Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 8
1.1 Взаимодействие ДНК с пептидами и белками 8
1.1.1 Структурные характеристики ДНК 17
1.1.2 Механизмы распознавания сайтов связывания на ДНК белками 21
1.1.3 Сайт-специфическое взаимодействие белков с ДНК по большой бороздке 25
1.1.4 Сайт-специфическое взаимодействие белков с ДНК по малой бороздке 27
1.2 Взаимодействие ДНК с короткими пептидами 28
1.2.1 Виды биологически активных пептидов 28
1.2.2 Способы пептидов проникать через клеточную и ядерные мембраны 37
1.2.3 Возможные механизмы взаимодействия коротких пептидов с молекулой ДНК 38
1.3 Связывание ДНК с различными аминокислотами 40
Глава 2 Материалы и методы исследования 46
2.1 Материалы 46
2.2 Методы исследования 48
2.2.1 Некоторые сведения из статистики биополимеров 48
2.2.2 УФ-спектрофотометрия 53
2.2.3 Метод кругового дихроизма 55
2.2.4 Плавление ДНК 56
2.2.5 Низкоградиентная вискозиметрия 56
2.2.6 Люминесценция 57
2.2.7 Изотермическое калориметрическое титрование 59
2.2.8 Ядерно-магнитный резонанс. WaterLOGSY 61
2.2.9 Динамическое двойное лучепреломление 65
Глава 3 Результаты и их обсуждение 68
3.1 Исследование взаимодействия пептида AEDG с ДНК 69
3.2 Исследование взаимодействия пептида AEDL с ДНК 76
3.3 Исследование взаимодействия пептида EDR с ДНК 87
3.4 Исследование взаимодействия пептида KEDW с ДНК 98
3.5 Ядерный магнитный резонанс систем ДНК-пептиды. Метод WaterLOGSY 106
Заключение 113
Выводы 116
Перечень условных обозначений и сокращений 117
Список терминов 119
Благодарности 120
Список литературы 121
- Взаимодействие ДНК с пептидами и белками
- Связывание ДНК с различными аминокислотами
- Исследование взаимодействия пептида AEDL с ДНК
- Ядерный магнитный резонанс систем ДНК-пептиды. Метод WaterLOGSY
Взаимодействие ДНК с пептидами и белками
Специфическое взаимодействие различных белков с ДНК лежит в основе большинства биологических процессов. ДНК-белковые взаимодействия можно условно разделить на 2 категории: специфическое связывание белков или их частей с определенными последовательностями ДНК (так называемое прямое считывание) и неспецифическое связывание (непрямое считывание). Связывание аминокислот, входящих в состав белков, с определенными азотистыми основаниями может осуществляться как по малой, так и по большой бороздкам ДНК. Неспецифическое связывание может быть обусловлено, например, изгибом двойной спирали ДНК или оно может осуществляться в результате локальных изменений формы ДНК (например, когда большая бороздка сужается) [4].
Перед обсуждением основных способов взаимодействия ДНК и белков стоит также отметить базовые представления о термодинамике ДНК-белкового комплексообразования. Так же как и для большинства процессов, связывание белков с молекулой ДНК определяется изменением значений свободной энергии Гиббса G!!"#$, - это разница энергии свободных молекул ДНК и белка и энергии комплекса. Значение и знак G!!"#$ характеризует наличие связывания и степень аффинности комплекса, которая выражается константой связывания Ka: G!!"#$ = -RTlnK! (1), где Ka - константа связывания, M-1, G!!"#$ – изменение свободной энергии Гиббса, Дж, T – температура, в градусах K, R- универсальная газовая постоянная.
Для специфического ДНК-белкового связывания характерно формирование кинетически и термодинамически стабильного молекулярного комплекса с четко определенной стехиометрией (это следствие определенного количества доступных сайтов связывания), тогда как неспецифическое связывание рассматривается как случайное взаимодействие белка или его части с любым участком ДНК.
ДНК-белковые взаимодействия с характерными значениями констант связывания в интервале Ka от 108 до 1011 M-1 считаются специфическими, в то время как для слабых неспецифических взаимодействий характерен интервал значений от 103 до 105 M-1[4].
Для оценки вклада различных процессов в изменение энергии при связывании необходимо учитывать энтальпийный и энтропийный вклад в изменение свободной энергии Гиббса: !!"#$ = !!"#$ + (-!!"#$) (2), где !!"#$ – изменение энтальпии при связывании, !!"#$ – изменение энтропии при связывании. В большинстве случаев энтальпийная и энтропийная части вносят противоположный вклад в изменение свободной энергии Гиббса при комплексообразовании. Действительно, для большинства белков благоприятное изменение энтальпийного вклада (!!"#$ 0) влечет за собой неблагоприятное изменение энтропийного вклада (-!!"#$ 0). Может наблюдаться и противоположная ситуация, когда благоприятное изменение энтропийного вклада ( -!!"#$ 0 ) сопровождается неблагоприятным изменением энтальпийного вклада (!!"#$ 0) [4]. Вод ородные связи, Ван-дер-Вальсовы или электростатические взаимодействия между белком и ДНК обычно положительно влияют на энтальпию, тогда как десольватация полярных групп и изменение структурных характеристик комплекса являются источником нежелательных изменений энтальпийного вклада. Изменения энтропии отражают вклад различных процессов, связанных с комплексообразованием, поэтому высвобождение молекул воды и перераспределение и онов благоприятно для комплексообразования, тогда как потеря поступательной, вращательной и колебательной степеней свободы, а также сворачивание пептидных цепей во время образования ДНК-белкового комплекса относятся к энтропийно неблагоприятным процессам [5].
Согласно существующим представлениям, механизм специфического распознавания последовательностей ДНК белками, в частности, факторами транскрипции включает два основных этапа. На первом этапе неспецифические дальнодействующие электростатические взаимодействия сближают белок и ДНК. Первый этап формирования комплекса сопровождается скольжением белка вдоль ДНК в одномерном процессе диффузии, что приводит к ускорению поиска белком нужной нуклеотидной последовательности. Как только белок обнаружил целевую последовательность ДНК, устанавливаются специфические взаимодействия. Образование комплекса часто сопровождается конформационными перестройками ДНК и белка [5].
Основываясь более чем на 1500 структурах ДНК-белковых комплексов, доступных в банке дан ных о белках PDB (Protein data bank), можно утверждать, что отдельные ДНК-связывающие белки используют множественные типы взаимодействий для достижения специфичности связывания с ДНК.
Несмотря на то, что структура ДНК была впервые предложена Уотсоном и Криком еще в 1953 году [7], до настоящего времени еще нет полного понимания механизма ДНК-белкового взаимодействия. Особый интерес вызывает механизм распознавания специфических сайтов связывания, учитывая большое разнообразие ДНК-связывающих белков. Большинство ДНК-связывающих белков является частью больших семейств, обладающих ДНК-связывающими доменами с очень похожими биохимическими свойствами. Как эти белки выполняют свои уникальные функции in vivo? Поиск ответов на эти вопросы особенно актуален с учетом необходимости точного описания функций многих последовательностей генома, информация о которых теперь доступна. Сложность и актуальность этой проблемы были отмечены в ряде публикаций, в которых используются высокотехнологичные подходы, например, белок-связывающие микрочипы или бактериальная одногибридная система для создания базы данных о последовательностях ДНК, предпочтительных для ДНК-связывающих белков [8-11].
В статье Badis et al. [12] были описаны предпочтительные сайты связывания для 104 факторов транскрипции мыши, включающих несколько членов из одного семейства таких белков. Были сопоставлены наиболее предпочтительные ДНК-связывающие сайты для 21 члена семейства Sox (SRY-связанные группы высокой мобильности) / TCF (Т-клеточного фактора) транскрипционных регуляторов. Примечательно, что, хотя каждый фактор выполняет уникальные функции, 14 из 21 предпочитают связываться с последовательностью ACAAT. Вместе с тем, были выявлены небольшие различия в описании последовательности. Например, фактор Sox1 связывается с последовательностью ATTTAAAT, то гда как его два наиболее близких родственника (Sox14 и Sox21), а также гораздо более отдаленный член семейства SRY предпочли последовательность ACAAT. В этом исследовании также было показано, что многие факторы транскрипции обладают способностью распознавать два разных сайта связывания (так называемые первичные и вторичные сайты связывания) и что существует раннее недооцененная взаимозависимость между соседними парами оснований внутри сайта связывания [12].
Исследования, подобные вышеуказанным, указывают на ряд фундаментальных вопросов, касающихся механизма распознавания белковыми молекулами определенных последовательностей ДНК. Ответы на эти вопросы требуют лучшего понимания правил, определяющих механизм связывания белков, точнее, их пептидных фрагментов с определенными последовательностями нуклеотидов на ДНК.
Известно, что последовательность пар оснований ДНК в месте связывания белка не играет единственной решающей роли, поэтому необходимо учитывать трехмерные структуры обеих макромолекул, чтобы полностью понять распознавание белком ДНК. В частности, локальные вариации структуры ДНК могут быть столь же важны, как и структурные особенности белковой молекулы. В исследовании Parker SC et. al. [13], посвященном изучению эволюционных ограничений на топологию ДНК, решительно поддерживается вышеуказанная точка зрения.
Связывание ДНК с различными аминокислотами
Большинство наблюдаемых взаимодействий аминокислот с основаниями ДНК следуют общим принципам, которые применяются ко всем комплексам белок-ДНК, хотя существуют отдельные исключения. Взаимодействия а.о. с ДНК обеспечивают стабильность связывания и не играют существенной роли в специфичности. Также способы связывания коррелирует с типом а.о. и оснований ДНК. Большинство контактов при прямом считывании последовательностей ДНК белками связано со сложными сетями водородных связей, усиливающими специфичность. Две трети всех ДНК-белковых взаимодействий включают в себя ван-дер-ваальсовые контакты. Это подчеркивает важность этих контактов для комплексообразования, которым ранее отводились второстепенные роли.
Полярные и заряженные аминокислотные остатки играют, как правило, ключевую роль в связывании с ДНК. Чаще всего встречаются следующие контакты: для аргинина и лизина -гуанин, а для лизина - тимин. Природа взаимодействий может быть объяснена простым соображением: наличие частичного заряда у боковых групп аминокислот и у функциональных групп оснований в большой бороздке [155]. Интересно, что электростатические взаимодействия имеют решающее значение, хотя гибкость боковых цепей также может быть дополнительным фактором, способствующим связыванию. Контакты между аминокислотными остатками и основаниями ДНК достигаются с помощью водородных связей (далее Н -связи) или гидрофобных взаимодействий.
Аминокислотные остатки глутаминовой кислоты и аспарагина имеют акцепторы Н -связи, но не являются донорами, поэтому они могут образовывать Н -связи только с основаниями цитозин или аденин. Остатки cерина, цистеина и треонина имеют гидроксильную или сульфгидрильную группу, которую можно использовать одновременно в качестве донора и акцептора, и поэтому они могут связываться с любым основанием. Аминокислотные остатки аргинин и лизин имеют доноров Н-связи, но не имеют акцепторной группы в своих боковых цепях, поэтому они не могут связываться с цитозином в большой бороздке [156].
Основной мишенью для гидрофобного взаимодействия в б ольшой бороздке ДНК является метильная группа тимина. Гидрофобные аминокислотные остатки аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, тирозин, триптофан и треонин могут распознавать метильную группу тимина. Две группы CH основания цитозина также являются возможными мишенями для распознавания гидрофобными остатками. Однако взаимодействие с атомами водорода цитозина не будет таким сильным, как с метильной группой тимина. Аланин, по-видимому, недостаточно неполярен для контакта с цитозином. Последовательность боковых цепей полярных остатков также может связываться с метильной группой тимина [156].
Некоторые аминокислотные остатки могут распознавать две химические группы одного и того же основания ДНК, и такие взаимодействия будут сильнее, чем одиночные контакты. Такое связывание называют бидентантным. Бидентатное взаимодействие обеспечивает экономичный способ увеличения энергии связи аминокислота-основание. Более важным, однако, является повышенная специфичность в распознавании последовательности ДНК. Это демонстрирует взаимодействие аргинина с гуанином в большой бороздке. При взаимодействии аргинин связывается с атомом O6 или N7 гуанина. Поскольку атом N7 также существует у аденина, аминокислотные остатки, взаимодействующие только с этим атомом, не будут различать два пуриновых основания. В бидентатной связи аргинин взаимодействует как с атомами O6, так и с атомами N7, поэтому специфически распознает гуанин.
Также, лизин может связываться двумя Н-связями с гуанином, а аспарагин и глутамин могут связываться с аденином через две Н -связи, среди которых одна от группы донора аденина, а другая - акцептор аденина. Аденин имеет в составе как донор Н -связи, так и акцептор, направленые почти в противоположных направлениях. Таким образом, только одна из двух групп, по-видимому, в любое время доступна для распознавания основания, что затрудняет двусторонний контакт.
Аргинин является наиболее предпочтительной аминокислотой в участках белковых доменов, взаимодействующих с основаниями ДНК. Причина, по которой аргинин используется наиболее часто, объясняется тремя факторами: (1) длиной боковой цепи, (2) способностью взаимодействовать в различных конформациях и (3) способностью создавать выгодную геометрию водородных связей [156]. Лизин и глутамин также обладают длинными боковыми цепями, однако они могут взаимодействовать только в одной конфигурации. Кроме того, лизин может использовать только один атом боковой цепи для связывания, и водородные связи с меньшей вероятностью будут напоминать идеальную геометрию, чем для аргинина.
Теоретически аргинин и лизин могут связываться с любым из оснований, кроме цитозина, посредством H-связи. Однако эти два остатка почти всегда связываются с гуанином даже посредством одного контакта. Вероятно, это связано c частичным зарядом на взаимодействующих группах. Гуанин имеет два акцептора и частичный отрицательный заряд, в то время как тимин менее отрицателен, поскольку имеет только один акцептор. Аденин имеет акцептор и донор и является почти нейтральным, поэтому аргинин и лизин связываются с гуанином гораздо чаще, чем с тимином, и, в тоже время, с тимином чаще, чем с аденином. Заряд тимина меньше, чем у аргинина и лизина, и, следовательно, вероятность взаимодействия будет ниже [156].
Также выделяют сложные взаимодействия, в которых белковый остаток связывает более одного центра одновременно. Как и в случае бидентатных взаимодействий, аминокислоты, которые можно использовать, обычно ограничены аминокислотами с боковыми цепями, способными к множественным водородным связям. Хотя есть примеры совместного использования атомов основной и боковой цепей, но около 75% взаимодействий используют только последние. Комплексные связи могут быть подразделены на два типа в зависимости от взаимного расположения взаимодействующих оснований. В первом нуклеотиды принадлежат одной и той же цепи и укладываются непосредственно друг на друга. Во втором основания находятся в разных нитях и расположены по диагонали друг к другу.
Было проведено сравнение связывания аминокислот с одноцепочечной (оцДНК) и двухцепочечной ДНК (дцДНК) методами молекулярного моделирования. Выявлено два интересных предпочтения заряженных боковых цепей аминокислот при взаимодействии с различными основаниями в дцДНК и оцДНК. Во-первых, относительно дцДНК, положительно заряженные боковые цепи аминокислот лизина и аргинина демонстрируют большую аффинность при взаимодействии с цитозином в оцДНК по сравнению с остальными тремя основаниями. Во -вторых, опять же относительно дцДНК, отрицательно заряженные боковые цепи аспарагиновой и глутаминовой кислот предпочитают взаимодействовать с гуанином в оцДНК. Такие механизмы взаимодействия аминокислот с основания в оцДНК могут быть объяснены доступностью особых функциональных групп оснований в отсутствии межцепоченых водородных связей. Например, неспаренный цитозин обладает доступными для воздействия N3 и O2 атомами, несущими частичные отрицательные заряды. Таким образом, может реализовываться бидентатное взаимодействие положительно заряженных боковых цепей аминокислот с цитозином. Неспаренная пара гуанина, с другой стороны, имеет свободные N1-H и экзоциклические атомы NH2 в положении C2, что, в свою очередь, способствует образованию бидентатых взаимодействий с карбоксильными группами остатка аспарагиновой кислоты и боковых групп глутаминовой кислоты [156].
Исследование взаимодействия пептида AEDL с ДНК
Этот пептид отличается от рассмотренного выше одним а.о. Замена глицина на лейцин приводит к появлению дополнительных гидрофобных групп в С -концевом участке при сохранении зарядовых свойств пептида. Для оценки влияния пептида AEDL на спектральные свойства двойной с пирали ДНК также было проведено спектрофотометрическое титрование. Рисунок 32 демонстрирует спектры поглощения ДНК, пептида AEDL и их комплексов при концентрации NaCl, ра вной 5 мМ. Анализ полученных данных показал, что взаимодействие пептида AEDL и ДНК в 5 мМ NaCl проявлялось сразу после приготовления растворов. Как видно из Рисунок 32 Б, с увеличением концентрации пептида фиксируется гиперхромный эффект (пептид не поглощает при длинах волн более 240 нм, Рисунок 32 А). Связывание пептида с ДНК привело к небольшому гиперхромному эффекту, который проявляется уже при r 1. При этом не происходит сдвига полосы поглощения, как это видно из нормированных на максимум полосы поглощения ДНК спектров, приведенных на Рисунок 32 В. Таким образом, гетероциклы оснований не участвуют в связывании, но стэкинг взаимодействия и, возможно, водородные связи между основаниями в присутствии пептида нарушаются.
Анализ данных показал, что взаимодействие пептида AEDL и ДНК в 5мМ NaCl проявлялось сразу после приготовления растворов. Связывание пептида с ДНК привело к небольшому гиперхромному эффекту, который проявляется уже при r 1.
Как и для пептида AEDG, был проведен анализ спектров в растворе с большей ионной силой 0.15M NaCl. Он также показал отсутствие изменения поглощения ДНК в этих условиях (Рисунок 34).
Спектральные свойства ДНК исследовали также с помощью метода кругового дихроизма (Рисунок 35). Небольшое изменение спектра указывает на взаимодействие компонентов. Изменения сходны с наблюдаемыми для пептида AEDG, описанными выше. Таким образом, и в этом случае основания ДНК вступают в контакт с группами пептида AEDL.
Наличие гиперхромного эффекта на полосе поглощения ДНК свидетельствовало об изменении спектральных свойств макромолекулы п ри взаимодействии с пептидом. В этом случае можно говорить об изменении стэкинг взаимодействий, так как полоса поглощения ДНК не смещается.
О месте связывания пептида с ДНК можно судить по результатам конкурентного связывания пептида и другого соединения с ДНК. При этом необходимо выбрать связывание, обеспечивающее надежно фиксируемые в эксперименте изменения определяемого параметра.
Известно, что катионы переходных двухвалентных металлов, в частности Cu2+, взаимодействуют с группой N7 гуанина в большой бороздке ДНК. Связывание спектрально проявляется в небольшом батохромном сдвиге максимума полосы поглощения ДНК. Для того, чтобы понять, может ли пептид AEDL выступать в качестве конкурента за связывание в большой бороздке ДНК, нами был выполнен следующий эксперимент. В раствор ДНК добавляли в разной последовательности ионы меди и пептид (Рисунок 37).
Рисунок 37 показывает, что присутствие пептида в растворе ДНК мешает связываться ионам меди с азотистыми основаниями макромолекулы. Правда, это может быть следствием связывания ионов меди со свободными пептидами в растворе, хотя присутствие ионов меди не отражается на спектре поглощения пептида. Последовательность добавления ионов меди и пептида в раствор ДНК не влияет на результат эксперимента. Во всех случаях присутствие пептида препятствует локализации ионов меди в большой бороздке ДНК.
Методом УФ -спектрофотомерии было исследовано влияние катионов Mg2+ на связывание пептида AEDL с ДНК. Как известно, ионы щелочноземельных металлов (в том числе и Mg2+) взаимодействует преимущественно с фосфатными группами ДНК. Они не локализуются в большой бороздке макромолекулы [189]. Результаты эксперимента по связыванию пептида AEDL c ДНК в присутствии катионов Mg2+ представлены на рисунке Рисунок 38.
Как следует из полученных данных, в присутствии ионов Mg2+ также реализуется взаимодействие пептида AEDL с ДНК, которое проявляется в гиперхромном эффект на полосе поглощения ДНК. Введение в раствор, содержащий и пептид, и ДНК, ионов Mg2+не отражается на характере спектральных изменений ДНК, обусловленных присутствием пептида. Отсюда следует, что связывание магния по фосфатным группам не мешает взаимодействию пептида с ДНК. Кроме того, ионы магния не связывают пептид и позволяют ему взаимодействовать с макромолекулой.
Несмотря на небольшой гиперхромизм в спектре поглощения ДНК при связывании с пептидом, анализ кривых плавления ДНК в комплексе (Рисунок 39) показал отсутствие значимых влияний связывания пептида на стабильность двойной спирали ДНК. Заметим, однако, что при этом использовали существенно меньшую концентрацию пептида при (r = 3), чем при использования в аналогичном эксперименте AEDG (r = 10).
Для изучения возможности связывания пептида AEDL с ДНК по малой бороздке и по фосфатным группам в качестве конкурента был выбран краситель DAPI. Как известно, DAPI связывается с ДНК, и его люминесценция позволяет разделить два типа связывания красителя с макромолекулой. При м алом содержании DAPI в условиях избытка ДНК в растворе реализуется связывание DAPI с ДНК по малой бороздке, а затем после заполнения таких мест связывания происходит электростатическое внешнее взаимодействие с фосфатными группами [181]. Известно, что квантовый выход люминесценции DAPI значительно увеличивается при связывании с ДНК.
При рассмотрении возможной конкуренции пептида с красителем DAPI за места связывания на ДНК методом флуоресценции было выбрано одинаковое для всех растворов отношение концентраций красителя к ДНК Z=[DAPI]/[ДНК(ф.г.)]=0.3. При таком значении r в растворе присутствуют два типа связанных с ДНК молекул DAPI с разными спектральными характеристиками. Первый тип – это сильное связывание красителя в малой бороздке ДНК с высоким квантовым выходом люминесценции с максимумом при flmax = 455 нм и длине волны возбуждения 340 нм, второй – существенно более слабое внешнее электростатическое связывание с фосфатными группами ДНК, которое сопровождается лю минесценцией с максимумом при flmax = 540 нм с длиной волны возбуждения 420 нм [181].
Рисунок 40 показывает зависимости интенсивности люминесценции для двух типов связанных с ДНК молекул DAPI от соотношения пептид/ДНК (r=AEDL/DNA).
Ядерный магнитный резонанс систем ДНК-пептиды. Метод WaterLOGSY
В эксперименте использовали короткие синтетические пептиды AEDG, AEDL, КEDW и EDR и синтетические короткие олигонуклеотиды (18 п.о.). Исследовалась возможность связывания исследуемых пептидов с олигонуклеотидами. Олигонуклеотиды были выбраны исходя из данных молекулярного докинга [179]. Ниже приведены структуры синтетических олигонуклеотидов:
ДНК1: GCCCAGCATTTCACCCAG
ДНК2: CCGGATCCTGCCCACTGG
ДНК3: GCAGCCGGGCAGGCACG
Были получены H-спектры пептидов и олигонуклеотидов, спектры WaterLOGSY. Спектры чистых пептидов были сняты при концентрации C=10-2 M. Спектры олигонуклеотидов при концентрации C=0.8 M. Комплексы были приготовлены в соотношении r= 50, где r=C(P)/C(ДНК). В качестве растворителя использовали 50 мМ натрий-фосфатный буфер.
На спектрах ЯМР видно отсутствие значимых положительных сигналов NOE пептида при связывании с олигонуклеотидом ДНК1. Аналогичные результаты были получены и с другими последовательностями олигонуклеотидов (данные не приведены).
Были получены Н -спектры комплексов пептида AEDL с тремя различными олигонуклеотидами, также WaterLOGSY спектры.
Для всех изученных пептидов AEDG, AEDL, EDR и KEDW не было получено положительного NOE сигнала при взаимодействии с олигонуклеотидами, что согласуется с данными изотермического калориметрического титрования, согласно которому значения констант связывания для пептидов лежат в интервале от 102 до 103 М-1. Взаимодействие пептидов с ДНК относится к слабому связыванию. Значения констант связывания находятся за пределами чувствительности метода ЯМР, которым возможно зарегистрировать взаимодействие со значениями констант связывания, лежащими в интервале от 104 до 109 М-1.