Влияние глутоксима и моликсана на внутриклеточную концентрацию Са2+ в макрофагах: роль каскада метаболизма арахидоновой кислоты и актинового цитоскелета Наумова Александра Андреевна

Содержание к диссертации

Введение

2. Обзор литературы 11

2.1. Механизмы кальциевой сигнализации в невозбудимых клетках 11

2.1.1. Са2+ - универсальный вторичный посредник в живых клетках 11

2.1.2. Механизмы мобилизации ионов Са2+ из внутриклеточных депо 14

2.1.2.1. Са2+-депо невозбудимых клеток 14

2.1.2.2. Фосфоинозитидный путь передачи сигнала 17

2.1.2.3. Са2+-каналы, активируемые инозитол-1,4,5-трифосфатом 18

2.1.3. Депо-зависимый вход Са2+ в клетку 20

2.1.3.1. Модели депо-зависимого входа Са2+ 22

2.1.3.2. Биофизические характеристики депо-зависимых Са2+-каналов 29

2.1.3.3. Молекулярная природа депо-зависимых Са2+-каналов 29

2.2. Арахидоновая кислота и продукты её метаболизма 35

2.2.2 Каскад метаболизма арахидоновой кислоты 41

2.2.2.1. Циклооксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты 44

2.2.2.2. Липоксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты 46

2.2.2.3. Эпоксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты 49

2.2.3. Ингибиторы каскада метаболизма арахидоновой кислоты 51

2.3. Структурно-функциональная организация актинового цитоскелета 62

л л л ул 1 /С С

2.3.3. Актин-связывающие белки 67

2.3.3.2. Структура и функции белков WASP

2.4. Механизмы редокс-регуляции в клетке

2.4.1. Система глутатион/окисленный глутатион (GSH/GSSG) - основная

2.5. Заключение по обзору литературы и постановка задачи исследования.. 90

3. Материалы и методы исследования

3.1. Объект исследования

3.2. Растворы помощью

3.3. Измерение внутриклеточной концентрации Са флуоресцентного Са -зонда Fura-2AM

3.3.1. Экспериментальная установка на базе люминесцентного микроскопа «Люмам-КФ» 94

3.3.2. Экспериментальная установка на базе флуоресцентного микроскопа Leica DM 4000В 96

4. Результаты и обсуждение 99

4.1. Влияние препаратов глутоксим и моликсан на внутриклеточную концентрацию Са + в макрофагах 99

4.2. Влияние ингибиторов фосфолипаз А2 на Са2+-ответы, вызываемые глутоксимом и моликсаном

4.3. Влияние ингибиторов циклооксигеназ на Са2+-ответы, индуцируемые глутоксимом и моликсаном

4.4. Влияние ингибиторов липоксигеназ на Са2+-ответы, вызываемые глутоксимом и моликсаном

4.5. Влияние ингибиторов эпоксигеназ на Са2+- ответы, индуцируемые глутоксимом и моликсаном

4.6. Влияние ингибиторов актин-связывающих белков на Са2+-ответы,

вызываемые глутоксимом и моликсаном в макрофагах

Возможная роль каскада метаболизма арахидоновой кислоты и актинового цитоскелета в действии глутоксима и моликсана на внутриклеточную концентрацию Са в макрофагах 134

5. Общее заключение 141

6. Выводы 145

Список литературы 1

• Са2+ - универсальный вторичный посредник в живых клетках
• Молекулярная природа депо-зависимых Са2+-каналов
• Измерение внутриклеточной концентрации Са флуоресцентного Са -зонда Fura-2AM
• Влияние ингибиторов липоксигеназ на Са2+-ответы, вызываемые глутоксимом и моликсаном

Введение к работе

Актуальность исследования. Фундаментальным регуляторным

механизмом в живой клетке является редокс-регуляция передачи сигналов и экспрессии генов (Filomeni et al., 2002; Biswas et al., 2006). Ведущая роль в редокс-регуляции и поддержании редокс-статуса клетки принадлежит системе глутатион/ окисленный глутатион (GSH/GSSG). GSH (-L-глутамил-L-цистеинил-L-глицин) является одним из ключевых внутриклеточных антиоксидантов (Biswas et al., 2006). Содержание GSSG в цитозоле повышается в условиях окислительного стресса, что послужило основанием рассматривать его как агрессивную молекулу. Однако было показано, что GSSG может оказывать рецептор-опосредованное действие на внутриклеточные процессы (Filomeni et al., 2002; Townsend et al., 2008).

В настоящее время на основе GSSG синтезирован ряд фармакологических препаратов, которые характеризуются иммуномодулирующим и системным цитопротекторным эффектами (Borisov et al., 2001; Жуков и др., 2004). К этой группе препаратов относятся глутоксим (динатриевая соль GSSG с d-металлом в наноконцентрации, «ФАРМА-ВАМ», Санкт-Петербург) и моликсан (комплекс глутоксима с нуклеозидом инозином, «ФАРМА-ВАМ»). Несмотря на широкое использование этих лекарственных препаратов в медицинской практике, клеточные и молекулярные механизмы их действия остаются во многом не изученными.

Одной из основных мишеней действия глутоксима и моликсана являются такие иммунокомпетентные клетки, как макрофаги (Еремеев, Гергерт, 2013). Ранее на кафедре биофизики Санкт-Петербургского государственного университета (СПбГУ) было впервые показано, что GSSG, глутоксим и моликсан вызывают увеличение внутриклеточной концентрации Са²⁺, [Ca²⁺]i, связанное с мобилизацией Са²⁺ из внутриклеточных тапсигаргин-чувствительных Са²⁺-депо и последующим депо-зависимым входом Са²⁺ в перитонеальные макрофаги крысы (Крутецкая и др., 2007; Курилова и др., 2008, 2011а, б). Установлено также, что во влиянии глутоксима и моликсана на [Ca²⁺]i в макрофагах принимают участие такие сигнальные молекулы, как тирозинкиназы и тирозинфосфатазы (Крутецкая и др., 2007; Курилова и др., 2008), фосфатидилинозитолкиназы (Крутецкая и др., 2008), ключевые ферменты фосфоинозитидного пути передачи сигнала фосфолипаза С и протеинкиназа С (Крутецкая и др., 2009), элементы цитоскелета (Крутецкая и др., 2011; Курилова и др., 2012а, б; Крутецкая и др., 2013; Kurilova et al., 2013; Миленина и др., 2014), рецепторы, ассоциированные с гетеротримерными G-белками (Krutetskaya et al., 2014) и малые G-белки суперсемейства Ras (Крутецкая и др., 2014).

В ходе иммунного ответа активированные фагоциты продуцируют большие количества свободной арахидоновой кислоты (АК), которая высвобождается из мембранных липидов с участием фосфолипаз А₂ (ФЛА₂) и далее окисляется в клетке по трём основным ферментативным путям с участием циклооксигеназ, липоксигеназ и цитохром Р-450-подобных эпоксигеназ (Needleman et al., 1986; Lapetina, 1990; Крутецкая, Лебедев, 1993; Dennis et al., 2011). Продукты метаболизма АК (эйкозаноиды) - это вторичные посредники, которые участвуют в регуляции воспаления, аллергических реакций и целого ряда других физиологических функций клеток и тканей (Needleman et al., 1986; Lapetina, 1990).

Воздействие на макрофаги внеклеточных стимулов также приводит к динамичным перестройкам актинового цитоскелета. Актиновые филаменты участвуют в таких функциях макрофагов, как хемотаксис, фагоцитоз и презентация антигенов (Rougerie et al., 2013). Ранее на кафедре биофизики СПбГУ было впервые выявлено, что актиновые филаменты участвуют в формировании Са²⁺-ответов, индуцируемых глутоксимом и моликсаном в перитонеальных макрофагах крысы (Крутецкая и др, 2011; Курилова и др, 2012б). Морфологические исследования показали, что глутоксим и моликсан вызывают реорганизацию актинового цитоскелета в макрофагах (Курилова и др, 2012б; Kurilova et al., 2013).

Ключевым участником процессов полимеризации и ветвления микрофиламентов является комплекс белков Arp 2/3 (actin-related proteins; белки, связанные с актином), который, в свою очередь, активируется белками WASP (Wiskott – Aldrich syndrome proteins; белки синдрома Вискотта - Олдрича) (Pollard, Borisy, 2003; Rougerie et al., 2013).

Известно также, что каскад метаболизма АК и такие элементы актинового цитоскелета, как актин-связывающие белки, играют важную роль в сигнальных процессах с участием ионов Са²⁺ в различных типах клеток (Peppelenbosch et al., 1992; Joseph et al., 2014). Однако оставалось неизвестным, задействованы ли эти внутриклеточные системы в действии глутоксима и моликсана на [Са²⁺]_i.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение роли каскада метаболизма арахидоновой кислоты и элементов актинового цитоскелета (актин-связывающих белков) во влиянии препаратов-иммуномодуляторов глутоксим и моликсан на [Ca²⁺]i в перитонеальных макрофагах крысы.

Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие

задачи:

1) изучить участие ключевого фермента каскада метаболизма АК
фосфолипазы А₂ во влиянии глутоксима и моликсана на [Са²⁺]_i в перитонеальных
макрофагах крысы;

2) изучить участие циклооксигеназного, липоксигеназного и
эпоксигеназного путей окисления АК в регуляции Са²⁺-ответов, вызываемых
глутоксимом и моликсаном в макрофагах;

3) исследовать участие актин-связывающих белков WASP и Arp 2/3-
комплекса в действии препаратов глутоксим и моликсан на [Ca²⁺]_i в макрофагах.

Научная новизна работы. С использованием широкого спектра агентов, ингибирующих фосфолипазы А2, циклооксигеназы, липоксигеназы и эпоксигеназы, впервые выявлено участие основных путей метаболизма АК во влиянии иммуномодуляторов глутоксима и моликсана на [Са²⁺]i в перитонеальных макрофагах крысы. Впервые показано участие актин-связывающих белков WASP и белков Arp 2/3-комплекса в регуляции Са²⁺-ответов, вызываемых глутоксимом и моликсаном в макрофагах.

Впервые предложены возможные механизмы участия каскада метаболизма АК и актиновых филаментов в сигнальном каскаде, запускаемом глутоксимом и моликсаном в перитонеальных макрофагах крысы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты вносят вклад в один из фундаментальных разделов клеточной биологии и биофизики - изучение процессов внутриклеточной сигнализации. Результаты исследования станут дополнением к общей модели действия дисульфид-содержащих иммуномодуляторов, которая откроет широкие перспективы для разработки новых эффективных лекарственных препаратов, а также для усовершенствования существующих. Выявление клеточных механизмов влияния препаратов глутоксим и моликсан позволит повысить эффективность использования этих препаратов в терапии бактериальных и вирусных инфекций, онкологических заболеваний и т.д. Материалы диссертации используются при чтении лекционных курсов «Биофизика», «Механизмы внутриклеточной сигнализации», «Биофизика клеточных процессов», «Основы медицинской биофизики» и «Люминесцентный анализ клеток» для студентов кафедры биофизики и биологического факультета СПбГУ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Структурно различные ингибиторы фосфолипазы А2 (4-

бромфенацилбромид, дексаметазон, преднизолон) вызывают существенное подавление Са²⁺-ответов, индуцируемых глутоксимом и моликсаном в перитонеальных макрофагах крысы, что свидетельствует об участии фосфолипазы А2 и каскада метаболизма АК в процессах Са²⁺-сигнализации, запускаемых глутоксимом и моликсаном в макрофагах.

2. Ингибиторы циклооксигеназ (индометацин, аспирин), липоксигеназ
(нордигидрогуаретиковая кислота, каффеиковая кислота, зилеутон, байкалейн) и
эпоксигеназ (эконазол, проадифен) подавляют увеличение [Са²⁺]_i, вызываемое
глутоксимом и моликсаном в макрофагах. Полученные результаты
свидетельствуют об участии ферментов и/или продуктов метаболизма АК в
регуляции Са²⁺-ответов, вызываемых дисульфид-содержащими
иммуномодуляторами в макрофагах.

3. Ингибиторы белков WASP (вискостатин) и Arp 2/3-комплекса
(соединение СК-0944666) существенно подавляют увеличение [Са²⁺]_i,
вызываемое глутоксимом и моликсаном в макрофагах, что свидетельствует об
участии актин-связывающих белков в действии глутоксима и моликсана на
[Са²⁺]i в макрофагах.

Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации, были
доложены на: VIII и IX Международной конференции «Биоантиоксидант»
(Москва, 2010, 2015); VIII, Х и XI Международном симпозиуме «Biological
Motility: Fundamental and Applied Science» (Пущино, 2012, 2014, 2016);
Международном симпозиуме по проблемам боли «Translational approaches to
cause-oriented treatment of pain symptoms» (Санкт-Петербург, 2012);
Международной междисциплинарной научной конференции «Биологически
активные вещества и материалы: фундаментальные и прикладные вопросы
получения и применения» (Новый Свет, Крым, 2013); Всероссийском
симпозиуме и школе-конференции для молодых учёных по биологии клетки в
культуре (Санкт-Петербург, 2013); XXII Съезде Физиологического общества
имени И.П. Павлова (Москва – Волгоград, 2013); Международной научно-
методической конференции «Современные проблемы биофизики сложных
систем. Информационно-образовательные процессы» (Воронеж, 2013);
Международной научно-практической конференции «Свободные радикалы и
антиоксиданты в химии, биологии и медицине» (Новосибирск, 2013); V, VI, VII,
VIII, IX Международной научно-практической конференции «Высокие
технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и
медицине» (Санкт-Петербург, 2013, 2014, 2015); 18 и 19 Международной
Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология – наука XXI века»
(Пущино, 2014, 2015); Международной конференции молодых учёных
«Экспериментальная и теоретическая биофизика 2014» (Пущино, 2014); II
Всероссийской конференции «Внутриклеточная сигнализация, транспорт,
цитоскелет» (Санкт-Петербург, 2015); Международной конференции

«Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2015); V Съезде биофизиков России (Ростов-на-Дону, 2015); 40 Конгрессе Федерации

Европейских биохимических обществ (40th FEBS Congress) (Германия, Берлин, 2015).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 научных работ, в том числе 1 монография, 6 статей в рецензируемых журналах, 11 статей и 12 тезисов в материалах конференций.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 169 страницах; включает такие разделы, как введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, общее заключение, выводы и список литературы, включающий 296 наименований. Работа иллюстрирована 55 рисунками и 2 таблицами.

Са2+ - универсальный вторичный посредник в живых клетках

В ходе эволюции живых организмов именно Са2+, благодаря своим уникальным физическим и химическим свойствам, стал универсальным вторичным посредником в эукариотических и прокариотических клетках (Jaiswal, 2001). Вероятно, к таким свойствам можно отнести высокое сродство ионов Са2+ к карбоксильным группам остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот, которые в большом количестве содержатся в клеточных белках (Jaiswal, 2001). Также Са2+ характеризуется быстрой кинетикой связывания и диссоциации от белковых молекул и может образовывать 6-8 координационных связей, что позволяет этому иону формировать лабильные комплексы с разнообразными белками. Са2+ необходим для поддержания структуры цитоскелета, и многочисленные ферментативные системы используют этот ион как кофактор (Jaiswal, 2001). Кроме того, Са2+ может влиять на организацию биологических мембран, локально повышая их текучесть или способствуя их слиянию. Таким образом, сигнальные процессы с участием Са2+ служат основой для регуляции процессов жизнедеятельности различных типов клеток (Berridge et al., 1998; Jaiswal, 2001; Putney, 2011).

Впервые важная роль Са2+ как внутриклеточного регулятора была установлена в классических экспериментах английского физиолога С. Рингера в 1883 г. (Ringer, 1883). Рингер исследовал сокращение изолированных сердец крыс, помещённых в солевой раствор. Изначально для приготовления омывающего раствора использовалась жёсткая водопроводная вода, содержащая большое количество солей кальция и магния: в такой среде сердца сокращались нормально (Ringer, 1883; Carafoli, 2002). Однако, когда Рингер решил заменить водопроводную воду на дистиллированную, он сделал удивительное открытие: сокращения сердец постепенно стали слабеть и через 20 минут совсем прекратились. Позже он установил, что для возобновления сокращений в омывающий раствор необходимо добавить соли Са2+ (Ringer, 1883; Carafoli, 2002).

Таким образом, Рингер случайно обнаружил, что Са2+, который до этого момента рассматривался только как структурный элемент биологических объектов, выполняет принципиально иную функцию - передача сигнала, необходимого для сердечных сокращений (Ringer, 1883; Carafoli, 2002). Поразительные результаты Рингера, опубликованные в «Физиологическом Журнале» (The Journal of Physiology), должны были бы сразу же вызвать мощный отклик со стороны учёных, однако в течение нескольких десятилетий они оставались без внимания (Carafoli, 2002).

В конце 50-х годов XX в. интерес к сигнальным функциям Са2+ начал резко возрастать, достигнув мощного взрыва в начале XXI в. В значительной степени этому способствовала разработка Р. Тьеном и его коллегами флуоресцентных Са2+-зондов на основе хелаторов Са2+ (Quin-1, Fura-2, Indo-1 и др.) для прижизненной окраски клеток (Tsien et al., 1984; Grynkiewicz et al., 1985), а также разработка метода локальной фиксации потенциала на мембране (patch-clamp) Э. Неером и Б. Сакманом (Hamill et al., 1981).

Таким, образом, в настоящее время Са2+ рассматривается как универсальный вторичный посредник в клетках животных, растений и микроорганизмов (Berridge et al., 1998). Повышение [Ca2+]i в ответ на внеклеточные стимулы - это сигнал, который характеризуется определённой амплитудой, длительностью и частотой и запускает различные внутриклеточные процессы (Berridge et al., 1998; Zhu, Birnbaumer, 1998). В то же время в цитоплазме покоящихся клеток [Ca2+]i жестко регулируется и поддерживается на очень низком уровне по сравнению с окружающей средой, поскольку чрезмерное повышение концентрации свободного Са2+ гибельно для клетки. Так, [Ca2+]i составляет около 10"7 М, а в межклеточном пространстве концентрация Са2+ может достигать 10"3М (Zhu, Birnbaumer, 1998).

В регуляции [Ca2+]i участвует целая система клеточных белков. 1. Са2+-связывающие белки Первым исследованным белком, способным связывать Са2+, стал парвальбумин (Kretsinger, 1972). Было выявлено, что в состав данного белка входят особые Са2+-связывающие участки, названные «EF-руками» (EF-hands). «EF-рука» представляет собой мотив «спираль -петля - спираль» (helix - loop - helix) и содержит одновалентные анионные карбоксильные группы, которые захватывают (хелатируют) двухвалентный катион (Kretsinger, 1972). Парвальбумин был первым идентифицированным представителем обширной группы Са2+-связывающих белков, к которой в настоящее время относят около 600 представителей, в том числе кальмодулин, кальретикулин, кальсеквестрин (Carafoli, 2002). Было установлено, что данные белки не только служат буферами свободного Са2+ в цитозоле и клеточных органеллах, но и выступают в роли Са2+-сенсоров, донося Са2+-сигналы до молекул-мишеней (Carafoli, 2002).

Ключевая роль в транспорте Са2+ между клеткой и внеклеточной средой, а также между различными клеточными компартментами принадлежит трансмембранным белкам (Carafoli, 2002; Крутецкая и др., 2003). В настоящее время охарактеризованы семейства белков, которые осуществляют как активный, так и пассивный транспорт ионов Са2+. Система активного транспорта Са2+ (против градиента концентрации, с затратой энергии АТФ) включает в себя Са2+-АТФазы плазматической мембраны (plasma membrane Ca2+-ATPase, РМСА), Na+/Ca2+-обменники (Na+/Ca2+-exchanger, NCX) и Са2+-АТФазы в мембранах внутриклеточных Са2+-депо (Са2+-АТФазы сарко/эндоплазматического ретикулума - Са2+ ATPases of sarco/endoplasmic reticulum, SERCA-ATPases) (Carafoli, 2002; Крутецкая и др., 2003). Эти белки транспортируют Са2+ из клетки (РМСА, NCX плазмалеммы) или осуществляют обмен Са2+ между цитоплазмой и внутриклеточными органеллами (Са2+-АТФазы внутриклеточных Са2+-депо, NCX митохондрий) (Carafoli, 2002). К системе пассивного транспорта Са2+ относятся потенциал-управляемые, рецептор-управляемые, депо-зависимые Са2+-каналы, по которым Са2+ транспортируется в цитозоль из окружающей среды, а также Са2+-каналы внутриклеточных Са2+-депо (Berridge et al., 1998; Zhu, Birnbaumer, 1998; Крутецкая и др., 2003).

Результаты исследований середины XX в. позволили сделать фундаментальное обобщение в области внутриклеточной кальциевой сигнализации: в ответ на активацию мембранных рецепторов различными агонистами происходит двухфазное увеличение [Ca2+]i: одна фаза соответствует мобилизации Са2+ из внутриклеточных депо, а другая - входу Са2+ из наружной среды (Putney, 1977; Zhu, Birnbaumer, 1998).

В мышечной ткани Са2+ входит в цитозоль из наружной среды по потенциал-зависимым Са2+-каналам сарколеммы (Beatty et al., 1996; Крутецкая и др., 2003), а мобилизация Са2+ из депо осуществляется при стимуляции рианодиновых рецепторов саркоплазматического (СР) или эндоплазматического ретикулума (ЭР) (Крутецкая и др., 2003). Потенциал-зависимые Са2+-каналы в плазматической мембране характерны также для нервных клеток (Крутецкая и др., 2003).

В невозбудимых и некоторых возбудимых клетках запуск классического фосфоинозитидного пути передачи сигнала под воздействием различных агонистов приводит к активации рецепторов инозитол-1,4,5-трифосфата (ІРз) в мембране Са2+-депо. В результате происходит мобилизация Са2+-из внутриклеточных депо по 1Рз-чувствительным каналам Са2+-выброса, а затем вход Са2+ из наружной среды по депо-зависимым Са2+-каналам (рис. 1) (Zhu, Birmbaumer).

Молекулярная природа депо-зависимых Са2+-каналов

Депо-зависимый вход Са2+ выявлен в различных типах невозбудимых клеток, однако механизмы, посредством которого информация об опустошении внутриклеточных Са2+-депо передаётся к депо-зависимым Са2+-каналам, по-прежнему остаются предметом активных исследований. Для объяснения механизмов депо-зависимого входа Са2+ предложен ряд моделей (рис. 6 - 8).

Целый ряд исследователей предположили, что при опустошении Са2+-депо в цитозоль высвобождается водорастворимый мессенджер, который диффундирует к плазматической мембране и активирует вход Са2+ в клетки (Randriamampita, Tsien, 1993; Davies, Hallett, 1995; Kim et al., 1995; Bolotina, Csutora, 2005) (рис. 6a).

Одними из первых о существовании посредника, высвобождающегося при опустошении Са2+-депо, сообщили Рандриамампита и Тьен (Randriamampita, Tsien, 1993). Авторы индуцировали мобилизацию Са2+ из депо в Т-лимфоцитах линии Jurkat, а затем воздействовали экстрактом, выделенным из этих клеток, на макрофагоподобные клетки линии P388D1, клетки астроцитомы и фибробласты (Randriamampita, Tsien, 1993). Было установлено, что клетки Jurkat действительно содержат вещество, активирующее вход Са2+ в других клетках. Это вещество было названо фактором входа Са2+ (Са2+ influx factor, CIF) (Randriamampita, Tsien, 1993). Однако выделенный CIF активировал вход Са2+ только при внеклеточном приложении к интактным клеткам. Кроме того, было выявлено, что экстракт из клеток Jurkat содержит несколько сигнальных факторов и может активировать как вход, так и мобилизацию Са2+ из депо. Рис. 6. Предполагаемые механизмы емкостного входа Са2+(по Putney et al., 2001) а - модель с участием растворимого посредника; б - модель конформационного связывания; в - модель встраивания везикул. Ag - агонист; CIF - фактор входа Са2+; CRAC - Са2+-канал, активируемый высвобождением Са2+ из депо; ER - эндоплазматический ретикулум; G - гетеротримерный G-белок; Ins(l,4,5)P3 - инозитол-1,4,5-трифосфат; Ins(l,4,5)P3R - рецептор инозитол-1,4,5-трифосфата; PLC - фосфолипаза С; R - рецептор к агонисту; SP - соединительный (scaffolding) белок.

Очистка экстракта из клеток Jurkat, обработанных тапсигаргином, при помощи хроматографических методов позволила выделить специфический компонент (собственно CIF), активирующий вход Са2+ при микроинъекции в ооциты Xenopus (Kim et al., 1995). CIF также удалось получить из клеток других типов, включая нейтрофилы, макрофагоподобные клетки линии P388D1 (Davies, Hallett, 1995), дрожжи Saccharomyces cerevisiae (Csutora et al., 1999) и тромбоциты человека (Trepakova et al., 2000). На роль вторичных посредников, активирующих депо-зависимый вход Са2+, выдвигаются различные клеточные молекулы. Так, ряд авторов предполагают, что в передаче сигнала об опустошении Са2+-депо могут принимать участие цитохромы Р-450 (эпоксигеназы), локализованные в мембране эндоплазматического ретикулума, или продукт эпоксигеназного окисления АК 5,6-эпоксиэйкозатриеновая кислота (5,6-ЭЭТК) (Alvarez et al., 1992; Rzigalinski et al., 1999, Xie et al., 2002). Так, было показано, что 5,6-ЭЭТК активирует депо-зависимый вход Са2+ в клетках эндотелия роговицы быка и, таким образом, претендует на роль CIF (Xie et al., 2002). При этом активатор цитохромов-Р450 Р-нафтофлавон усиливает депо-зависимый вход Са2+, индуцированный различными агонистами в этих клетках (Xie et al., 2002). Кроме того, в пользу участия цитохромов-Р450 и их продуктов в передаче сигнала об опустошении Са2+-депо к плазмалемме свидетельствуют результаты об эффективном подавлении депо-зависимого входа Са2+ селективными блокаторами эпоксигеназ (эконазол, проадифен, кетоконазол, миконазол) (Alvarez et al., 1992; Alonsoorre et al., 1993; Graier et al., 1995).

Также в активации депо-зависимого входа Са2+ с участием растворимого посредника может быть задействована Са2+-независимая фосфолипаза Аг (Ca2+-independent phospholipase Аг, іРЬАг), которая относится к группе фосфолипаз Аг VIA (Smani et al., 2004; Bolotina, Csutora, 2005). Каталитическая активность іРЬАг не зависит от ионов Са2+ и ингибируется кальмодулином (Smani et al., 2004).

Согласно предложенной авторами модели (рис. 7) (Smani et al., 2004), CIF, который образуется при опустошении Са2+-депо, устраняет ингибирующее влияние кальмодулина на ассоциированную с плазмалеммой іРЬАг, которая активируется и начинает расщеплять мембранные фосфолипиды с образованием лизофосфолипидов и АК.

Лизофосфолипиды активируют депо-зависимые Са2+-каналы в плазмалемме и вход Са2+ в клетку (Smani et al., 2004; Bolotina, Csutora, 2005). В результате входа Са2+ в клетку запасы Са2+ в депо восполняются и продукция CIF прекращается. СаМ снова связывается с іРЬАг, таким образом, ингибируя образование лизофосфолипидов и, как следствие, депо-зависимый вход Са2+ (Bolotina, Csutora, 2005). Активность іРЬАг должна жёстко контролироваться, поскольку избыточная продукция лизофосфолипидов может привести к нарушению целостности плазматической мембраны и неспецифическому входу Са2+ в клетку из наружной среды (Bolotina, Csutora, 2005).

Важная роль іРЬАг в активации депо-зависимого входа Са2+ была продемонстрирована на клетках различных типов, в том числе клетках гладких мышц, клетках RBL (rat basophilic leukaemia cells, лейкемические базофилы крысы), Т-лимфоцитах линии Jurkat (Bolotina, Csutora, 2005). 2) Модели «конформационного связывания» (conformational coupling model)

Идея о возможности прямого взаимодействия между ЭР и плазматической мембраной впервые была высказана Р. Ирвином (Irvine, 1990) на основании выявленной гомологии между 1Рз-рецептором и рианодиновым рецептором в скелетных мышцах. Согласно модели Р. Ирвина, 1Рз-рецептор взаимодействует с некоторым белком в плазматической мембране и играет роль «мостика» между мембраной внутриклеточных Са2+-депо и плазмалеммой. Когда концентрация Са2+ в депо снижается, 1Рз-рецептор диссоциирует от мембранного белка и происходит вход Са2+ (Irvine, 1990).

Данная модель была развита М. Берриджем, который предположил, что связь между опустошением внутриклеточных депо и входом Са2+ в клетки осуществляется путём прямого взаимодействия между ГРз-рецептором в мембране депо и депо-зависимым Са2+-каналом в плазмалемме (Berridge, 1995) (рис. 66). Для описания этого взаимодействия М. Берридж ввёл термин «конформационное связывание» (conformational coupling). В соответствии с моделью, цитоплазматические домены 1Рз-рецепторов, локализованные около плазмалеммы, интегрируют сигналы, регулирующие емкостной вход Са2+, и передают их депо-зависимым Са2+-каналам в плазмалемме (Berridge, 1995). Таким образом, 1Рз-рецепторы, вероятно, могут выполнять две функции: высвобождение Са2+ из депо в цитоплазму и передача сигнала об опустошении депо депо-зависимым Са2+-каналам в плазматической мембране (Berridge, 1995).

Чтобы конформационная модель работала, то есть 1Рз-рецептор и депо-зависимый Са2+-канал непосредственно взаимодействовали друг с другом, необходимо, чтобы мембрана ЭР находилась в непосредственной близости к плазмалемме (Крутецкая и др., 2003). Наличие таких близких контактов подтверждается результатами многочисленных морфологических и иммуногистохимических исследований (Крутецкая и др., 2003). Так, колокализация депо-зависимого выброса Са2+ и участков выброса Са2+ из депо, индуцированного 1Рз, показана с помощью конфокальной микроскопии для эндотелиальных клеток (Huser et al., 1999).

Измерение внутриклеточной концентрации Са флуоресцентного Са -зонда Fura-2AM

Можно выделить несколько этапов циклооксигеназного пути метаболизма АК (Davies et al., 1984; Крутецкая, Лебедев, 1993). Изначально при окислении АК с участием ЦОГ происходит включение 2 атомов кислорода в молекулу АК в положении С-11 и С-15. В результате образуется первый нестабильный эндопероксид простагландин G2 (lll -Gb), который восстанавливается до второго нестабильного эндопероксида - простагландина Нг (ПГ-Нг). Из них в результате дальнейших превращений могут образоваться другие продукты -простагландины Ег, D2 Fia (Ш -Ег, ПГ-Ог, ПГ-Бга). Эндопероксиды под действием простагландин-Ь-синтазы превращаются в ПГ-Ь (простациклин), а под действием тромбоксан-г\_2 синтазы — в тромооксан-г\_2 (liv-r\_2). lii I2 и liv-r\_2 спонтанно гидролизуются ДО О-кетопростагландина Fia и тромбоксана Вг (ТК-Вг) соответственно (Davies et al., 1984; Крутецкая, Лебедев, 1993).

ПГ являются паракринными и аутокринными факторами, поэтому целый ряд тканей имеют рецепторы к этим соединениям (Dubois et al., 1998). Во-первых, ПГ взаимодействуют с рецепторами плазмалеммы, связанными с гетеротримерными G-белками: например, мишенью для ПГ-Ег являются рецепторы ЕР 1-4 (E-prostanoid receptor 1 - 4), ассоциированные с белками Gs, Gi или Gq. Активация этих рецепторов запускает аденилатциклазный или фосфоинозитидный пути передачи сигнала (Sales, Jabbour, 2003). Во-вторых, ПГ связываются с ядерными рецепторами PPARs (peroxisome proliferator activated receptors: рецепторы, активируемые фактором пролиферации пероксисом), которые работают как транскрипционные факторы при связывании лиганда (Dubois et al., 1998).

ПГ обладают широким спектром физиологических эффектов. Прежде всего, ПГ представляют собой медиаторы системного воспаления (Симонова, Немцов, 2007). Они повышают чувствительность гипоталамических центров терморегуляции к действию эндогенных пирогенов (например, интерлейкина-1, IL-1), образующихся под влиянием микроорганизмов, вирусов, токсинов и, таким образом, индуцируют общее повышение температуры (Симонова, Немцов, 2007). Также ПГ увеличивают чувствительность клеточных рецепторов к гистамину, брадикинину и серотонину, снижая порог болевой чувствительности (Симонова, Немцов, 2007).

ПГ играют важную роль в нормальном функционировании слизистой желудочно-кишечного тракта. В частности, они оказывают цитопротекторное действие на клетки кишечного эпителия и поддерживают нормальную структуру кишечных желёз (Cohn et al., 1997).

Установлено, что ПГ являются мощными регуляторами тонуса гладких мышц (Sugimoto et al., 1997). Так, различные ПГ-Е и ПГ-F оказывают стимулирующее воздействие на мускулатуру матки. Было показано, что у мышей ПГ-Гга, продуцируемый в тканях плода и матки, индуцирует распад жёлтого тела в яичнике (Sugimoto et al., 1997). Это приводит к снижению продукции материнского прогестерона и повышению чувствительности рецепторов миометрия к окситоцину, что в конечном итоге и обеспечивает запуск родов (Sugimoto et al., 1997). На основе ПГ-Ег разработан препарат «Простенон», который применяется в медицинской практике для стимуляции родовой деятельности (Машковский, 2005).

ПГ-І2 (простациклин), синтезируемый в клетках эндотелия, расширяет сосуды, сужает бронхи и ингибирует агрегацию тромбоцитов (Davies et al., 1984; Lapetina, 1990). ПГ-Ег расширяет периферические кровеносные сосуды и бронхи; ПГ-F2a, наоборот, характеризуется бронхоконстрикторным эффектом (Машковский, 2005).

Сосудорасширяющий эффект ПГ имеет большое значение для регуляции почечного тока плазмы и клубочковой фильтрации. Вследствие этого ингибирование продукции ПГ приводит к развитию почечной недостаточности (Zambarski, 1995). Кроме того, ПГ могут участвовать в регуляции транспорта веществ в почке. Так, было показано, что ПГ-Ег ингибирует реабсорбцию ионов СІ в толстой восходящей части петли Генле (Stokes, 1979).

ТК, так же как и ПГ, представляют собой паракринные или аутокринные факторы и воздействуют на мембранные рецепторы, связанные с Gq-белками. При активации этих рецепторов происходит запуск фосфоинозитидной сигнальной системы (Abe et al., 1995). ТК являются вазоконстрикторами: например, ТК-Аг вызывает сокращение гладких мышц кровеносных сосудов и сужение бронхов (Davies et al., 1984; Lapetina, 1990; Nozawa et al., 1991). ТК-Аг, продуцируемый активированными кровяными пластинками (тромбоцитами), активирует другие тромбоциты и усиливает их агрегацию (Siess, 1989). Также ТК играют важную роль в физиологической регуляции работы почек: они снижают почечный кровоток и уменьшают скорость клубочковой фильтрации (Wilkes et al., 1989).

Липоксигеназы (ЛОГ) - это ферменты, содержащие негемовое железо (Fe2+/Fe3+), которые катализируют диоксигенирование (включение одной молекулы кислорода) в полиненасыщенные жирные кислоты с двумя и более изолированными двойными связями (Kuhn et al., 2015). В клетках млекопитающих в качестве наиболее распространённых субстратов ЛОГ выступают свободные линолевая (С18:А2, юб) и арахидоновая (С20: А4, юб) кислоты (Kuhn et al., 2015). Первичным продуктом окисления АК с участием ЛОГ являются гидропероксиэйкозатетраеновые кислоты (ГПЭТЕК). При этом гидропероксигруппа может включаться при 5, 12 или 15 атоме углерода в молекуле АК (Lapetina, 1990; Kuhn, O Donnell, 2006).

Геном человека содержит шесть функциональных генов ЛОГ: ALOX15 (arachidonate lipoxygenase 15, арахидонат-липоксигеназа), ALOX15B, ALOX12, ALOX12B, ALOXE3, ALOX5, (Kuhn et al., 2015). Эти гены кодируют шесть различных изоформ ЛОГ, которые экспрессируются в различных тканях: 15-ЛОГ, 12В-ЛОГ, 12-ЛОГ, 12Я-ЛОГ, эпидермальные ЛОГ и 5-ЛОГ (Kuhn et al., 2015). Структура 5-ЛОГ представлена на рис. 18.

ЛОГ в неактивном состоянии локализованы в цитоплазме; 5-ЛОГ также может располагаться внутри ядра (Radmark et al., 2015). При активации происходит транслокация ЛОГ и связывание с различными клеточными мембранами. Так, 5-ЛОГ, как правило, связывается с ядерной оболочкой, 12/15-ЛОГ - с плазмалеммой или внутриклеточными мембранами. Важную роль во взаимодействии ЛОГ с мембраной-мишенью играют ионы Са2+ (Radmark et al., 2015). Для катилитической активности 5-ЛОГ необходим вспомогательный фактор - белок FLAP (5(five)-lipoxygenase associated protein; белок, ассоциированный с 5-ЛОГ), который, вероятно, способствует перемещению АК в активный центр фермента (Radmark et al., 2015).

Влияние ингибиторов липоксигеназ на Са2+-ответы, вызываемые глутоксимом и моликсаном

Результаты согласуются с данными, полученными ранее на кафедре биофизики СПбГУ, о влиянии индометацина и аспирина на Са2+-сигналы, индуцированные пуринергическими агонистами АТФ и УТФ, а также ингибиторами SERCA тапсигаргином и циклопьязониковой кислотой в перитонеальных макрофагах крысы (Крутецкая и др., 2000). Так, предварительная инкубация клеток с индометацином или аспирином вызывала почти полное подавление входа Са2+, индуцированного АТФ, УТФ, тапсигаргином или циклопьязониковой кислотой (Крутецкая и др., 2000). Введение индометацина или аспирина на фоне развившегося входа Са2+, индуцированного этими агентами, также приводило к подавлению входа Са2+ в макрофагах. Данные результаты позволили предположить, что продукты циклооксигеназного пути окисления АК принимают участие в активации депо-зависимого входа Са2+ в перитонеальных макрофагах крысы (Крутецкая и др., 2000).

Влияние продуктов циклооксигеназного пути метаболизма АК на мобилизацию Са2+ из внутриклеточных депо показано на тромбоцитах человека, для которых было установлено, что экзогенная АК в различных концентрациях индуцирует мобилизацию Са2+ из депо (Alonso et al., 1990). Данный эффект подавлялся при предварительной инкубации с ацетилсалициловой кислотой и имитировался агонистом рецепторов ПГ-Н2/ТК-А2 соединением U46619. Полученные данные позволили предположить, что активирующее влияние АК на фазу мобилизации Са2+ опосредовано продуктами циклооксигеназ (ПГ и/или ТК) (Alonso et al., 1990).

Полученные нами результаты также согласуются с данными исследований Са2+-сигнализации в опухолевых клетках. Установлено, что структурно различные ингибиторы ЦОГ индометацин, аспирин и ибупрофен могут оказывать противоопухолевое действие, ускоряя апоптоз и ингибируя пролиферацию и миграцию раковых клеток (Kokoska et al., 2000; Guo et al., 2013). Вероятно, данный эффект связан с их действием как на ЦОГ, так и на процессы внутриклеточной Са2+-сигнализации. Так, на клетках эпидермоидной карциномы человека линии А431 и клетках карциномы прямой кишки человека (Сасо-2) было установлено, что данные фармакологические агенты подавляют вход Са2+, активируемый EGF (Kokoska et al., 2000; Guo et al., 2013). Кроме того, показано, что индометацин, аспирин и ибупрофен значительно уменьшают депо-зависимый вход Са2+, запускаемый тапсигаргином в клетках желудка человека (Kokoska et al., 1998). Эти результаты свидетельствуют о том, что циклооксигеназный путь окисления АК участвует в регуляции входа Са2+ в клетки как в норме, так и при патологии (Kokoska et al., 1998, 2000; Guo et al., 2013)

Следует отметить, что ингибиторы ЦОГ индометацин и аспирин обладают противовоспалительным, анальгетическим и жаропонижающим эффектами и входят в состав нестероидных противовоспалительных препаратов (табл. 1). В связи с этим полученные результаты свидетельствуют о нежелательности совместного клинического применения глутоксима и моликсана с лекарственными средствами на основе индометацина и аспирина.

Основной изоформой ЛОГ, экспрессирующейся в макрофагах и других иммунных клетках, является 5-ЛОГ, которая окисляет АК с образованием ЛТ - ключевых медиаторов, участвующих в запуске и развитии воспалительных и аллергических реакций (Kuhn et al., 2015). Также важную роль в макрофагах играет 12/15-ЛОГ, продукты которой (в том числе липоксин А4) напротив, выполняют противовоспалительную и цитопротекторную функцию (Kronke et al., 2009).

Для выявления возможного участия липоксигеназного пути окисления АК в действии глутоксима и моликсана на [Са2+]і в макрофагах были использованы следующие фармакологические агенты: 1) неселективный ингибитор липоксигеназ нордигидрогуаретиковая кислота (НДГК); 2) селективные ингибиторы 5-ЛОГ каффеиковая (3,4-дигидроксициннамовая) кислота и зилеутон; 4) селективный ингибитор 12-ЛОГ флавоноид байкалейн. Структура фармакологических агентов представлена в таблице 1.

В настоящей работе было установлено, что предварительная инкубация перитонеальных макрофагов крысы в течение 5 мин с 10 мкМ НДГК до введения глутоксима (рис. 376) или моликсана (рис. 386) приводила к практически полному подавлению мобилизации Са2+ из внутриклеточных Са2+-депо, индуцированной 100 мкг/мл глутоксима или моликсана, а также последующего депо-зависимого входа Са2+ из наружной среды.

Кроме того, было установлено, что предварительная инкубация макрофагов с 5 мкМ каффеиковой кислоты в течение 5 мин до введения глутоксима (рис. 396) или моликсана (рис. 396) приводила к практически полному ингибированию обеих фаз Са2+-ответов, вызванных глутоксимом или моликсаном в макрофагах. Предварительная инкубация макрофагов с 1 мкМ другого структурно отличного селективного ингибитора 5-ЛОГ зилеутона в течение 5 мин до введения 100 мкг/мл глутоксима вызывает значительное подавление мобилизации Са2+ из депо (в среднем по данным 7 экспериментов на 79,2±9,1 %) и последующего входа Са2+ (в среднем по данным 7 экспериментов на 58,7±8,4%), индуцированных глутоксимом (рис. 426). Сходные данные получены с использованием 100 мкг/мл моликсана (рис. 436): в среднем по данным 111 экспериментов зилеутон вызывает подавление мобилизации Са2+ из депо на 67.5% и подавление входа Са2+в клетку на 70.81%.

Аналогичные результаты получены и для селективного ингибитора 12-ЛОГ байкалейна. Так, предварительная инкубация перитонеальных макрофагов крысы с 5 мкМ байкалейна в течение 5 мин до введения глутоксима (рис. 39в) или моликсана (рис. 416) вызывала практически полное подавление как мобилизации Са2+ из депо, так и последующего входа Са2+ из наружной среды в ответ на глутоксим или моликсан.

Полученные экспериментальные данные позволяют предположить, что 5-ЛОГ и 12-ЛОГ и/или продукты окисления АК с участием этих ферментов играют важную роль в формировании обеих фаз Са2+-ответов, индуцированных глутоксимом или моликсаном.

Кроме того, исследовано влияние ингибиторов ЛОГ на развившийся вход Са2+, индуцированный 100 мкг/мл глутоксима или моликсана в перитонеальных макрофагах крысы. Установлено, что введение НДГК (30 мкМ) (рис. 44а), каффеиковой кислоты (40 мкМ) (рис. 446), зилеутона (4 мкМ) (рис. 42а) или байкалейна (40 мкМ) (рис. 44в) на фоне развившегося входа Са2+ вызывает частичное подавление входа Са2+, вызванного глутоксимом, с различной эффективностью.

В среднем подавление входа Са2+, вызванного глутоксимом, составило для НДГК -31,7±5,8% (по данным 7 экспериментов), для каффеиковой кислоты - 31,2±9,1% (по данным 8 экспериментов), для зилеутона 41,8±9,3% (по данным 11 экспериментов), для байкалейна -60,5±8,9% (по данным 7 экспериментов).

Аналогичные результаты получены для препарата моликсан. Данные о влиянии ингибиторов ЛОГ на развившийся вход Са2+, индуцированный глутоксимом и моликсаном, представлены в таблице 2.

Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что продукты окисления АК с участием 5-й 12-ЛОГ играют важную роль не только в генерации, но и в поддержании депо-зависимого входа Са2+ в ответ на глутоксим и моликсан.