Введение к работе
Актуальность работы
На сегодняшний день одной из актуальных задач современной биологии
является структурно-функциональное исследование различных семиспиральных
мембранных белков, включая рецепторы семейства GPCR и родопсины,
различными биофизическими методами, такими как рентгеновская
кристаллография, ЯМР-спектроскопия, криоэлектронная микроскопия и др. Знание структуры МБ позволит исследователям понять фундаментальные основы процессов передачи клеточных сигналов в природе - как осуществляется светозависимый транспорт ионов через биомембрану, каким образом рецептор узнает свой лиганд, где находится интерфейс их взаимодействия, за счет чего достигается селективность связывания с лигандом, что происходит дальше с G-белком? Понимание механизмов взаимодействия рецептора и его лигандов значительно повысит эффективность поиска новых лекарственных препаратов, целенаправленно воздействующих на конкретную мишень, особенно благодаря применению методов компьютерного моделирования на основе структурных данных. Исследование молекулярных механизмов работы родопсинов позволит глубже понять механизмы мембранного транспорта в клетках, расширит сферу применения родопсинов как оптогенетических инструментов, позволит создавать различные наноустройства.
Одна из главных проблем в структурной биологии семиспиральных мембранных белков – трудность получения в необходимых для экспериментов количествах функционально активного и стабильного образца конкретного вида рецептора. Несмотря на достигнутые успехи, по-прежнему актуальна задача разработки новых подходов в экспрессии рецепторов GPCR в различных клеточных и бесклеточных системах синтеза. Самым распространенным и дешевым способом получения генно-инженерных белков в больших количествах является экспрессия в клетках Escherichia coli. Большинство бактериальных родопсинов успешно экспрессируются в E. coli, однако рекомбинантные человеческие рецепторы GPCR получаются в денатурированном виде в составе телец включения. Это означает, что белок после выделения и очистки необходимо подвергать рефолдингу, что до сих пор является трудной задачей и остается в некотором смысле «искусством». Все имеющиеся на сегодняшний день структуры рецепторов GPCR были получены путем экспрессии в клетках насекомых Spodoptera frugiperda линии Sf9. Различными способами удается поднять уровень экспрессии функционально активного белка-рецептора, но
итоговый выход составляет около миллиграмма с литра достаточно дорогой питательной среды. Кроме того, таким способом невозможно получить белок в полностью или частично изотопно-меченом виде, что является необходимым условием для изучения структуры и динамики биополимеров методами ЯМР-спектроскопии.
Даже при наличии хорошего уровня бактериальной экспрессии GPCR в тельца включения и проведения рефолдинга остается нерешенным вопрос тестирования функциональной активности и выделения активного рецептора от неправильно свернутого неактивного или агрегированного. Одним из надежных и простых способов является аффинная хроматография рецептора на сорбенте с ковалентно связанным лигандом. Поэтому разработка методов посадки лигандов различных рецепторов на коммерчески доступные матрицы, например, на основе агарозы, – одна из актуальных задач для биохимических и биофизических исследований GPCR рецепторов.
Основные задачи исследования
Для проведения структурно-функциональных исследований мембранных
белков основной задачей начального этапа изысканий является получение
гомогенного, стабильного, функционально активного образца данного белка.
Поскольку невозможно получить достаточное количество рецептора при прямой
экстракции из живых тканей, необходима разработка протоколов
гетерологической экспрессии с последующим выделением и очисткой препарата. Интегральные мембранные белки, к которым относятся и рецепторы GPCR, ввиду наличия гидрофобных трансмембранных доменов склонны к агрегации и требуют солюбилизации и рефолдинга, включающего поиск оптимальной мембраномоделирующей среды, которая предохраняет от олигомеризации. Так же экспериментально необходимо подтвердить факт наличия активности у готового к структурным экспериментам образца, так как это будет служить подтверждением того, что белок имеет нативную пространственную структуру.
Исследование, проведенное в рамках настоящей диссертации, было направлено на решение основной задачи – получение стабильного и функционально активного образца, пригодного для структурных и других биофизических и биохимических исследований. Данная задача в свою очередь подразделялась на несколько подзадач: 1. Бактериальная экспрессия, выделение и очистка 2-адренергического
рецептора человека (2AR) и его мутантной формы; бактериального
родопсина из Exiguobacterium Sibiricum (ESR), различных вариантов белка
MSP (фрагмента аполипопротеина AI человека) для получения
фосфолипидных нанодисков.
-
Отработка методов солюбилизации и рефолдинга рецептора 2AR и родопсина ESR в мицеллах и фосфолипидных нанодисках.
-
Разработка метода получения сорбента для аффинной хроматографии адренорецепторов с целью проверки наличия функциональной активности с возможностью дальнейшего хроматографического разделения активной формы рецептора от неактивной.
-
Отработка условий проведения аффинной хроматографии рецептора на сорбенте с ковалентно иммобилизованным лигандом.
Научная новизна
Впервые в данной работе была разработана и подтверждена методика
солюбилизации и рефолдинга 2-адренергического рецептора человека,
изначально полученного в денатурированном виде в составе телец включения в
клетках E. coli. Было показано, что рекомбинантный рецептор 2AR склонен к
агрегации за счет гидрофобных взаимодействий и образования
межмолекулярных дисульфидных связей. Для решения обозначенной проблемы впервые были получены и экспрессированы новые генетические конструкции данного рецептора с мутированными остатками цистеина, не участвующих в образовании дисульфидных связей в нативном рецепторе и формировании сайта связывания с лигандом. Разработаны методы экспрессии 2AR и его мутантов, позволяющие получать данные белки в количестве до нескольких десятков миллиграммов с литра культуры как на богатых, так и на бедных средах и получать изотопно-меченые образцы белка-рецептора для проведения исследований методами ЯМР-спектроскопии.
Разработана новая методика получения аффинного сорбента с ковалентно связанным альпренололом – антагонистом рецептора 2AR. Предложенный метод дает возможность простого спектрофотометрического контроля степени посадки лиганда на матрицу. Предложен эффективный метод солюбилизации рецептора 2AR в смешанных мицеллах алкилфосфохолинов. Рефолдинг рецептора в мицеллах не прошел - рецептор в мицеллах показал отсутствие взаимодействия с аффинным сорбентом, поэтому решили проводить рефолдинг в нанодисках. Были получены нанодиски с встроенным рецептором, которые специфически взаимодействовали с аффинным сорбентом и это взаимодействие конкурентно удаляется антагонистом рецептора 2AR, альпренололом. Таким
образом был получен функционально активный рецептор 2AR из телец включения.
Пространственная структура бактериального родопсина ESR был решена с разрешением 2,3 методами рентгеноструктурного анализа, выявлены интересные особенности в структуре активного центра, отличные от других родопсинов с известными пространственными структурами, открывающие новые направления в изучении механизма транспорта протонов через мембрану.
Практическая значимость
Адаптирован протокол экспрессии, выделения и очистки
2-адренергического рецептора и бактериального родопсина ESR в клетках E. coli, который позволяет получить необходимое количество образца для дальнейшего изучения его пространственной структуры.
Разработана методика рефолдинга родопсина ESR и рецептора 2AR человека в фосфолипидных нанодисках. Данный подход может быть расширен и перенесен на другие семиспральные мембранные белки.
Предложен и отработан метод получения аффинных сорбентов для
адренергических рецепторов человека – представителей семейства рецепторов
GPCR, позволяющий спектрофотометрически контролировать степень
иммобилизации лиганда на сефарозе. Синтезирована аффинная смола с ковалентно присоединенным к агарозной матрице альпренололом. Показано, что в составе нанодисков происходит рефолдинг мутантной формы 2AR человека в функционально активное состояние. Предложенный метод синтеза может быть использован для получения подобных аффинных сорбентов с различными лигандами для других рецепторов семейства GPCR.
Достигнутые результаты являются одним из ключевых этапов получения стабильного, функционально-активного функционального 2-адренергического рецептора для структурно-функциональных и других биофизических и фармакологических исследований.
Методы исследования
В работе были использованы следующие методы и технологии:
Генетическая инженерия для создания плазмидных конструкций.
Экспрессия рекомбинантных белков в клетках Escherichia coli, ферментация.
Методы выделения мембранных белков: получение очищенных мембран или телец включения, их солюбилизация, ферментативное расщепление,
аффинная, ионобменная, обращеннофазовая и тонкослойная
хроматографии, ультрацентрифугирование, диализ.
Физико-химические и биофизические методы анализа белков: гель-электрофорез, иммуноблоттинг, аналитическая гель-фильтрационная хроматография, динамическое светорассеяние, спектроскопия кругового дихроизма, спектроскопия в ультрафиолетовом и видимом свете.
Биоорганический синтез.
Рентгеноструктурный анализ и ЯМР-спектроскопия
Положения, выносимые на защиту
-
Экспериментальный подход, включающий в себя экспрессию и выделение, позволяющий получить в клетках Escherichia coli рекомбинантный 2-адренергический рецептор человека, его мутантную форму, бактериальный родопсин из Exiguobacterium Sibiricum, и различные варианты белка MSP для сборки нанодисков.
-
Метод солюбилизации и рефодинга рецептора 2AR в фосфолипидных нанодисках, который позволяет получить функционально-активный препарат рецептора для биофизических исследований.
-
Новый метод получения аффинного сорбента с ковалентно иммобилизованным лигандом для выделения активного 2AR рецептора, который может быть применен и для других адренергических рецепторов.
Апробация результатов работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на
следующих международных научных конференциях и семинарах:
международная конференция по биоорганической химии и бионанотехнологии, посвящённая 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова; 14-я международная школа-конференция молодых учёных «Биология – наука XXI века»; 38th FEBS Congress; 6-я конференция «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине»; EUROMAR-2014; Biomembranes-2014; 58-я конференция МФТИ «Актуальные проблемы фундаментальных и прикладных наук в области физики»; конференция «Биомедицинские инновации для здорового долголетия»; Biomembranes-2016.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых
журналах, индексируемых базами данных Web of Sciences, Scopus и РИНЦ, и 8 тезисов докладов на отечественных и международных конференциях.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы на тему искусственных модельных систем для изучения интегральных мембранных белков, материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, выводов, заключения и списка использованной литературы. Диссертационная работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 38 рисунков и 10 таблиц. Список использованных литературных источников насчитывает 300 наименований.