими белками. 70% белка полосы 3 в мембране эритроцитов является димером, около 30% – тетрамером. Тетрамерная форма белка в основном связывает белок 4.2 (Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. [и др.] Молекулярная биология клетки / М.: Мир, 1994. 538 с.; Saldanha C., Silva A.S., Gonalves S. [et al.] Modulation of erythrocyte hemorheological properties by band 3 phosphorylation and dephosphorylation // Clinical Hemorheology and Microcirculation. 2007. Vol. 36. P. 183-194).
Одним из представителей интегральных белков можно считать глико-форины. Данные белки имеют отрицательный заряд, который в основном сосредоточен на сиаловых остатках, присущих гликофорину А. Отрицательный заряд играет решающее значение в реализации взаимодействия эритроцит-эритроцит и в взаимодействии эритроцита с сосудами (Telen M.J. Erythrocyte adhesion receptors: blood group antigens and related molecules // Transfusion Medicine Reviews. 2005. Vol. 19. Iss. 1. P. 32-44).
Важную роль в эритроцитарных мембранах играют белки цитоскелета. Белки цитоскелета прикрепляются к мембране посредством белок-белковых взаимодействий. Основные мембранные белки, которые отвечают за прикрепление цитоскелета к мембране, это белок полосы 3 и гликофорин С и D. Важно отметить, что не только белок-белковые взаимодействия влияют на связывание цитоскелета с мембранным слоем. Определнный влад вносят и белок-липидные взаимодействия, например, спектрин-липидные взаимодействия в основном с ФЭА (Кленова Н.А., Кленов Р.О. Строение, метаболизм и функциональная активность эритроцитов человека в норме и патологии / Самара.: Изд-во Самарский университет. 2009. 116 c.).
Участие фосфоинозитидов и продуктов их метаболизма в регуляции свободного и связного кальция в крови (эритроцитах)
Тонкослойная хроматография (ТСХ) является превосходным методом для микроаналитического исследования мембран. При правильном подборе смеси растворителей и определенных условиях с помощью ТСХ разделяются практически все классы липидов, а специальные реагенты, применяемые после хроматографии, позволяют идентифицировать липиды. Еще одной особенность данного метода является то, что с помощью ТСХ можно разделить от нескольких микрограммов до нескольких граммов исследуемого вещества.
Для хроматографического разделения ФЛ и ФИ использовали готовые пластинки HPTLC Silikagel 60 F254 (Merck, Германия) размером 20х10 см. Перед использованием пластинки помещали в камеру со смесью растворителя хлороформ : метанол (2:1, v/v), и извлекали из камеры когда от фронта растворителя до верхнего края пластины оставалось 0,3 см. После чего пластинки сушили до исчезновения запаха растворителя и прогревали в течение 20 мин при температуре 110–120 0С.
Образцы ФЛ, предназначенные для разделения наносили в виде полосы по 15 мкл на расстоянии 1 см от нижнего края пластины с помощью автоматического автосемплера Automatic TLC – Sampler 4 (Gamag, Швейцария). На одной пластине размещали до 8 образцов. Для одномерного разделения ФЛ хроматографию проводили в системе растворителей следующего состава: хлороформ : метанол : ледяная уксусная кислота : вода (50:25:8:4, v/v) (Си-корская А.С., Назарова А.А., Селеменев В.Ф. Подбор условий разделения фосфолипидных комплексов, полученных из семян подсолнечника // Сорб-ционные и хроматографические процессы. 2009. Т. 9. Вып. 2. С. 215-220). Разделение проводили в хроматографической камере 20х20 см. Стенки камеры выстилали изнутри фильтровальной бумагой, которую пропитывали растворителем для ускорения насыщения камеры. Систему растворителей в камере готовили, по крайней мере, за 1 час до проведения хроматографии, для чего в нее заливали достаточное количество растворителя. Обязательным условием хроматографирования является герметичность камеры. В одну камеру одновременно помещали не более двух пластинок, причем так, чтобы поверхность подложки была обращена в сторону выстилающей камеру бумаги, а слои адсорбента находились на максимальном удалении друг от друга. Разделение заканчивали, когда от фронта растворителя до верхнего края пластины оставалось 0,5 см. Пластину вынимали из камеры и высушивали до исчезновения запаха растворителей.
Для разделения ФИ использовали систему растворителей состоящую из следующих растворителей: хлороформ : метанол : аммиак : вода (48:40:5:10, v/v) (Финдлей Дж., Эванз Э. Биологические мембраны. Методы. М. : Мир. 1990. 424 с.). Образцы ФИ наносили в количестве 20 мкл на пластинки в виде полосы длинной 1 см, разделение проводили аналогично с разделением ФЛ.
Основным компонентом метаболизма ПФИ является диацилглицерол (ДАГ). Накопление ДАГ анализировали методом ТСХ анализа в системе растворителей гептан : диэтиловый эфир : ледяная уксусная кислота (60:40:2 v/v) (Финдлей Дж., Эванз Э. Биологические мембраны. Методы. М. : Мир. 1990. 424 с.).
Для обнаружения ФЛ и ФИ использовали метод, основанный на окрашивании их парами йода, он удобен благодаря своей быстроте, универсальности и отсутствию разрушающего действия на липиды (Финдлей Дж., Эванз Э. Биологические мембраны. Методы. М. : Мир. 1990. 424 с.).
Высушенные пластины помещали в эксикатор, содержащий кристаллы йода, который заранее готовили и держали в теплом месте для насыщения его парами йода. Окрашивание длилось от нескольких минут до нескольких часов в зависимости от количества ФЛ. ФЛ и ФИ обнаруживались в виде коричнево-желтых пятен или полос, которые осторожно очерчивали мягким карандашем или обкалывали иглой.
Также обнаружение разделенных ФЛ и ФИ проводили, используя универсальный реактив Васьковского (Васьковский В.Е. Состав и обмен полярных липидов морских организмов : дис. … д-р. биол. наук : Владивасток., 1984. 323 с.; Кадималиев Д.А. Изучение липидного состава в соматических нервах при возбуждении : дис. … канд. биол. наук : Москва, 1985. 155 с.; Ре-вин В.В., Ревина Э.С., Девяткин А.А., Громова Н.В. Роль липидов в функционировании возбудимых биологических мембран. Саранск. : Изд-во Мордов. ун-та. 2012. 220 с.). Для этого получали исходный реагент А: к 10 г натрия молибденовокислого в 60 мл 4Н HCI добавляли 0,4 г солянокислого гидразина в 14 мл 4Н HCl. Смесь нагревали на водяной бане в течение 20 мин, охлаждали, добавляли 14 мл концентрированной серной кислоты и доводили объем до 100 мл дистиллированной водой. Используемый для количественного определения ФЛ реагент В готовили следующим образом: к 4 мл исходного реагента А добавляли 26 мл 1Н серной кислоты. Доводили объем до 100 мл дистиллированной водой. Для опрыскивания пластин готовили реагент С, добавляя к 1 объему исходного реагента А 7 объемов 7Н серной кислоты. Пятна ФЛ и ФИ на пластинке окрашивались в голубой цвет.
Для обнаружения аминосодержащих ФЛ использовали нингидриновый реактив (Финдлей Дж., Эванз Э. Биологические мембраны. Методы. М. : Мир. 1990. 424 с.). Хроматографические пластинки опрыскивали 0,25 % раствором нингидрина в ацетоне. Аминосодержащие липиды обнаруживались в виде розово-фиолетовых пятен через 1-2 часа при комнатной температуре и через 15 мин при нагревании до 100 0С.
Холинсодержащие ФЛ обнаруживали с помощью реагента Драгендор-фа, который готовили следующим образом (Финдлей Дж., Эванз Э. Биологические мембраны. Методы. М. : Мир. 1990. 424 с.): раствор 1: 1,72 г нитрата висмута растворяли в 100 мл 20% ледяной уксусной кислоты; раствор 2: 10 г йодистого калия растворяли в 25 мл воды; 20 мл раствора 1 и 5 мл раствора 2 смешивали с 70 мл дистиллированной воды.
Пластинки перед опрыскиванием тщательно сушили. Пятна после опрыскивания пластин окрашивались в оранжевый цвет. Для ускорения окрашивания пластинку нагревали до температуры 100 0С.
Изучение повреждений ДНК эритроцитов голубя при помощи метода «ДНК-комет»
В контрольном варианте опыта значение данного показателя практически не изменялось с течением времени (рисунок 3.11). В опыте с повышенной концентрацией кальция в среде инкубирования значение данного параметра в начальный момент времени инкубирования было на 7 % больше относительно контрольного значения.
10 мин инкубация приводила к увеличению данного отношения на 14% по сравнению со значением в контрольном образце. Однако, при увеличении времени инкубации до 20 мин значение отношения интенсивности при 1650 см-1 и 1450 см-1 уменьшается и становится меньше на 12 % относительно контроля. При максимальном времени инкубирования значение данного показателя практически соответствует контрольному уровню.
Как известно, ионы Са2+ могут связываться с двумя соседними отрицательными головками фосфолипидов и образовывать «некий» кластер, тем самым ионы Са2+ инактивируют процессы флип-флоп перехода и делают мембрану менее подвижной (Bogdanova A., Makhro A, Wang J. [et al.] Calcium in Red Blood Cells – A Perilous Balance // International Journal of Molecular Sciences. 2013. Vol. 14. P. 9848-9872). В результате этого процесса мембрана эритроцитов становиться менее эластична и вязкость липидного бислоя увеличивается, о чем свидетельствует уменьшение отношения интенсивностей при 2885 и 2845 см-1, то есть происходит уменьшение латеральных взаимодействий.
Из полученных данных можно утверждать, что при увеличении времени инкубации эритроцитов в среде с повышенной концентрацией ионов Са2+ в клетке меняется степень насыщенности жирных кислот мембраны. Из литературы известно, что от количества насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в структуре мембраны зависит текучесть липидного бислоя (Боровская М.К., Кузнецова Э.Э., Горохова В.Г. [и др.] Структурно-функциональная характеристика мембраны эритроцита и ее изменения при патологиях разного генеза // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2010. №3 (73). С. 334-354) и исходя из полученных результатов можно сделать вывод о том, что мембрана клетки становиться менее текучей, то есть вязкость липидного бислоя увеличивается. Можно предположить, что такой характер изменений зависит прежде всего от концентрации свободных ионов Са2+. Поскольку при увеличении времени инкубирования содержание ионов Са2+, находящихся в свободном состоянии, уменьшается, что ведет за собой уменьшение активности процессов, которые были вызваны свободными ионами Са2+. Тем самым снижается действие Са-зависимых ферментов, которые вызывают изменения структуры и свойств фосфолипидного бислоя.
Полученные ранее результаты свидетельствуют о том, что действие высоких концентраций ионов Са2+ приводит к изменению состава ФЛ. Такие изменения не могут не влиять на морфологические характеристики эритроцита. Поэтому необходимо было также выяснить, насколько действие высокой концентрации кальция может влиять на морфологические показатели эритроцитарных клеток.
Анализ морфометрических показателей проводили с помощью метода ЛИМ. Данный метод позволяет получать высококонтрастные изображения эритроцитов без обработки их красителем. Другие разновидности микроскопии, например, различные фазово-контрастные методы обладают сходными возможностями, однако ЛИМ позволяет также количественно с высокой точностью оценивать фазовую высоту (параметр пропорциональный произведению толщины образца на его показатель преломления) объектов. Такие возможности позволяют считать ЛИМ некоторым «бесконтактным» аналогом зондовых микроскопов. Оценив фазовую высоту можно, дополнительно, при выполнении ряда условий, рассчитать такие характеристики клетки как объем, концентрацию и количество вещества в клетке (Brazhe A.R. Brazhe N.A. Non-invasive study of nerve fibres using laser interference microscopy // Phil. Trans. R. Soc. A. 2008. Vol. 366. Р. 3463-3481).
Мы изучали влияние высокой концентрации кальция в среде инкубирования и действие флавоноидов на такие морфологические параметры эритроцитов как площадь и ОРХ (рисуноки 3.12 и 3.13). На графиках представлен средний результат обсчета более 100 клеток.
Как можно видеть из представленных графиков, площадь эритроцитов контрольного образца составляет 360 мкм2 (рисунок 3.12). При добавлении в суспензию эритроцитов раствора СаCl2 10 мин приводила к незначительному уменьшению площади эритроцитов в пределах погрешности. При увеличении времени инкубации до 20 мин происходит дальнейшее уменьшение площади, которое составило 84,6% от контрольного значения. Значение площади при увеличение времени инкубации до 30 мин возрастало и становилось сравнимым с контрольным значением.
В варианте опытов с флавоноидами также происходило изменение площади эритроцитов, однако они были менее значительными. Так по истечении 20 минутной инкубации значение площади в опыте с кальцием и фла-воноидами было на 8,4% меньше относительно данного параметра в контрольном образце. При увеличении времени инкубации до 30 минут площадь в опыте с флавоноидами и кальцием не изменялась.
На следующем этапе определяли ОРХ, значение которого позволяет судить о распределении внутриклеточного вещества и говорить о толщине эритроцита, так как этот параметр прямо пропорционален произведению показателя преломления и толщины объекта.
Исследование свойств фосфолипидов с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния
В предыдущих сериях опытов нами установлено, что кальций вызывает изменения состава, состояния и морфологических характеристик эритроцитов. Известно, что ионы Са2+ принимают активное участие в реализации программируемой гибели клетки, при которой происходит разрушение клеточного ядра (Самуилов В.Д. Программируемая клеточная смерть у растений // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7. № 10. С. 12-17; Манских В.Н. Пути гибели клетки и их биологическое значение // Цитология. 2007. Т. 49. № 11. С. 909-915; Tirodkar T.S., Voelkel-Johnson C. Sphingolipids in apopto-sis // Experimental Oncology. 2012. Vol. 34. Iss. 3. P. 231-241). Поэтому следующим шагом нашего исследования явилось изучение состояния клеточного ядра при действии ионов Са2+ методом флуоресцентной микроскопии. Для наших исследований мы использовали краситель Хекст 3342 (Sigma Aldrich, США), который хорошо подходит для анализа повреждений клеточного ядра. При клеточной гибели нарушается проницаемость плазматической мембраны и данный краситель без проблем проникает в клетку и накапливается в ней, тем самым в клетках, подверженных клеточной гибели, интенсивность флуоресценции данного красителя будет выше по сравнению с клетками, в которых программа клеточной гибели не запущена.
Микрофотография ядер эритроцитов, окрашенных при помощи флуоресцентного красителя, которые подверглись действию высокой концентрации ионов Са2+, представлена на рисунке 3.17.
Можно видеть, что ядра эритроцитов голубя имеют овальную форму. При инкубации в условиях повышенной концентрации кальция запускаются процессы, связанные с деструкцией мембранного слоя, что способствует накоплению красителя в клетке. В клетках, мембрана которых повреждена, ядра эритроцитов имеют более интенсивную флуоресценцию по сравнению с клетками, мембрана которых осталась целой.
Ядра эритроцитов под действием высоких концентраций ионов Са2+ изменяют свою форму, становятся более округлыми, кроме того ядра могут фрагментироваться. Для количественной оценки поврежденных клеток использовали расчет апоптотического индекса (АИ), который показывает отношение поврежденных клеток к общему числу клеток (Logsdon M.D., Raymond E.M., Besa P.C. [et al.] Apoptosis and the BCL-2 gene family - patterns of expression and prognostic value in STAGE I and II follicular center lymphoma // International Journal of Radiation Oncology. 1999. Vol. 44. Iss. 1. P. 19–29; Залесский В.Н., Великая Н.В. Методы ранней диагностики апоптоза in vitro и in vivo для оценки хронических эффектов токсикантов // Современные проблемы токсикологии. 2006. 1. С. 78-82). Расчеты апоптотического индекса представлены на рисунке 3.18.
Как видно из расчета АИ, в контрольном образце практически не наблюдаются поврежденные клетки, причем увеличение числа поврежденных клеток не превышало 15%. В опытном образце количество поврежденных клеток увеличивалось, максимальное увеличение количества поврежденных клеток наблюдалось при 30 мин инкубации. Однако дальнейшее увеличение времени инкубирования приводило к уменьшению количества поврежденных клеток. Это можно объяснить тем, что только свободные ионы Са2+ могут участвовать в запуске ферментативных реакций, которые способствуют разрушению мембраны. При увеличении времени инкубирования, концентрация ионов Са2+, способных участвовать в реакциях, уменьшается из-за того, что ионы Са2+ будут вовлекаться в реакцию и переходить в связанное состояние. Соответственно будет уменьшаться количество поврежденных клеток, что мы и наблюдали.
Из литературы известно, что при реализации программируемой клеточной гибели эритроциты голубя избавляются от ядра (Девяткин А.А., Ре-вин В.В., Юданов М.А. [и др.] Выброс клеточного ядра из эритроцитов голубя и состояние мембранных липидов при воздействии пероксидом водорода // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. Т. 141. № 2. С. 225-228). Поэтому на следующем этапе нашей работы мы исследовали повреждения клеточного ядра методом «ДНК-комет» (Comet Assay), который хорошо подходит для изучения повреждений ДНК одиночных клеток.
На рисунке 3.19 представлены фотографии «комет», полученных от ядер эритроцитов контрольного образца и образца, инкубируемого в среде с повышенной концентрацией ионов Са2+. Из полученных фотографий «комет» видно, что «кометы», полученные из контрольной пробы практически не имеют «хвоста» и у них крупная «голова» (рисунок 3.19 а).
«Кометы», полученные из проб, инкубируемых в условиях повышенной концентрации ионов Са2+, имеют каплеобразный вид (рисунок 3.19 б). У них практически отсутствует «голова» и наблюдается широкий диффузный «хвост». Такой вид кометы наблюдается из-за того, что клеточное ядро разрушилось на мелкие фрагменты, составляющие «хвост». Данный вид «комет» характерен для апоптотических клеток (Сорочинская У.Б., Михайленко В.М. Применение метода ДНК-комет для оценки повреждений ДНК, вызванных различными агентами окружающей среды // Онкология. 2008. Т. 10. № 3. С. 303-309).
Для количественной оценки повреждений молекул ДНК в ядрах эритроцитов использовали такой параметр как %ДНК (процент ДНК в «хвосте» кометы). Результаты расчета данного параметра представлены на рисунке 3.20.
В пробах, инкубируемых с раствором кальция, при 10 мин инкубации процент ДНК в хвосте «кометы» превышал контрольное значение на 21,3% (рисунок 3.20). Наибольшее изменение было зарегистрировано при 20 мин инкубации. При 20 мин инкубации %ДНК в опытной пробе был 23,8 % выше контрольного уровня. После 30 мин инкубации значение процентного содержания ДНК в хвосте «кометы» уменьшалось и приближалось к контрольному значению. Такую зависимость можно объяснить тем, что в начальный момент инкубации концентрация свободных ионов Са2+ в растворе была максимальна и, соответственно, активация процессов гибели клеток шла более интенсивно. Однако, при увеличении времени инкубации все большее количество свободного кальция, возможно, переходит в связанное состояние, тем самым активная концентрация кальция снижается и процесс разрушения клеток затормаживается.
Каплеобразный вид комет, полученный в ходе эксперимента, указывает на то, что клетки инкубируемые с раствором кальция погибают за счет активации программируемой клеточной гибели. На существование подобного механизма указывает дальнейшая активация Са-зависимых ферментов, играющих ключевую роль в реализации программы клеточной гибели (Suzuki J., Umeda M., Sim P.J. [et al.] Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F // Nature. 2010. Vol. 468. P. 834-838; Hivotovsky B., Orrenius S. Calcium and cell death mechanisms: A perspective form the cell death community // Cell Calcium. 2011. Vol. 50. P. 211-221).