Спектры поглощения и кругового дихроизма цитохром с-оксидазы: определение индивидуальных вкладов гемов а и а3 Дюба Артем Владимирович

Содержание к диссертации

Введение

Обзор литературы 13

1. Общие сведения о цитохром с-оксидазе 13

1.1. Дыхательная цепь 13

1.2. Цитохром с-оксидаза 15

1.3. Редокс-цикл цитохром c-оксидазы аа3 18

1.4. Представления о передвижении протонов внутри фермента 20

2. Спектры поглощения гемопротеидов 22

2.1. Основные сведения о структуре и электронных спектрах поглощения порфиринов...22

2.2. Терминология и теоретическая интерпретация электронных спектров порфиринов...28

2.3. Возможные причины расщепления B- и Q-полос гемопротеидов 32

2.5. Спектры поглощения ЦО 36

3. Спектроскопия кругового дихроизма гемопротеидов 41

3.1. Физическая природа кругового дихроизма 41

3.2. Происхождение сигнала КД гемопротеидов

3.2.1. Оптическая активность свободных гемов 43

3.2.2. Взаимодействие гемов с белковым окружением 45

3.2.3. КД гемопротеидов с модифицированным гемом 47

3.3. Методы расчета спектров кругового дихроизма 50

3.3. Круговой дихроизм ЦО 51

4. Взаимодействие ЦО с кальцием 52

4.1. Избирательный спектральный сдвиг, вызываемый кальцием 52

4.2. Ингибирование активности ЦО кальцием 56

Материалы и методы 58

1. Препараты 58

2. Измерения

2.1. Спектры поглощения 58

2.2. Исследования фотовыцветания гемов с помощью фемтосекундной спектроскопии ...58

2.3. Круговой дихроизм 62

2.4. Регистрация быстрой кинетики восстановления 63

3. Обработка данных 63

Результаты 64

Глава 1. Определение абсолютных спектров поглощения восстановленных гемов а и а3 ЦО.64

1.1. Реконструкция индивидуального спектра поглощения восстановленного гема а на

основе избирательного спектрального сдвига этого гема при связывании Ca2+ 64

1.1.1. Абсолютный спектр поглощения гема а 64

Реконструкция -полосы гема а2+ 67

Реконструкция формы полосы Соре гема а2+ 67

1.1.2. Предварительная оценка абсолютного спектра восстановленного гема а3 в области Соре 71

1.2. Избирательное фотовыцветание 77

1.2.1. Избирательное фотовыцветание гема а32+ в цитохром с-оксидазе ba3 из Thermus thermophilus 77

1.2.2. Избирательное фотовыцветание гемов а2+ и а32+ в цитохром с-оксидазе аa3 из сердца быка 81

1.2.3. Выделение «чистых» спектров фотовыцветания гемов а и а3 в ЦО сердца быка 85

1.3. Разделение разностных спектров поглощения гемов а и а3 с помощью исследования быстрой кинетики восстановления ЦО 96

1.3.1. Определение разностного спектра «восстановленный минус окисленный» для гема а3 в области -полосы 96

1.3.2. Обнаружение вклада CuA в изменения поглощения гемов в видимой области...100

1.4. Ингибирование кальцием переноса электронов через гем а 106

1.4.1. Ингибирование переноса электронов к гему а 106

1.4.2. Ингибирование переноса электронов от гема а к гему а3 108

Глава 2. Круговой дихроизм цитохром с-оксидазы 114

2.1. Экспериментальные данные по круговому дихроизму цитохром с-оксидазы 114

2.1.1. Спектры КД цитохромоксидазы без лигандов 114

2.1.2. Спектры КД оксидазы ba3 115

2.1.3. Спектры КД комплексов ЦО аа3 с CO и CN– 118

2.2. Расчет спектров ЦО с помощью модели диполь-дипольного взаимодействия 123

2.2.1. Формулировка модели 123

2.2.2. Результаты расчетов 128

2.2.3. Вклад отдельных гемов в спектры КД и поглощения 133

2.2.4. Влияние отдельных аминокислотных остатков 136 2.2.4. Влияние взаимодействий с дипольными моментами переходов в пептидных

связях 139

Обсуждение 141

1. Индивидуальные спектры поглощения восстановленных гемов а и а3 в полосе Соре: сравнение с литературными данными 141

2. Расщепление полосы Соре восстановленного гема а 148

3. Расщепление полосы Соре восстановленного гема а3 150

4. Различия спектров поглощения гема а32+ в оксидазах аа3- и ba3-типа 157

5. Происхождение оптической активности ЦО 160

Заключение 163

Выводы 164

Благодарности 166

• Цитохром с-оксидаза
• Физическая природа кругового дихроизма
• Исследования фотовыцветания гемов с помощью фемтосекундной спектроскопии
• Предварительная оценка абсолютного спектра восстановленного гема а3 в области Соре

Введение к работе

Актуальность проблемы. Цитохром c-оксидаза (ЦО) участвует в важнейшем процессе аэробного дыхания и действует на конечном участке дыхательной цепи митохондрий и аэробных бактерий, перенося электрон от цитохрома с к О₂ и используя разность их окислительно-восстановительных потенциалов для создания трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов водорода. Расшифровка рабочего цикла ЦО является одной из самых актуальных задач молекулярной биоэнергетики.

В ЦО электрон передается на O₂ по цепочке кофакторов: цитохром c Cu_A гем а гем а₃ Cu_B O₂. Гемы а и а₃ химически идентичны, но отличаются по спиновому состоянию и координации гемового железа. Гем а₃ и Cu_B формируют «биядерный центр», в котором происходит восстановление О₂ до двух молекул воды с захватом 4-х H⁺ из внутренней водной фазы. Кроме того, ЦО транслоцирует протоны через мембрану со стехиометрией 1H⁺/e^-. Для понимания сопряжения транспорта e^- и H⁺ требуется проследить взаимное влияние редокс-состояния металлических центров и pK отдельных аминокислотных групп в протонных каналах. Поэтому нужно иметь возможность избирательно следить за состоянием отдельных редокс-кофакторов, и в первую очередь — гемов а и а₃.

Гемы имеют интенсивные и узкие полосы поглощения в области 400-650 нм, положение и форма которых являются маркерами редокс- и спинового состояния гемов. Однако в ЦО полосы поглощения гемов а и а₃ сильно перекрываются. Наиболее интенсивные полосы (полосы Соре) гемов восстановленной ЦО образуют единый асимметричный пик (Рис. 1А). Несмотря на широкое применение абсорбционной спектроскопии в исследованиях механизма работы ЦО, спектры поглощения отдельных гемов а²⁺ и а₃²⁺ в области Соре до сих пор не были определены. В частности, не выяснено, к какому из гемов относится коротковолновое плечо на спектре восстановленной ЦО. Кроме того, отсутствуют прямые экспериментальные данные о вкладе гема а₃ в спектр ЦО в области - и -полос («видимой области»), где преобладает поглощение гема а.

Сопряженный подход, — спектроскопия кругового дихроизма (КД) в области поглощения гемов, — будучи перспективен с точки зрения изучения структуры и

механизма работы ЦО, без отсутствия понимания происхождения КД ЦО применяется ограниченно. Создание теоретической модели КД ЦО позволило бы описать параметры электронных переходов в гемах и разработать инструмент слежения за состоянием белкового окружения гемов.

Отдельной важной задачей стало исследование взаимодействия ЦО с Ca²⁺. Связывание Ca²⁺ с ЦО избирательно сдвигает спектр поглощения гема а [Wikstrm, Saari 1975], что было использовано нами в качестве одного из подходов к реконструкции индивидуального спектра поглощения гема а²⁺. С другой стороны, недавно обнаружено, что присоединение Ca²⁺ в особом центре связывания катионов ингибирует активность ЦО [Vygodina et al., 2013, 2014]. Было интересно выяснить, сопровождается ли вызываемый Ca²⁺ спектральный сдвиг гема а действием на перенос электронов через этот кофактор.

Цель работы:

Цель настоящей работы заключалась в экспериментальном определении индивидуальных вкладов гемов а и а₃ в спектры поглощения и кругового дихроизма цитохром с-оксидазы из сердца быка, а также в анализе полученных спектров путем их разложения на отдельные электронные и электронно-колебательные переходы.

Основные задачи исследования:

1. С помощью нескольких независимых подходов, включая анализ спектрального сдвига, вызываемого ионами Ca²⁺, и избирательное фотовыцветание, определить форму абсолютных спектров поглощения восстановленных гемов а и а₃ в полосе Соре.

2. Определить разностный спектр «восстановленный минус окисленный» для гема а₃ в области - и -полос поглощения в покоящейся и активированной формах фермента, отличающихся состоянием кислород-редуктазного центра.

3. Выяснить, связан ли спектральный сдвиг полосы поглощения гема а под
действием Сa²⁺ с изменением скорости переноса электронов через гем а.

4. Исследовать оптическую активность цитохром с-оксидазы в разных
состояниях окисления. На основе трехмерной структуры цитохромоксидазы

построить модель сопряженных осцилляторов, включающую гемы и окружающие их ароматические аминокислотные остатки, и с ее помощью исследовать факторы, определяющие сигнал кругового дихроизма цитохромоксидазы в области полосы Соре поглощения гемов.

5. Используя построенную модель, определить параметры отдельных электронных переходов в полосе Соре каждого из гемов.

Научная новизна

Для определения спектральных свойств отдельных гемов а и а₃ впервые применены оригинальные подходы: анализ избирательного сдвига полосы поглощения гема а²⁺ при связывании Ca²⁺ и селективное фотовыцветание гемов а и а₃ в ЦО типа aa₃ и ba₃. Подобраны условия, позволившие разделить во времени фазы восстановления гемов а и а₃ с помощью метода быстрого смешивания, используя в качестве восстановителя высокие концентрации гексааммиаката рутения (RuAm) в присутствии избытка дитионита. Предложенными методами определены формы индивидуальных абсолютных спектров поглощения гемов а²⁺ и а₃²⁺ в области полосы Соре, а в области -полосы — определена форма абсолютного спектра гема а²⁺ и впервые экспериментально получен разностный спектр «восстановленный минус окисленный» для гема а₃. Установлены параметры отдельных электронных переходов в гемах а и а₃. Показано, что коротковолновое плечо полосы Соре на спектре поглощения восстановленной ЦО обусловлено поглощением гема а₃²⁺, а не гема a²⁺, как было принято считать ранее.

Исследования быстрой кинетики восстановления ЦО позволили впервые выявить существенный вклад «видимой меди» Cu_A в абсорбционный спектр ЦО сердца быка в области -полос поглощения гемов.

Впервые предложена модель, связывающая спектры КД ЦО с трехмерной структурой фермента. Показано, что сигнал КД ЦО в области полосы Соре объясняется диполь-дипольным взаимодействием гемов друг с другом и с окружающими ароматическими аминокислотными остатками.

Несколькими независимыми методами подтверждено расщепление полосы Соре гема а²⁺. При моделировании спектров КД показано, что диполь-дипольное

взаимодействие способствует расщеплению электронных переходов полосы Соре.

Впервые установлено, что связывание ионов Ca²⁺ ингибирует поступление электронов на гем а и перенос электрона с гема а на гем а₃.

Научно-практическая значимость работы

Данная работа позволяет лучше понять и интерпретировать спектральные свойства ЦО аа₃ из сердца быка и ba₃ из Thermus thermophilus. Результаты углубляют современные представления о спектрах низко- и высокоспиновых гемов и представляют интерес для специалистов в области спектроскопии поглощения гемопротеидов и, в особенности, терминальных оксидаз, а также для исследователей, использующих метод абсорбционной спектроскопии для изучения гем-содержащих ферментов. Предложенный метод избирательного фотовыцветания, примененный в данной работе к оксидазам аа₃ и ba₃, может быть полезен при изучении других мультигемовых белков. Модели сопряженных осцилляторов, аналогичные описанной в данной работе, могут быть использованы при изучении КД белков, пептидов и нуклеиновых кислот.

Положения, выносимые на защиту

3. С помощью нескольких независимых подходов разделены перекрывающиеся спектры поглощения восстановленных гемов а и а₃ в полосе Соре цитохром с-оксидазы. Полученные разными методами формы спектров согласуются между собой.

4. Формы индивидуальных полос поглощения восстановленных гемов а и а₃ не соответствуют общепринятым в литературе. Найдены возможные причины ошибок в предшествующих работах.

5. Спектр поглощения каждого из восстановленных гемов может быть описан вкладами двух чисто электронных переходов, расщепленных по энергии на ~10 нм. В отличие от спектра гема а, спектр гема а₃ содержит вклад дополнительной коротковолновой полосы, предположительно описывающей совокупность вибронных спутников.

6. Разделение фаз восстановления гемов а и а₃ с помощью методов быстрой кинетики позволило впервые получить экспериментально разностный спектр

(восстановленный минус окисленный) гема а₃; форма спектра существенно отличается для активированной и неактивированной цитохромоксидазы.

5. Сдвиг спектра поглощения гема а, вызываемый присоединением ионов Ca²⁺ в специальном центре связывания катионов, сопровождается замедлением переноса электронов через этот редокс-центр.

6. Разработана модель, позволяющая рассчитать спектр КД цитохромоксидазы в полосе Соре на основании спектра поглощения и трехмерной структуры фермента. Оптическая активность фермента может быть количественно объяснена диполь-дипольным взаимодействием гемов друг с другом и белковым окружением. Моделирование кругового дихроизма подтверждает расщепление электронных переходов в восстановленном геме а.

7. Изменения поглощения в области 470-580 нм, сопровождающие
восстановление гема а, содержат заметный вклад видимой меди “Сu_A”, обычно
считающейся бесцветной в этом диапазоне.

Апробация. Результаты диссертационной работы представлены на 16-ой, 17-ой и 18-ой Европейских конференциях биоэнергетиков (Варшава, 2010, Фрайбург, 2012, Лиссабон, 2014), международных конференциях «Математика. Компьютер. Образование» (Дубна/Пущино, 2008, 2009, 2010), 17-й конференции студентов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010) и 79-й Гарденовской конференции «Выделение и восстановление кислорода — общие принципы» (Инсбрук, 2016).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 18 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах из «Перечня ВАК РФ».

Структура и объем работы. Диссертационная работа включает 209 страниц машинописного текста, 8 таблиц, 66 рисунков, и содержит разделы «Введение», «Обзор литературы», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Приложения». Список цитированной литературы включает 244 источника.

Цитохром с-оксидаза

Биядерный центр ЦО располагается на расстоянии примерно 1/3 толщины мембраны от ее внешней стороны, обращенной в межмембранное пространство. Поэтому не только помповые, но и «химические» протоны, поступающие из внутренней водной фазы, вынуждены преодолевать в гидрофобной внутрибелковой среде значительные расстояния. В структуре ЦО прослеживаются специальные пути — протонные каналы, через которые осуществляется перенос протонов в белке поперек мембраны. Они состоят из кластеров молекул воды и протонируемых аминокислотных остатков, образующих сеть водородных связей, а протоны внутри них движутся по механизму Гротгуса. Оксидазы класса А содержат, по меньшей мере, два таких пути, называемых D- и K-каналами (рисунок 4), согласно ключевым аминокислотным остаткам, участвующим в образовании цепи. D-канал начинается с аспартата D91B.t. (нумерация для ЦО сердца быка, Bos taurus) и через остатки N98B.t. и M71B.t. ведет к расположенному в глубине мембраны глутамату E242B.t.. Этот остаток, как предполагается, выполняет функции диспетчера: он может через альтернативные цепочки молекул воды передавать протоны либо в кислород-редуктазный центр (химические протоны), либо -пропионатной группе гема а3 («над» кислород-редуктазным центром), откуда они переносятся далее на другую сторону мембраны. В настоящее время установлено, что через D-канал проходят два химических и все помповые протоны [28,29].

K-канал проходит через лизин K319B.t. и треонин T316B.t. к гидроксильной группе гема а3 и тирозину 244B.t., ковалентно связанному с одним из лигандов CuB и ведет, таким образом, непосредственно к каталитическому центру [7]. Мутантная форма аа3 из Rh. sphaeroides, в которой ключевой лизин K362R.s., соответствующий K319B.t., заменен на метионин (К362МR.s.), не восстанавливает кислород, однако работает, используя в качестве акцептора пероксид водорода, а в качестве донора — цитохром с или ферроцианид. При этом ее пероксидазная активность аналогична пероксидазной активности фермента дикого типа, и этот мутантный фермент способен транслоцировать протоны. Однако формы, мутантные по остаткам D-канала (D132NR.s. и E286QR.s.), не обладают пероксидазной активностью. Восстановление гема а3 полностью окисленной ЦО дитионитом сильно заингибировано в случае мутантной формы K362MR.s., но не D132NR.s. и E286QR.s..

Таким образом, мутации в D-канале останавливают цикл в пероксидазной фазе, блокируя захват протонов. Мутации в K-канале не сказываются на протекании пероксидазной фазы и, в частности, способности фермента транслоцировать помповые протоны, однако сильно затрудняют начальные этапы восстановления биядерного центра в ходе оксидазной фазы [30]. По всей вероятности, в оксидазной фазе K-канал захватывает химические протоны, транспорт которых сопряжен с начальным восстановлением биядерного центра. В пероксидазной фазе, предположительно, захват химических протонов и перенос помповых происходит через D-канал (рисунок 3).

Помимо D- и K-каналов, в структуре митохондриальной ЦО прослеживается сквозной H-канал (рисунок 4), расположенный со стороны гема а. В бактериальных ферментах H-канал сохранен лишь частично (отсутствует его выходная часть). В настоящее время благодаря появлению возможности введения одиночных мутаций в бычий фермент, появляются первые данные, свидетельствующие о функциональной значимости этого канала. Согласно различным представлениям, он может либо транслоцировать протоны из матрикса в межмембранное пространство [7,31], либо проводить их в обратном направлении, обеспечивая контролируемое внутреннее разобщение [32,33], либо может представлять собой просто пару диэлектрических пор, открывающихся по разные стороны мембраны и облегчающих электронный транспорт через гем а [34].

Механизм сопряжения электронного и протонного транспорта в ЦО активно исследуется [6,7,26]. Обычно для простоты принимается, что для каждого из четырех электронов цикла этот механизм одинаков, и, кроме того, что этот механизм одинаков для бактериального и митохондриального фермента класса А; и то и другое вообще говоря, не очевидно (см. например, [26]). Один из возможных схематических вариантов механизма с указанием последовательности стадий переноса электрона и протонов представлен на рисунке 5. Предполагается, что в нем играет важную роль так называемый «сайт загрузки протона» (proton-loading site, PLS), находящийся «над» каталитическим центром.

Гемы а и а3, обуславливающие основную часть поглощения света ЦО в области 350-700 нм, относятся к классу металлопорфиринов, — соединений, играющих ключевую роль в аэробном дыхании, фотосинтезе, окислительно-восстановительном метаболизме, защитных реакциях, а также могущих служить сенсорами определенных веществ.

Родоначальником ряда порфиринов является порфин, молекула которого содержит четыре пиррольных кольца, объединенных метиновыми мостиками в общую систему сопряжения (рисунок 6А) [35]. Атомы водорода при любом из атомов углерода 1-8 и - могут быть заменены заместителями. Класс порфиринов разделяют на собственно порфирины,

Физическая природа кругового дихроизма

Как показал Розенфельд (Rosenfeld, [101]), вращательная сила перехода равна мнимой части скалярного произведения соответствующих ему магнитного и электрического дипольного моментов (см. уравнение (8)). Кирквуд (Kirkwood, [136]) предложил метод расчета оптической активности больших молекул, аппроксимируя ее набором независимых модульных хромофоров, в каждом из которых возможны магнитно и электрически разрешенные переходы. Однако в действительности в большинстве случаев эти модули не хиральны, и не включают магнитно разрешенных переходов [137]. Тем не менее, как показал Кун (Kuhn, [138]), оптическая активность возникает даже в системе линейно колеблющихся зарядов, если эта система удовлетворяет определенным геометрическим параметрам. ДеВое (DeVoe, [139]) разработал удобный классический метод расчета спектров КД, широко применявшийся впоследствии. Согласно его схеме, электронные переходы отдельных хромофоров макромолекулы рассматриваются как осциллирующие точечные диполи, взаимодействующие друг с другом и с внешним полем. Рассчитанный КД определялся через элементы матрицы, обратной матрице диполь-дипольного взаимодействия. Эта матрица рассчитывается отдельно для каждой длины волны, поэтому спектр КД определяется поточечно. Апплеквист (Applequist, [140]) разработал модификацию этого метода, показав, что при определенных допущениях задачу можно свести к задаче диагонализации матрицы, и спектр в таком случае будет представлять собой сумму полос — «нормальных мод». (Подробное описание и математическую формулировку методов ДеВое и Апплеквиста, применяемых в нашей работе, см. в Главе 2 Результатов). Альтернативно, можно квантовомеханически вычислить вращательную силу согласно формуле Розенфельда (8), составив вековой детерминант, в котором диагональные элементы представляют собой энергии переходов, а недиагональные элементы — энергии взаимодействия разных переходов. При диагонализации детерминанта новые состояния получаются как линейные комбинации исходных [141,142]. Новые состояния соответствуют движениям электрических индуцированных диполей в фазе либо в противофазе, а возникающий магнитный момент обусловлен совместным движением электрических диполей [142]. Этот метод получил название «матричного метода» [128]. Можно показать, что метод нормальных мод Апплеквиста эквивалентен матричному методу.

При малых расстояниях между хромофорами (сравнимых с ван-дер-ваальсовскими радиусами) приближение точечных диполей становится недостаточным. Для более точного описания Тиноко (Tinoco, [143]) предложил использовать точечные монополи, расположенные на локализованных зарядах. Этот метод использовали Хсу и Вуди [118] для расчета КД миоглобина и гемоглобина.

С развитием методов квантовой химии стали возможны прямые квантовомеханические расчеты вращательных сил. В группе Вуди был оценен вклад непланарности в КД миоглобина. Первые расчеты моделировали гем как порфирин-дианион, и включали лишь электроны сопряженной системы [72,119]. В более современных работах используется метод TDDFT как для расчетов в приближении порфирин-дианиона [135], так и для расчетов с учетом гемового железа (группа Нагаи, [113]).

Недавно был предложен ряд новых методов, специализированных на эффективном расчете кругового дихроизма [60,66,144–150]. Сочетание развитой теории с экспериментальной простотой спектроскопии КД привело к появлению концепции «электронного КД, снабженного теорией» (theory-aided electronic circular dichroism) как метода определения абсолютной конфигурации сложных молекул [148].

Сигналы кругового дихроизма цитохромоксидазы наблюдаются в тех же областях спектра, что и основные полосы поглощения. В спектре окисленного фермента в области Соре наблюдается сигнал, положение максимума которого в разных исследовательских работах варьирует от 425 нм до 428.5 нм, а его интенсивность — от 35 M-1cm-1 [111] до 73 M-1cm-1 [115,151]. Кроме того, имеются два слабых минимума в области - и -полосы, соответственно, при 570 нм и 620 нм.

Спектр КД полностью восстановленного фермента в области Соре обладает максимумом при 446 нм ( 145 M-1cm-1), а в области -полосы имеется максимум при 607.5 нм ( 14 M-1cm-1). При этом положение максимума в Соре по данным разных авторов практически совпадает (445–446) нм, однако амплитуда сигнала весьма сильно варьирует от работы к работе (от 115 [115] до 146 [151] M-1cm-1).

В отличие от исследований оптической активности мио- и гемоглобинов, работы по интерпретации КД ЦО крайне ограничены. В случае мультигемовых гемопротеидов, к которым относится ЦО, имеет место дополнительный фактор, влияющий на сигнал КД: взаимодействие гемов. Так, для нескольких мембранных мультигемовых цитохромов были выявлены экситонные взаимодействия между гемами. В качестве примеров можно указать дигемовые цитохромы b из хромаффинных гранул [152], цитохромные комплексы дыхательной (bc1) и фотосинтетической (b6f) цепи, а также некоторые сукцинат-хинон редуктазы (см. [153]). Кроме того, сильное экситонное взаимодействие было обнаружено между высокоспиновыми гемами b595 и d в кислород-восстанавливающем центре хинолоксидазы типа bd из Escherichia coli [9].

В ранних работах, посвященных КД ЦО, выполненных до появления трехмерной структуры фермента, исследователи сходились на том, что гемы располагаются слишком далеко друг от друга, чтобы могли иметь место прямые диполь-дипольные взаимодействия между ними [112]. Позже были описаны спектры бактериальной оксидазы типа ba3 из Thermus thermophilus [154], при этом также утверждалось отсутствие диполь-дипольных взаимодействий между гемами. Тем не менее, недавно на модельных соединениях было показано, что диполь-дипольное взаимодействие порфиринов может проявляться на расстояниях вплоть до 30 [155], в то время как расстояние между атомами железа гемов а и а3 ЦО составляет 13 [11], то есть достаточно близко для проявления диполь-дипольного взаимодействия. Применяя классическую теорию поляризуемости ДеВо, Вуди показал, что взаимодействие гемов может давать вклад в КД димеров и тетрамеров гемоглобиновых субъединиц и указал на возможность такого вклада в спектры КД цитохромоксидазы [156].

Однако систематическое изучение КД ЦО прекратилось примерно в 1975 году, прежде чем были получены основные биофизические и биохимические сведения о ферменте, и примерно за 20 лет до того, как были расшифрованы первые кристаллические структуры ЦО [12,16,157]. Поэтому вопрос о происхождении сигналов КД с тех пор оставался нерешенным. В данной работе мы представляем модель сопряженных осциллирующих диполей, позволяющую объяснить спектр КД на основе данных трехмерной структуры ЦО.

Исследования фотовыцветания гемов с помощью фемтосекундной спектроскопии

Чтобы оценить применимость метода, мы сначала реконструировали -полосу гема а2+, поскольку ее форма примерно известна как из суммарной -полосы гемов аа3 в восстановленном ферменте, так и из хорошо охарактеризованного разностного спектра поглощения гема а (восстановленный минус окисленный) в этой области; основной вклад в оба эти спектра дает, как считается, интенсивный максимум восстановленного гема a2+, тогда как убыль поглощения окисленной формы гема а в разностном спектре или вклад восстановленного гема а3 в суммарном спектре аа3 не столь значительны, хотя и не пренебрежимо малы. Нормированная первообразная разностного спектра Ca2+-индуцированного спектрального сдвига в области -полосы приведена на рисунке 16 (черная кривая). Кривая представляет собой несколько асимметричный пик с максимумом 605 нм полушириной 17 нм (460 см-1), что довольно близко к характеристикам основного пика 605 нм в разностном спектре «восстановленный минус окисленный» гема а в области -полосы [79]. Ввиду асимметричной формы, одной гауссовой компоненты недостаточно для описания первообразной, однако кривая хорошо аппроксимируется парой гауссовых компонент с одинаковыми полуширинами 15 нм (397 см-1), но разными амплитудами и максимумами при 595 нм (16807 см-1) и 606 нм (16513 см-1) (рисунок 16). Наличие двух компонент одинаковой ширины может свидетельствовать о невырожденности двух индивидуальных электронных переходов в Q-полосе гема а. Расщепление Qx,y-переходов составляет 11 нм (294 см-1), при этом вклад длинноволновой полосы Qy (75%) заметно превышает вклад полосы Qx (25%).

В области полосы Соре разностный спектр Ca2+-индуцированного длинноволнового сдвига имеет практически симметричную форму и характеризуется минимумом при 439 нм, максимумом при 455 нм, но при этом также имеет выраженную «точку перегиба» при 447 нм (рисунок 17А, спектр 1) [174]. Разница показателей поглощения в минимуме и максимуме составляет 11 мМ-1см-1. Рисунок 16. Реконструкция -полосы поглощения восстановленного гема а. Черная кривая — первообразная видимой области разностного спектра, обусловленного связыванием кальция, красная кривая — ее аппроксимация суммой гауссовых компонент (показаны синим). спектра поглощения восстановленного А – сравнение экспериментального разностного спектра, характеризующего индуцируемый Са2+ спектральный сдвиг полосы поглощения гема а (спектр 1), и первого дифференциала спектра ЦО в комплексе с цианидом a2+a33+–CN, представленного на рис. 2А (спектр 2). Б – реконструированная полоса поглощения восстановленного гема а, полученная как первообразная разностного спектра, характеризующего кальциевый сдвиг. Поглощение нормировано на амплитуду в максимуме. Нулевая линия была скорректирована (прибавлена постоянная величина 0.0244). Спектральный ответ ЦО, вызываемый ионами кальция, носит избирательный характер: в длинноволновую область сдвигается не весь спектр в области Соре, а лишь некоторые из полос поглощения. В этом можно убедиться, например, построив дифференциал абсолютного спектра цианидного комплекса ЦО (спектр 2 на рисунке 17А), который не совпадает с эффектом кальция. При сравнении формы дифференциала с формой экспериментально полученного разностного спектра кальциевого сдвига (сплошная линия) видно сходство спектров в длинноволновой области, тогда как в районе более коротких волн кривые существенно различаются. Большее сходство спектров на длинноволновом крыле согласуется с тем, что к связыванию ионов кальция чувствителен восстановленный гем а, поглощающий в более длинноволновой части спектра. Центр разностного спектра, характеризующего кальциевый сдвиг, находится при 447 нм, что соответствует максимуму поглощения восстановленного гема а, но не цианидного комплекса гема а3.

Характерная форма спектра в области у-полосы поглощения (наличие «точки перегиба» между экстремумами) может означать, что имеет место наложение первых производных как минимум двух близких по величине и ширине полос поглощения, отстоящих друг от друга на таком расстоянии, что максимум производной спектра коротковолновой полосы накладывается на минимум производной длинноволновой полосы, так что они компенсируют друг друга, давая точку пересечения нуля; иными словами, форма разностного спектра может говорить о том, что кальций вызывает длинноволновый сдвиг двух близрасположенных полос. Рисунок 17Б демонстрирует абсолютный спектр гема а (первообразную) для участка (420 — 480) нм, нормированный на максимальное значение.

Спектр имеет симметричную форму без признаков коротковолнового плеча в районе 425 нм, что не соответствует форме «классического» спектра гема а2+, опубликованного Ваннесте [78] и вошедшего в обзоры и монографии, но, скорее, согласуется с данными Orii [86] (см. рисунок 11 в разделе «Обзор литературы»).

На рисунках 18 и 19 представлены результаты моделирования полученного спектра одной и двумя гауссовыми кривыми. Для обоих случаев приведена разность с модельной кривой, показывающая, насколько хорошо совпадают модельная и подгоняемая кривая. Видно, что одна гауссова компонента не может удовлетворительно описать первообразную, в то время как суперпозиция двух гауссовых компонент одинаковой полуширины и близких по амплитуде (рисунок 19, красная линия) достаточно хорошо совпадает с полученным спектром гема а2+ (черная линия) на участке 430-470 нм. Разность между первообразной и модельным спектром представляет собой неструктурированный практически нулевой сигнал. Таким образом, две компоненты необходимы и достаточны для описания формы полученной первообразной на участке 430-470 нм.

Найденные гауссианы с максимумами при 442 и 451 нм, полушириной 12 нм (588.7 см-1) и амплитудой максимальных значений 0.68 и 0.77 могут соответствовать невырожденным Bx- и By-переходам в порфириновом кольце, что согласуется с описанным выше расщеплением Qx- и Qy- переходов в -области. Однако величина расщепления (451 см-1) в 1.5 раза превышает расщепление -полосы. Соответственно, полуширина реконструированной полосы Соре гема a2+ (869 см-1) существенно больше, чем для реконструированной -полосы (460 см-1), что согласуется с соотношением полуширин полос поглощения восстановленных низкоспиновых гемопротеидов (например, 917 см-1 и 483 см-1 для - и -полос гемов b сукцинат: коэнзим Q-оксидоредуктазы).

Более выраженное расщепление полосы Соре может быть обусловлено эффектами неоднородного электрического поля, наведенного окружающими зарядами, которые сильнее сказываются на более интенсивных полосах [54,71].

Считается, что основной вклад в спектр поглощения восстановленной ЦО в области 400-700 нм вносят гемы а и а3. Поэтому путем вычитания из спектра полностью восстановленного фермента полученного нами спектра поглощения восстановленного гема а можно получить предварительное представление о спектре восстановленного гема а3. Следует заметить, что проведенная процедура интегрирования разностного спектра действия кальция дает форму, но не величину спектра поглощения гема а2+, и для получения собственно спектра должна быть умножена на коэффициент экстинкции. Имеющиеся в литературе оценки коэффициента экстинкции гема а2+ в максимуме поглощения полосы Соре составляют 95-115 мМ-1см-1. Приведенная к единице кривая формы спектра гема а (рисунок 19) была умножена нами на выбранное значение коэффициента экстинкции 109 мМ-1см-1, и этот спектр гема а был вычтен из экспериментального спектра восстановленной ЦО (нормированного на концентрацию фермента).

Предварительная оценка абсолютного спектра восстановленного гема а3 в области Соре

Спектральные изменения в этих условиях хорошо описываются моделью одностадийного перехода 1 2, в которой состоянию 1 соответствует комплекс а2+а33+, а состоянию 2 — комплекс а2+а33+. Глобальный анализ спектральных изменений в ходе перехода 1 2 дает разностный спектр "восстановленный минус окисленный" для гема а3 (рисунок 31). В области Соре спектр имеет минимум при 418 нм (исчезновение окисленной формы а3), максимум при 445 нм (образование восстановленной формы а3) и изобестическую точку при 430.5 нм. В области - и -полос он характеризуется максимумом при 605 нм и выраженным плечом при 575 нм. Провал при 650 нм обусловлен исчезновением полосы переноса заряда, которую приписывают либо самому окисленному гему а33+ либо взаимодействию окисленного гема а3 с окисленной «невидимой» медью, CuB [184]. Следует еще раз отметить, что приведенный на рисунке 31 спектр восстановления гема а3 получен для «активированной» формы ЦО. Ниже (см. п. 1.4.2) будет приведен разностный спектр "восстановленный минус окисленный" для гема а3 в покоящейся форме фермента.

Обычно считается, что ионы меди CuA и CuB «бесцветны» и не дают заметного вклада в поглощение ЦО в обычном диапазоне исследований 400 – 700 нм. Известно, что окисленной CuA принадлежит широкая слабая полоса ( 1 мМ-1см-1) в ближней инфракрасной области ( 830 нм), выцветающая при восстановлении [185], которая и используется обычно для слежения за редокс-состоянием CuA. Однако в литературе можно найти отдельные указания на возможность небольшого вклада окисленной CuA в области поглощения гемов [186–188].

Чтобы лучше охарактеризовать взаимодействие дитионита и RuAm с ЦО, а также получить кинетическим методом разностный спектр восстановления гема а без вклада гема а3, мы подробно исследовали кинетику восстановления цианидного комплекса ЦО (аа3-CN) дитионитом в присутствии различных концентраций RuAm (0-3000 мкМ) методом быстрого смешивания с быстрой регистрацией спектров на фотодиодной матрице [189]. Как уже говорилось, в цианидном комплексе гем а3 зафиксирован цианидом в окисленном состоянии, и взаимодействие с дитионитом и RuAm приводит к восстановлению только одного из двух гемов. Было найдено, что процесс практически монофазен и его скорость линейно зависит от концентрации RuAm в диапазоне 10-500 мкМ с константой скорости второго порядка kv 0.53 106 М-1с-1. При концентрациях RuAm 10-4 М удается проследить кинетику восстановления гема а.

Типичное изменение во времени абсолютных спектров поглощения цианидного комплекса ЦО при смешивании с дитионитом в присутствии 10 мкМ RuAm показано на рисунке 32. В области полосы Соре наблюдаются две изобестические точки при 437.5 нм и при 463.5 нм, свидетельствующие о том, что заметный вклад в изменения поглощения дают превращения всего одного хромофора: переход гема а из окисленной в восстановленную форму [189].

Полученный таким образом разностный спектр восстановления гема а (рисунок 33А) характеризуется в области Соре минимумом при 428 нм и максимумом при 449 нм, а в видимой области имеет пик -полосы при 605 нм и две узких полосы -области при 520 и 563 нм.

В области альфа-полосы достаточно хорошо сохраняются изобестические точки при 624 нм и (несколько хуже) 584 нм (рисунки 32, 33А). Однако по коротковолновую сторону от 584 нм, в области -полосы поглощения гемов, хорошо заметно несохранение изобестических точек, свидетельствующее об участии в процессе более чем одного хромофора [189]. В диапазоне 470-580 нм наблюдаются два одновременных разнонаправленных процесса: рост узких полос при 520 нм и 560 нм, принадлежащих, как считается, восстановленному гему а, синхронный с ростом пика гема а при 605 нм, и выцветание широкой полосы с максимумом в районе 480 нм. Спектр выцветания этой полосы (то есть первый спектр из серии за вычетом последнего) имеет форму широкого асимметричного пика с максимумом 475 нм, величиной около 5 мМ-1см-1, на который накладывается в виде провала более узкая полоса 520 нм, обусловленная восстановлением гема а (рисунок 33Б, черная кривая). Единственный редокс-центр ЦО, способный в данных условиях к быстрому восстановлению, протекающему практически одновременно с восстановлением гема а, — это «видимая» (методом ЭПР) медь CuA. Поэтому можно предположить, что наблюдаемые изменения, нарушающие изобестические точки гема а в видимой области, — это восстановление CuA. Действительно, из литературы известно, что медь-содержащие белки, содержащие биядерный центр, аналогичный по структуре центру CuA в цитохромоксидазе, в окисленной форме обладают широкими полосами поглощения в области 500 нм, выцветающими при восстановлении.

Для сравнения, на рисунке 33Б приведен фрагмент спектра поглощения медьсодержащего белка, сконструированного в лаборатории Лу (Lu, [186,187]) на основе азурина, в котором структура биядерного медного центра моделирует CuA цитохромоксидазы (красная кривая). Можно видеть, что белок дает поглощение близкой величины в той же области спектра с максимумом около 480 нм. Сходный спектр поглощения, отнесенный предположительно к CuA, можно найти в работе, выполненной на мутантном штамме бактериальной ЦО, в котором восстановление гема а, вследствие мутации, становится термодинамически неблагоприятным, так что в быстрой фазе восстановления фермента предположительно происходит лишь восстановление CuA [190].

Таким образом, проведенное нами исследование быстрой кинетики восстановления ЦО в цианидном комплексе фермента свидетельствует, что окисленная CuA дает заметный вклад в поглощение ЦО не только в ближней инфракрасной области (максимум при 830 нм), но и в видимой части спектра. Это обстоятельство, с одной стороны, следует учитывать как осложняющий фактор при анализе окисления-восстановления гемов ЦО с помощью спектроскопии поглощения, а с другой — открывает возможность слежения за динамикой окисления-восстановления CuA в более чувствительном и удобном для исследования спектральном диапазоне, чем ближняя инфракрасная область.

Следует отметить, что при восстановлении свободной от лигандов ЦО в присутствии 3 мМ RuAm CuB тоже должна восстанавливаться за времена, сравнимые с временами восстановления гема а3, и могла бы давать вклад в изменения поглощения. Однако при данной точности измерений мы не видим каких либо указаний на существенный вклад восстановления CuB в наблюдаемые изменения экстинкции ни в полосе Соре, где наблюдается хорошая изобестическая точка при 429 нм, ни в видимой области, где также не наблюдается явных признаков дополнительных спектральных изменений, не обусловленных восстановлением гема а3.