Введение к работе
Актуальность темы исследования
Для изучения структурных и функциональных особенностей клеток широко применяется метод флуоресцентной микроскопии. Однако, разрешающая способность флуоресцентного микроскопа ограничена дифракционным пределом (200-300 нм), поэтому визуализация многих процессов и структур остается за пределами возможностей традиционной флуоресцентной микроскопии.
Революционным событием стала разработка методов флуоресцентной
микроскопии сверхвысокого разрешения (ФМСР). С помощью ФМСР удается
получать изображения с субдифракционным пространственным разрешением
(20-50 нм), что открывает широкие перспективы по изучению тонкой
структуры цитоскелета клеток. Актин и другие белки цитоскелета формируют в
клетке обширную сеть, построенную из тончайших волокон, которые могут
быть разрешены только на субдифракционном уровне. С помощью ФМСР
становится возможным наблюдение индивидуальных филаментов и
детектирование динамических перестроек в системе цитоскелета.
Среди технологий ФМСР выделяют группу методов, объединенных общим названием локализационная микроскопия одиночных молекул (single-molecule localization microscopy, SMLM1). Этот подход основан на использовании специальных флуоресцентных меток, способных к обратимому или необратимому переходу между “темновым” и флуоресцентным состояниями. Под “темновым” состоянием в этом случае подразумевается состояние флуорофора, не детектируемое при выбранных условиях из-за низкого квантового выхода флуоресценции или отсутствия полосы поглощения, соответствующей возбуждающему свету.
Первые работы по SMLM относятся к 2006 году, поэтому в настоящее время данное направление все еще активно развивается. Постоянно идет поиск и создание эффективных флуорофоров, совершенствуются алгоритмы обработки данных, предлагаются новые схемы организации оптического пути микроскопа. Одна из основных тенденций – это создание методик, наименее повреждающих живые клетки и пригодных для изучения динамических процессов.
В настоящей работе мы разрабатывали подходы к локализационной
микроскопии одиночных молекул, которые позволили бы исследовать
структурные и функциональные особенности цитоскелета клеток
млекопитающих, в том числе на тканевом уровне организации.
1 В зарубежной литературе используется аббревиатура SMLM (single-molecule localization microscopy), для которой в русском языке пока отсутствует общепринятый аналог.
Степень разработанности научной проблемы
ФМСР можно по праву считать главным технологическим прорывом последних 20 лет в области оптической микроскопии. В 2014 году за пионерские работы в данной области была присуждена Нобелевская премия по химии.
С развитием ФМСР расширились возможности изучения тонкой структуры
цитоскелета. Визуализация белков цитоскелета зачастую служит
демонстрацией эффективности работы того или иного метода ФМСР. Вместе с тем, совершенствование данных технологий способствует более глубокому пониманию функционирования систем микрофиламентов и микротрубочек и важно как для накопления фундаментальных знаний, так и для решения биомедицинских задач. Особое внимание уделяется развитию подходов, совместимых с визуализацией цитоскелета в живых клетках, а также переходу от работы с клетками in vitro к микроскопии клеток в составе тканей и целых организмов. Однако, методы SMLM обычно плохо совместимы с живыми клетками, поскольку требуют длительной съемки образца и сопровождаются высокой фототоксичностью. Кроме того, исследователи часто сталкиваются с трудностями адаптации данных методик к изучению объектов на тканевом уровне.
Цель и задачи исследования
Цель настоящей работы состояла в разработке и использовании новых подходов к изучению структуры и динамики цитоскелета клеток в культуре и в тканях млекопитающих на основе субдифракционной микроскопии.
Были поставлены и решены следующие задачи:
-
Оптимизировать процесс фотоактивации флуоресцентного белка Dendra2 в условиях локализационной микроскопии одиночных молекул (SMLM) для визуализации ультраструктуры живых клеток млекопитающих.
-
Протестировать красные флуоресцентные белки, слитые в одной рамке считывания с белками цитоскелета, на способность к переходу между флуоресцентным и “темновым” состояниями для проведения SMLM живых клеток.
-
Визуализировать структуру актина с субдифракционным разрешением в опухолевых тканях в мышиных моделях.
4. Применить разработанные подходы к субдифракционной микроскопии
для изучения перестроек актинового цитоскелета в опухолевых клетках и
тканях под влиянием химиотерапевтических препаратов.
Научная новизна и практическая ценность работы
В настоящей работе мы впервые протестировали флуорофоры и режимы
съемки, ранее не используемые в SMLM. Был предложен новый способ
фотоактивации флуоресцентного белка Dendra2 без использования токсичного
фиолетового облучения в условиях детекции одиночных молекул. Мы впервые
продемонстрировали возможность использования некоторых красных
флуоресцентных белков в качестве эффективных инструментов для проведения субдифракционной локализационной микроскопии. На основе полученных данных разработаны оригинальные методики для визуализации структурных и функциональных особенностей цитоскелета клеток млекопитающих со сверхразрешением. Предложенные подходы к субдифракционной микроскопии направлены на снижение фототоксичности при наблюдении образца и сокращение времени съемки, и, таким образом, способствуют поддержанию жизнеспособности клеток и изучению нативных ультраструктур в них.
Вторая часть работы состояла в реализации перехода от SMLM культур клеток к тканям млекопитающих. Нами была создана методика визуализации эндогенного актина в тканевых образцах со сверхразрешением. Впервые было показано, что в опухолевой ткани мышей можно наблюдать обширную сеть актиновых волокон, морфологически напоминающих стресс-фибриллы, но не свойственных нормальным тканям. Впервые выявлены ультратонкие изменения актинового цитоскелета в опухоли в ответ на химиотерапевтическое воздействие.
Предложенные нами подходы способствуют большей доступности методов SMLM для исследователей. Методика визуализации актина в тканях со сверхразрешением потенциально может быть применена для изучения различных злокачественных образований, в том числе для исследования ультратонких особенностей опухолевых клеток первичных узлов и метастазов, как на модельных опухолях животных, так и на клинических образцах.
Положения, выносимые на защиту
1. Предложен новый режим фотоактивации флуоресцентного белка Dendra2
без использования фиолетового лазера, пригодный для наблюдения живых
клеток млекопитающих в условиях SMLM.
2. Обнаружена способность к переходу между флуоресцентным и
“темновым” состояниями у некоторых красных флуоресцентных белков, на
основе которой возможно проведение SMLM и получение субдифракционных
изображений цитоскелета живых клеток.
3. Разработан метод получения субдифракционных изображений
эндогенного актина в образцах опухолевых тканей мышей с использованием флуорогенного красителя SiR-actin в условиях SMLM.
4. С помощью предложенных подходов выявлены особенности тонкой организации актинового цитоскелета в раковых клетках в культуре и в опухоли, в том числе при воздействии химиотерапии.
Апробация полученных результатов
Результаты диссертационной работы были представлены на научной школе EMBL Advanced Course “Super-resolution microscopy” (Гайдельберг, Германия, 2014), а также на конференциях и симпозиумах, в том числе SPIE Photonics West BiOS (Сан-Франциско, США, 2014); Topical problems of Biophotonics (Нижний Новгород, 2015); Super-resolution in different dimensions (Москва, Россия, 2015); SPIE/OSA European Conferences on Biomedical Optics (Мюнхен, Германия, 2015); Advanced Fluorescence Imaging Methods (Сочи, Россия, 2016).
Публикации по теме работы
По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 1 обзор в российских и международных научных журналах.
Структура диссертации