Введение к работе
Актуальность проблемы. Митохондриальный АТФ-чувствительный калиевый канал (митоKATФ) обнаружен в 1991 году методом пэтч-кламп во внутренней мембране митохондрий клеток печени крысы [Inoue et al., 1991]. Однако, еще в 1981 из митохондрий сердца быка проф. Мироновой Г. Д. был выделен белок c м.м. 57 кДа., который при реконструкции в бислойную липидную мембрану (БЛМ) формировал калий - селективные каналы, чувствительные к АТФ.
На сегодняшний день, помимо митохондрий млекопитающих, митоKATФ обнаружен и охарактеризован, в митохондриях растений [Matkovic et al., 2011; Pastore et al., 2007], насекомых [Slocinska et al., 2013], нематод [Wojtovich et al., 2008], и одноклеточных [Kicinska et al., 2007].
Установлено, что митоКАТФ участвует в кардиопротекции, особенно в области защиты от ишемии / реперфузии. [Garlid et al., 1997; Iwai et al., 2000; Lee et al., 2007]. Показана его роль в онкогенезе [Ru et al., 2014; Liu et al., 2014; Laskowski et al., 2016], а так же обнаружено, что митоKATФ участвует в защите от ранних стадий апоптоза [Akao et al., 2001; Akao et al., 2003]. Предполагается, что митоКАТФ участвует в патогенезе нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера [Rodrguez et al., 2013; Wang et al., 2008; Checchetto et al ., 2018]. На модели острого воспаления показано, что митоКАТФ – канал участвует в защите организма при остром воспалении, вызванного бактериальным токсином [Mironova et al., 2018].
Считается, что структура митоКАТФ гомологична структуре
плазматического АТФ - чувствительного калиевого канала, относящегося к семейству Kir6-белков, для которого известны гены, кодирующие его канальные и регуляторные субъединицы [Nichols C., 2006; Li et al., 2017; Martin et al., 2017]. Обнаружен ряд общих ингибиторов и активаторов для обоих белков, а так же их сходство подтверждено иммунохимическими методами [Lacza et al., 2003, 2003; O’Rourke B., 2007; Bednarczyk et al., 2008; Szewczyk et al., 2010; Szabo I., Zoratti M., 2014].
Сегодня, в ряде работ, высказывается предположение о локализации в
митохондриях двух типов АТФ-чувствительных каналов, отличающихся по
дейcтвию на ниx модулятоpов и возможно имеющих различные структуры
[Акопова и др. 2010; Foster M., Coetzee W., 2016]. Один из этих белков
относится к семейству Kir6 - каналов. Второй белок, как мы предполагаем,
выделяемый нами из митохондрий клеток печени крысы белок с молекулярной
массой 57 кДа, который при встраивании в БЛМ, формирует ATФ -
чувствительные каналы. Обнаружено, что N-конец выделяемого
митоxондpиального белка м. м. 57 кДа cxож c N-концом предшественника кальpетикулина, а не Kir6. Полученные предварительные данные электронной – микроскопии с использованием антител к митохондриальному белку м.м. 57 кДа, указывали на возможную локализацию подобного белка в ретикулуме.
В связи с вышесказанным, цель настоящего исследования: изучить структурную принадлежность, локализацию и электрофизиологические свойства белков с м.м. 57 кДа, выделенных из митохондрий и ретикулума клеток печени крыс.
Основные задачи исследования:
-
Определить структурную принадлежность выделенных из митохондрий и ретикулума белков
-
Провести электронно - микроскопические исследования по выяснению внутриклеточной локализации изучаемых белков, а так же сравнить их локализацию с локализацией АТФ - чувствительных калиевых каналов относящихся к Kir6 семейству
-
Изучить электрофизиологические свойства митохондриального м.м. 57 кДа белка и подобного белка выделенного из ретикулума
Новизна исследования. Получены данные о локализации в
митохондриях двух различных по структуре митоКАТФ - каналов. Один из
белков относится к семейству Kir6 - каналов, второй - выделенный нами из
митохондрий белок м. м. 57 кДа, обладает сходством с предшественником
кальретикулина. Установлено, что оба белка локализуются во внутренней
мембране митохондрий, но белки - каналы относящиеся к семейству Kir6,
помимо внутренней мембраны митохондрий локализуются и в плазматической.
Обнаружено, что 5-гидроксидеканоат, селективный блокатор
митохондриальных АТФ - чувствительных калиевых каналов, относящихся к
семейству Kir6, способен ингибировать каналы, образованные
митохондриальным белком м.м. 57кДа., что указывает на участие данного канала в системе транспорта калия в митохондриях. Показана локализация в эндоплазматическом ретикулуме белка - канала м. м. 57 кДа с типичными для АТФ - чувствительных калиевых белков свойствами, который так же обладает структурным сходством с предшественником кальретикулина.
Научно-практическое значение работы. Полученные в работе
результаты о структурной принадлежности, локализации и
электрофизиологических свойствах митохондриального АТФ - чувствительного калиевого канала м.м. 57 кДа, и подобного ему белка, выделенного из эндоплазматического ретикулума, позволят в перспективе более детально понимать механизм их функционирования, а так же упростит поиск и/или синтез селективных модуляторов. Это необходимо в связи со значимостью АТФ - чувствительных каналов, как при различных патологиях, так и при нормальной физиологии клетки и организма в целом.
Апробация работы. Основные результаты диссертации были
представлены на следующих научных конференциях: международная
Пущинская школа - конференция молодых ученых «Биология – наука XXI
века» (Пущино, 2013); международная конференция «Рецепторы и
внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2013, 2015, 2017); международная конференция молодых ученых « Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2012); XII международная научно - техническая
конференция «Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ -
2017» (Севастополь, 2017); 6-ая Российская конференция с международным
участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2011); X
Международный Симпозиум «Биологическая подвижность: новые факты и и
гипотезы» (Пущино, 2010, 2014); International conference of young scientists «
Mitochondrial pores and channels as pharmacological targets» (Пущино, 2014);
International conference «MipTec 2014: The Leading European Event for Drug
Discovery «Translating Science into Drugs» (Basel, Sweatzeland, 2014),
International Conference «Virtual Human – Imaging Across Scales.
BIOMEMBRANES'18» (Dolgoprudny, Russia, 2018).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 статей в зарубежных и отечественных журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК РФ, и 13 тезисов в материалах конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 111 страницах, иллюстрирована 37 рисунками.