Са2+-зависимая пермеабилизация фосфолипидных мембран, индуцируемая жирными кислотами: механизм, регуляция и физиологическая значимость Белослудцев Константин Николаевич

Содержание к диссертации

Введение

1. Обзор литературы 13

1.1. Влияние жирных кислот и Са на состояние и свойства фосфолипидных мембран 14

1.1.1. Фазовые переходы липидных мембран 14

1.1.1.1. Фазовые переходы бислойных структур 15

1.1.1.2. Полиморфные фазовые переходы

1.1.2. Влияние жирных кислот на фазовое состояние фосфолипидных мембран 20

1.1.3. Влияние свободных жирных кислот на проницаемость липидных мембран ..

1.1.3.1. Детергеноподобное действие жирных кислот 21

1.1.3.2. Жирные кислоты как агенты, влияющие на упаковку мембран 22

1.1.3.3. Протонофорное действие жирных кислот 9+

1.1.4. Взаимодействие Са с фосфолипидными мембранами, содержащими отрицательно-заряженные липиды 24

1.2. Взаимодействие жирных кислот с биологическими мембранами 27

1.3. Взаимодействие жирных кислот с митохондриями 30

1.3.1. Жирные кислоты как разобщители окислительного фосфорилирования 9+

1.3.2. Митохондриальная Са -зависимая пора. Роль жирных кислот в индукции 9+ неспецифической Са -зависимой проницаемости митохондрий 35

1.3.2.1. Возникновение и развитие представлений о неспецифической проницаемости внутренней митохондриальной мембраны 35

1.3.2.2. Общая характеристика МРТ поры 37

1.3.2.3. Молекулярная структура МРТ поры

1.3.2.3.1. Роль циклофилина Д в формировании МРТ поры 40

1.3.2.3.2. Роль аденилаттранслокатора в формировании МРТ поры 41

1.3.2.3.3. Роль фосфатного переносчика в формировании МРТ поры 42

1.3.2.3.4. Роль F0F1 АТФ синтазы в формировании МРТ поры 43

1.3.2.3.5. Роль белков внешней мембраны митохондрий в формировании МРТ поры

1.3.2.4. Физиологическая и патофизиологическая роль МРТ поры 46

1.3.2.5. Митохондриальная циклоспорин А-нечувствительная пора. Участие жирных кислот в индукции Са -зависимой пермеабилизации митохондрий 49

1.4. Программируемая клеточная гибель. Пальмитиновая кислота как природный индуктор апоптоза 51

1.4.1. Общая характеристика апоптоза 51

1.4.2. Роль митохондрий в апоптозе 54

1.4.3. Пальмитиновая кислота как природный индуктор апоптоза 57

1.5. Фосфолипаза Ai как регулятор процессов, индуцируемых жирными кислотами 59

1.5.1. Секреторные фосфолипазы Аг 60

1.5.2. Цитозольные Са -зависимые фосфолипазы Аг 61

1.5.3. Цитозольные Са -независимые фосфолипазы Аг 64

2. Материалы и методы исследования 67

2.1. Эксперименты с липосомами 67

2.1.1. Приготовление однослойных липосом 67

2.1.2. Приготовление липосом, загруженных сульфородамином Б 67

2.1.3. Измерение выхода сульфородамина Б из однослойных липосом 67

2.1.4. Определение фазовой сеперации в мембранах липосом с помощью нонил-акридинового оранжевого 68

2.1.5. Измерение параметра GP (генерализованная поляризация) лаурдана 69

2.1.6. Определение слияния липосом 70

2.1.7. Определение размера липосом 70

2.1.8. Определение С, потенциала липосом 70

2.1.9. Акустические исследования 71

2.2. Эксперименты с митохондриями 71

2.2.1. Выделение митохондрий из печени крыс 71

2.2.2. Выделение митохондрий из сердца крыс 72

2.2.3. Выделение митохондрий из мозга крыс 72

2.2.4. Получение митопластов из митохондрий печени крыс 73

2.2.5. Оценка функциональных параметров митохондрий 73

2.2.6. Электронная микроскопия митохондрий 75

2.2.7. Электрофорез и иммуноблоттинг 75

2.3. Экстракция, разделение и количественный анализ липидов из биологических

объектов 76

2.3.1. Экстракция и определение фосфолипидов 76

2.3.2. Выделение фракции жирных кислот и ее количественный анализ 76

2.4. Эксперименты с эритроцитами крыс 76 2.4.1. Выделение эритроцитов крыс 76

2.4.2. Загрузка эритроцитов сульфородамином Б 77

2.4.3. Измерение неспецифической проницаемости эритроцитарной мембраны 77

2.5. Эксперименты с первичной культурой нейронов мозжечка крысы 78

2.5.1. Культивирование первичной культуры гранулярных нейронов мозжечка крысы 78

2.5.2. Флуоресцентно-микроскопические измерения 78

2.6. Эксперименты с клетками Escherichia coli 79

2.6.1. Культивирование клеток Е.coli 79

2.6.2. Трансформация клеток Е.coli 79

2.6.3. Молекулярный докинг взаимодействия ингибиторов фосфолипаз Аг с димером фосфолипазы А внешней мембраны Е.coli 80

2.7. Статистическая обработка результатов 80

3. Результаты исследования и их обсуждение 81

3.1. Са -зависимая пермеабилизация биологических и искусственных мембран, индуцируемая жирными кислотами 81

9+

3.1.1. Са -зависимая пермеабилизация однослойных липосом, индуцируемая жирными кислотами 81

3.1.2. Са -зависимая циклоспорин А-нечувствительная пермеабилизация внутренней митохондриальной мембраны, индуцируемая жирными кислотами

3.1.3. Са -зависимая пермеабилизация плазматической мембраны эритроцитов, индуцируемая жирными кислотами

3.2. Механизм Са -зависимой пермеабилизации мембран, индуцируемой жирными кислотами

3.2.1. Механизм Са -зависимой пермеабилизации мембран, индуцируемой насыщенными жирными кислотами 96

3.2.1.1. Пальмитат/Са -зависимая пермеабилизация липосом происходит вследствие образования липидных пор 96

3.2.1.2. Пальмитат/Са -индуцируемая пермеабилизация мембраны сопряжена с фазовой сегрегацией комплексов Са с жирной кислотой 97

3.2.1.3. Пальмитат/Са -индуцируемое образование липидных пор происходит по механизму хемотропного ламеллярного фазового перехода

3.2.1.4. Образование липидных пальмитат/Са -индуцируемых пор во внутренней мембране митохондрий печени и плазматической мембране эритроцитов крыс

3.2.2. Механизм Са -зависимой пермеабилизации мембран, индуцируемой ненасыщенными и дикарбоновыми жирными кислотами 109

3.2.2.1. Са не вызывает изменение температуры главного фазового перехода мембраны липосом, содержащих ненасыщенные и дикарбоновые жирные кислоты 109

3.2.2.2. Ненасыщенные и дикарбоновые жирные кислоты индуцируют Са зависимое слияние липосом 111

3.2.2.3. Пальмитиновая кислота индуцирует Са -зависимое набухание митопластов, а олеиновая кислота - нет 114

3.2.3. Заключение 115

3.3. Регуляция липидной пальмитат/Са -индуцируемой поры в митохондриях и липосомах 116

3.3.1. Влияние агентов, связывающих Са и жирную кислоту, на открытие

пальмитат/Са -индуцируемой поры в митохондриях и липосомах 117

3.3.2. Влияние модуляторов поверхностного потенциала на открытие

пальмитат/Са -индуцируемой поры в митохондриях и липосомах 119

3.3.2.1. Влияние ионного состава среды инкубации на открытие

пальмитат/Са -индуцируемой поры в липосомах и митохондриях 120

3.3.2.2. Влияние спермина и ионов Mg на открытие пальмитат/Са индуцированной поры в митохондриях и липосомах 122

3.3.2.3. Влияние рН среды инкубации на открытие пальмитат/Са -индуцируемой поры в митохондриях и липосомах 124

3.3.2.4. Влияние амфифильных заряженных соединений на открытие пальмитат/Са -индуцируемой липидной поры в митохондрях и липосомах 125

3.3.3. Влияние липидного окружения на открытие пальмитат/Са -индуцированной

поры в митохондриях и липосомах 126

3.3.3.1. Влияние холестерина на пальмитат/Са -индуцируемую пермеабилизацию липосом и митохондрий 128

3.3.3.2. Влияние кардиолипина на формирование пальмитат/Са -активируемой поры в мембране 130

3.3.3.3. Влияние ненасыщенных жирных кислот на образование

пальмитат/Са -индуцируемой поры в митохондриях и липосомах

3.3.4. Влияние модуляторов МРТ-поры на открытие пальмитат/Са -индуцируемой поры в митохондриях печени крыс 135

3.3.5. Заключение 137

3.4. Физиологическая значимость митохондриальной поры, индуцируемой жирными кислотами и Са 138

3.4.1. Участие пальмитат/Са -индуцируемой поры в апоптотической клеточной гибели 139

9+

3.4.1.1. Открытие пальмитат/Са -индуцируемой поры приводит к выбросу из митохондрий проапоптотических белков 139

3.4.1.2. Содержание насыщенных жирных кислот в клеточных мембранах выше в клетках, чувствительных к фактору некроза опухолей 141

3.4.1.3. Открытие пальмитат/Са -индуцируемой поры в митохондриях печени зависит от возраста животного 142

3.4.2. Пальмитат/Са -индуцируемая пора как неспецифическая система выброса ионов Са из митохондрий 143

3.4.2.1. Липидная пора как система выброса Са в условиях добавленной пальмитиновой кислоты 144

3.4.2.2. Липидная пора как система выброса Са (Sr ) при активации фосфолипазы Аг 148

3.4.2.3. Участие поры, индуцируемой жирными кислотами и Sr , в механизме обратимого Sr -индуцированного выброса ионов из митохондрий в условиях гипотонии...

3.4.2.4. Механизм рециклизации ионов Са (Sr ) через митохондриальную

мембрану при открытии липидной поры, индуцируемой жирными кислотами 156

3.4.3. Возможная роль липидной поры в деградации нервных клеток 160

3.4.4. Заключение 167

3.5. Участие фосфолипазы А внешней мембраны Escherichia coli в процессе трансформации бактериальных клеток 168

3.5.1. Взаимодействие фосфолипазы А внешней мембраныЕ.coli с ингибиторами эукариотических фосфолипаз Аг 170

3.5.2. Влияние ингибиторов фосфолипаз Аг на рост клеточной биомассы E.coli...\12

3.5.3. Ингибиторы фосфолипаз Аг подавляют трансформацию Е. coli 172

3.5.4. Заключение 175

Заключение 176

Выводы 182

Список литературы

• Влияние свободных жирных кислот на проницаемость липидных мембран
• Физиологическая и патофизиологическая роль МРТ поры
• Определение фазовой сеперации в мембранах липосом с помощью нонил-акридинового оранжевого
• Механизм Са -зависимой пермеабилизации мембран, индуцируемой жирными кислотами

Введение к работе

Актуальность проблемы. Одним из основных свойств биологических мембран является избирательная проницаемость. Благодаря этому ионы и соединения, которые не переносятся специальными транспортными системами, не могут попасть внутрь клетки или внутриклеточные органеллы (Nicholls and Ferguson, 2002). Нарушение проницаемости мембран может привести к ряду последствий. С одной стороны, увеличение неспецифической проницаемости мембран может являться причиной развития тяжелых патологических процессов, приводящих к клеточной гибели (Halestrap and Richardson, 2015). С другой стороны, пермеабилизация мембран способствует проникновению в клетку различных соединений, включая макромолекулы и лекарственные вещества (Чизмаджев и др., 1981; Манниатис, 1984; Nakamura and Funakashi, 2013; Kalli et al., 2014). В настоящей работе изучен механизм индукции пермеабилизации мембран длинноцепочечными жирными кислотами.

Свободные жирные кислоты (СЖК) присутствуют во всех биологических мембранах. Они выполняют множество функций в клетке (Дятловицкая, 1998; Rustan and Drevon, 2005). Кроме участия в энергетическом метаболизме (Ленинджер, 1966; Rustan and Drevon, 2005), метаболизме липидов (Rustan and Drevon, 2005; Huang and Freter, 2015) и регуляции ряда ферментных систем (Ibarguren et al., 2014), свободные жирные кислоты, как обсуждается в данной работе, влияют на проницаемость мембран.

Изучение взаимодействия свободных жирных кислот с бислойными липидными мембранами ведётся довольно давно (Pressman and Lardy, 1956). Показано, что свободные жирные кислоты в зависимости от концентрации и структуры молекулы могут проявлять детергеноподобное (Mukerjee and Musels, 1971), пертурбирующее (Arouri and Mouritsen, 2013) и протонофорное действие (Kamp and Hamilton, 1992). Специфическое протонофорное действие жирных кислот долгое время привлекало основное внимание исследователей в области биоэнергетики (Pressman and Lardy, 1956; Skulachev, 1998; Самарцев, 2000; Мохова и Хайлова, 2005).

В последние годы все больше внимания стало уделяться проблеме
неспецифического изменения проницаемости мембран, которое происходит в
результате взаимодействии анионов свободных жирных кислот с Са²⁺ в
липидном бислое мембраны. В этой связи важно отметить, что многие
внутриклеточные кальциевые процессы, в том числе связанные с
проницаемостью мембран, могут регулироваться жирными кислотами. Еще в
конце 70-х годов прошлого века было показано, что жирные кислоты способны
стимулировать образование Са -зависимой поры, известной как МРТ
(mitochondrial permeability transition - циклоспорин А-чувствительная пора)
(Hunter and Haworts, 1979). В середине 80-х годов было показано, что жирные
кислоты влияют на поглощение ионов Са²⁺ саркоплазматическим ретикулумом
и на выброс ионов Са²⁺ из митохондрий (Messineo et al., 1984; De Villiers and
Lochner, 1986). Причем эффекты насыщенных и ненасыщенных жирных кислот
были разнонаправленными (Messineo et al, 1984; Hardy et al, 2003). Стоит
обратить внимание также, что современные представления о
функционировании биологических мембран являются

«протеиноцентрическими». Поэтому жирные кислоты в основном рассматриваются в качестве агентов, влияющих на функционирование

9+

мембранных белков, которые и вызывают Са -зависимое изменение проницаемости мембран.

9+

Прогресс в понимании роли свободных жирных кислот в Са -зависимой пермеабилизации мембран связан с исследованиями, проводимыми в нашей лаборатории с середины 90-х годов прошлого века. Тогда было показано, что насыщенные длинноцепочечные жирные кислоты (в основном, пальмитиновая

9+

и стеариновая кислоты) связывают ионы Са со сродством, которое, на 1-2 порядка выше, чем сродство к этому иону ненасыщенных жирных кислот и других липидов. Важно отметить, что в присутствие ионов Са²⁺ эти кислоты индуцировали ионную проводимость бислойных липидных мембран (Mironova etal.,2001).

Параллельно с этими исследованиями появились данные, что именно пальмитиновая кислота в присутствие ионов Са²⁺ и в отсутствие других

9+

индукторов МРТ поры способна индуцировать Ca^ZT -зависимую пермеабилизацию митохондрий, нечувствительную к циклоспорину A (Sultan and Sokolove, 2001). Мы предположили, что явления, наблюдаемые на БЛМ и митохондриях, одного порядка, и это позволило нам начать исследования,

9+

посвященные изучению пальмитат/Са -зависимой пермеабилизации фосфолипидных мембран. Актуальность данных исследований связана с тем, что пальмитиновая кислота является природным индуктором апоптоза (Sparagna et al, 2000). Поэтому есть основания полагать, что пермеабилизация митохондрий пальмитиновой кислотой и Са²⁺ является одним из первых этапов в реализации программы клеточной гибели.

В клетке и митохондриях содержание пальмитиновой кислоты и других свободных жирных кислот повышается вследствие активации фосфолипазы А₂ при ряде заболеваний, таких как ишемия и реперфузия, диабет, нейродегенеративные заболевания и другие (Pilitsis et al, 2003; Mironova et al, 2004; Murakami et al, 2011; Dennis et al, 2011). Несмотря на интенсивные исследования этих патологических процессов в последние годы, вопросы о роли фосфолипазы А₂ в клеточной патофизиологии остаются далекими от разрешения. Поскольку при активации фосфолипазы А₂ происходит высвобождение свободных жирных кислот из фосфолипидов, то их последующее взаимодействие с ионами Са²⁺ должно индуцировать изменение проницаемости мембран. В зависимости от различных условий, эта пермеабилизация может привести как к процессам, имеющим физиологическое значение (осцилляции ионных потоков через мембрану), так и к патологическим последствиям (гибель клеток). Все это вызывает необходимость более глубокого исследования механизмов таких процессов.

Цель исследования. Целью работы являлось выяснение механизмов пермеабилизации искусственных и природных мембран, индуцированной различными жирными кислотами и ионами Са²⁺, изучение регуляции этой неспецифической проницаемости, а также ее роли в физиологических и патологических внутриклеточных процессах.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Определить возможность индукции жирными кислотами различных

9+

классов (насыщенные, ненасыщенные и дикарбоновые) и ионами Са неспецифической проницаемости искусственных (липосомы) и природных фосфолипидных мембран (внутренняя мембрана митохондрий и плазматическая мембрана эритроцитов).

1. Изучить механизмы формирования неспецифической проницаемости липосомальной и митохондриальной мембран, индуцированной ионами Са²⁺ и жирными кислотами различных классов (насыщенные, ненасыщенные и дикарбоновые).

2. Выявить факторы регуляции пермеабилизации митохондриальной и липосомальной мембран, индуцированной пальмитиновой кислотой и Са²⁺:

9+

определить влияние на пальмитат/Са -индуцированную пермеабилизацию мембран липидного окружения, модуляторов поверхностного потенциала,

9+

агентов, связывающих Са и жирную кислоту, и индукторов МРТ поры.

4. Оценить возможность выхода из митохондрий проапоптотических белков
при циклоспорин А-нечувствительной пермеабилизации внутренней
митохондриальной мембраны ионами Са²⁺и пальмитиновой кислотой.

9+

5. Определить возможную роль пальмитат/Са -индуцированной митохндриальной поры в качестве неспецифической системы выброса ионов Ca²⁺(Sr²⁺) из митохондрии.

6. Исследовать возможную роль пермеабилизации митохондриальной

9+

мембраны жирными кислотами и Са при активации фосфолипазы А₂ в развитии глутамат-индуцированной деградации нейронов мозга.

7. Оценить вклад фосфолипазы А внешней мембраны Escherichia coli в
трансформацию бактериальных клеток E.coli плазмидной ДНК; определить
влияние ингибиторов фосфолипаз А₂ на этот процесс.

Научная новизна. Впервые показано, что жирные кислоты различных классов (насыщенные, ненасыщенные и дикарбоновые) в присутствие ионов

9+

Са способны пермеабилизовать как искусственные, так и природные мембраны. Определен механизм этой пермеабилизации: насыщенные длинноцепочечные жирные кислоты в присутствие Са²⁺ индуцируют во внутренней митохондриальной мембране, эритроцитарной и липосомальной мембранах образование липидных пор по механизму ламеллярного фазового перехода; ненасыщенные и дикарбоновые жирные кислоты индуцируют пермеабилизацию и слияние мембран по механизмам, связанным с полиморфными фазовыми переходами и нарушением мембранной упаковки. Впервые изучены и объяснены механизмы регуляции липидной пальмитат/Са²⁺-индуцированной поры в митохондриях и липосомах. Предположена физиологическая роль липидной поры, индуцированной жирными кислотами и Са²⁺: показано функционирование поры в качестве

9+

системы неспецифического выброса ионов Са из митохондрий. Показано, что

9+

ингибиторы Са -зависимой фосфолипазы А₂ подавляют осцилляции ионных потоков через митохондриальную мембрану. Предложен механизм участия фосфолипазы А₂ и липидной поры, индуцированной жирными кислотами, в глутамат-индуцированной деградации нервных клеток. Показано, что ингибиторы фосфолипаз А₂ снижают эффективность трансформации

бактериальных клеток Escherichia coli, что может являться индикатором участия фосфолипазы А внешней мембраны Е.соїі в механизме проникновения плазмидной ДНК в бактериальную клетку.

Научно-практическое значение работы. Полученные данные
расширяют и углубляют представления о механизмах пермеабилизации
липидных мембран при изменении их фазового состояния, а также
возможности реализации подобного процесса в клеточных мембранах в норме и
патологии. Результаты работы могут быть использованы в лекционных курсах в
области биофизики, биоэнергетики, микробиологии, клеточной
патофизиологии и медицины, поскольку в настоящее время показано, что
жирные кислоты и митохондриальная пора вовлечены в индукцию ряда
патофизиологических явлений: апоптоза, ишемии/реперфузии,

нейродегенеративных заболеваний, диабета и др. Результаты настоящего исследования могут способствовать разработке новой тактики лечения таких патологий и созданию лекарственных препаратов на основе ингибиторов фосфолипаз А₂ для их коррекции.

Положения, выносимые на защиту. Свободные жирные кислоты при

9+

связывании ионов Са в мембране индуцируют пермеабилизацию (образование липидных пор) искусственных и природных мембран по механизмам, связанным с фазовыми переходами фосфолипидов. Образование таких пор

9+

происходит при активации Са -зависимой фосфолипазы А₂ и может иметь важное физиологическое значение для жизнедеятельности клетки.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на FEBS Congress (Польша, 2004; Австрия, 2007), на III и IV съездах биофизиков России (Воронеж, 2004; Нижний Новгород, 2012; Ростов, 2015), на международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003, 2005; 2007; 2009; 2011; 2013; 2015), на международных конференциях «Biological Motility» (2008, 2010, 2012, 2014) на конференции «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2009-2014), на международных симпозиумах «Биологические механизмы старения» (Харьков, Украина, 2010, 2012), на международных конференциях «Окислительный стресс и свободно-радикальные патологии» (Судак, 2012, 2013), «Mitochondrial Physiology» (Австрия, 2005; Франция, 2011). Материалы конференций опубликованы в виде тезисов и сборников статей.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 57 печатных работ, из них 17 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 1 монография, 8 статей в сборниках и 31 тезис докладов.

Финансовая поддержка. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (01-04-48551-а, 04-04-97281-наукоград_а, 09-04-01024-а, 12-04-00430-а, 15-04-03081-а, 14-34-50380-мол_нр), грантов Минобразования России (АОЗ-2.12-727 и А04-2.12-1116), Президента РФ для молодых кандидатов наук (МК-145.2012.4), Международного научно-технического центра (№ 3301), аналитической ведомственной целевой программы "Развитие научного

потенциала высшей школы" (2009-2011 годы) (2.1.1/3840 и 2.1.1/11950), и гранта Правительства РФ (мегагрант) (договор № 14.Z50.31.0028).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 222 страницах, иллюстрирована 13 таблицами и 71 рисунками.

Влияние свободных жирных кислот на проницаемость липидных мембран

Как видно из рис. 1, бислой фосфолипидов может образовывать несколько ламеллярных фаз (Антонов и др., 1992; Геннис, 1997). При этом меняется жидкостность мембраны, но сохраняется ее бислойная структура. Характерным примером этого служат мембраны, образованные насыщенными фосфолипидами. При изменении температуры липиды в мембране могут находиться в твердом (гель) состоянии (LB) или жидком (жидкокристаллическое) состоянии (La), претерпевая при этом несколько термотропных фазовых переходов (Cevc, 1991). Например, дипальмитоил фосфатидилхолин существует в LP фазе при температуре ниже 35С и La фазе при температуре выше 41 С. В гель состоянии (LP) молекулы фосфолипидов упакованы максимально плотно. При этом возможны две модификации LP ламеллярной фазы - собственно LP фаза с жирнокислотными остатками перпендикулярными поверхности бислоя, и LP фаза, в которой хвосты молекул располагаются под углом 30 к поверхности бислоя. Следует отметить, что некоторые мембранные фосфолипиды, например фосфатидилэтаноламин, не образуют последней фазы. Между температурами 35С и 41 С дипальмитоил фосфатидилхолин находится в промежуточной риппл-фазе (РР ), которая имеет вид волнообразной гофрированной поверхности. Фазовый переход LP -PP называется предпереходом (Lee, 1977). Фазовый переход PP -La, наблюдаемый при более высокой температуре называется главным переходом. При температурах выше температуры главного фазового перехода хвосты фосфолипидов разупорядочиваются и становятся гибкими (Геннис, 1997; Антонов, 2006; Mouritsen, 2011; Coni, 2014). Стоит отметить, что при переходе La— ЬР площадь мембраны сокращается на 20—25%. Однако, толщина бислоя возрастает почти настолько же, в результате чего объем мембраны уменьшается только на 3-5%) (Heimburg, 1998; Харакоз, 2001).

Плавление липидов, происходящее при главном фазовом переходе, имеет большое биологическое значение. При температуре ниже точки фазового перехода функционирование многих белков затруднено, процессы жизнедеятельности затормаживаются, а мембраны могут повреждаться (Антонов и др., 1992; Харакоз, 2001).

В конце 80-х годов прошлого века была описана жидко-упорядоченная ламеллярная фаза, которую формируют некоторые фосфолипиды и холестерин (Ipsen et аі., 1987). В этой фазе липидные молекулы способны к латеральной диффузии, то есть мембрана жидкая, но при этом ограничена свобода вращения жирнокислотных хвостов фосфолипидов (можно сказать, что жирнокислотные хвосты плотно упакованы) (Busto et аі., 2014). Для жидкоупорядоченной фазы используется обозначение «Lo». Существование жидкоупорядоченной фазы привело к тому, что фазу La стали называть «жидко разупорядоченной» фазой (Ld), что вызвало некоторую путаницу в номенклатуре. Тем не менее, жидкоупорядоченная фаза, очень важна для функционирования мембранных систем, поскольку она является основой мембранных микродоменов - рафтов (Harder et al., 1998; Dietrich et al., 2001). Рафты состоят из холестерина, насыщенных липидов и различных транспортных белков. В связи с этим они имеют повышенную температуру плавления, и, как следствие, их фазовое состояние отличается от такового всей остальной мембраны. Предполагается, что такие микродомены формируются в результате способности определенных белков создавать вокруг себя оболочку из специфических липидов (Anderson and Jacob son, 2002). Установлено, что рафты участвуют в ряде клеточных процессов, включая передачу сигналов, сортировку и транспорт белков, иммунный ответ и др. (Brown and London, 1998; Simons and Ikonen, 1997; Silvius, 2003; Lafont and Van der Goot, 2005). Другим важным последствием фазовых переходов La— ЬР является изменение проницаемости мембран. Одним из первых, кто наблюдал изменения проницаемости липидных мембран при фазовых переходах, был В.Ф. Антонов. В 80-х годах в его лаборатории были обнаружены одиночные каналы, возникающие в БЛМ при фазовом переходе гель/жидкий кристалл (Антонов, 1982).

Появление каналов, по-видимому, связано с возникновением доменных структур в липидном бислое в момент фазового перехода. При образовании зародышей гель-фазы в жидкокристаллической фазе в бислое будут возникать упругие напряжения - из-за различия в плотности этих фаз. В результате в мембране могут появиться липидные поры.

Модель формирования пор при фазовом переходе рассматривается в работах В.Ф. Антонова (Антонов и др., 1992; Антонов и Шевченко, 1995; Antonov et аі., 2005). Согласно экспериментальным данным и теоретическим оценкам, наиболее вероятным оказывается образование гидрофильных пор (Чизмаджев и др., 1982). При этом эволюция гидрофильных липидных пор в бислойных липидных мембранах начинается с появления гидрофобных пор в результате развития дефектов в упаковке жидкокристаллического бислоя (Антонов 2006; Marrink et al., 2009). Расчеты показывают, что в условиях фазовых переходов возможно существование устойчивой, с энергетической точки зрения, структуры липидного бислоя, содержащего пору. Так минимальный радиус, при котором пора может стабилизироваться составляет 0.7 нм (Leontiadou et al., 2004). Критический радиус поры для жидкокристаллического бислоя, после которого происходит разрушение мембраны, согласно расчетам, составляет 9 нм (Антонов, 1998). Все это находится в хорошем согласии с экспериментальными данными, полученными при изучении проницаемости липидных бислоев из дипальмитоилфосфатидной кислоты и дипальмитоилфосфатидилхолина (Braganza et al., 1984).

Образование липидных пор в мембране может происходить не только в условиях температурного фазового перехода, но и под влиянием ряда агентов или условий. Так электропорация - известный метод введения чужеродных молекул, в том числе и генов, в клетку. В результате электропорации можно пермеабилизовать внутренние мембраны, тем самым вызвать апоптоз. Антимикробные пептиды во многих случаях вызывают образование пор в мембране, что приведет к исчезновению ионных градиентов в пермеабилизованной клетке. Образование пор можно индуцировать механическим стрессом, например осмотический гемолиз эритроцитов. Большинство случаев образования липидных пор было смоделировано методами молекулярной динамики (липидные поры при воздействии детергентов, белков, осмотического шока, электрического пробоя, изменения поверхностного натяжения мембраны и др.) (Vernier et al., 2006; Gurtovenko and Vattulainen, 2007; Gurtovenko and Anwar, 2007; Sengupta et al, 2008; Marrink et al., 2009).

Сегодня общепризнано, что в устойчивом состоянии (если этот термин можно использовать по отношению к живому организму) клеточные мембраны существуют в ламелярной бислойной форме. Однако теоретические и экспериментальные данные говорят о том, что, по крайней мере, кратковременно небислойные структуры должны существовать в мембранах (Антонов, 2006; Caffrey, 1987; Luzzatti et al., 1993; Mouritsen, 2011; Coni, 2014). Следовательно, можно предположить, что будут происходить фазовые переходы из жидкокристаллического состояния в гексагональную (La— -Hii) или кубическую (La— -QII) фазу. В отличие от фазового перехода La— LP, фазовые переходы в этих случаях сопровождаются утерей бислойности, но при этом, вероятно, сохраняется жидкостность мембраны (Cullis et al. 1980).

Полиморфные фазовые переходы характеризуются разнообразием структурных форм. В зависимости от этого, механизмы переходов от бислойной мембраны к полиморфным структурам будут сильно различаться. Так, переходу от бислойной мембраны к гексагональной инвертированной фазе может предшествовать формирование специфических мицеллярных интермедиатов (Verkleij et al., 1979; 1980; Ellens et al., 1990).

Важность полиморфных фазовых переходов нельзя недооценивать. Полиморфные фазовые переходы лежат в основе процесса слияния фосфолипидных мембран. Слияние мембран является необходимой составляющей процессов эндо- и экзоцитоза, внутриклеточных транспортных процессов с участием мембран (Chemomordik and Kozlov, 2008; Roy and Sarkar, 2011). На сегодняшний день процесс слияния достаточно хорошо изучен. Для инициации процессов слияния необходимо создание условий, при которых происходит кратковременное разрушение стабильной бислойной структуры (Helm et al. 1992). При этом наблюдается образование гексагональной Нц фазы. Считается, что это происходит при образовании межмембранного анастамоза - сталка, соединяющего 2 соседние мембраны перед слиянием (Papahadjopoulos et al., 1990; Jacobson and Papahadjopoulos, 1975; Wilschut et al., 1992; Knecht and Marrink, 2007; Chemomordik and Kozlov, 2008 Roy and Sarkar, 2011).

Физиологическая и патофизиологическая роль МРТ поры

Изучение структуры митохондриальной поры и поиск ее модуляторов позволили показать, что можно подобрать условия, когда циклоспорин А не подавляет митохондриальное набухание. На сегодняшний день известен ряд соединений, способных индуцировать открытие Са -зависимой поры по нечувствительному к ЦсА механизму (Bernardi, 2013). К ним относятся экзогенные амфипатические пептиды (например, сигнальные белки) (Sokolove and Kinally, 1996), некоторые прооксиданты (Pfeiffer et al., 1995; Kushnareva and Sokolove, 2000; Almofti et al., 2003), гормоны (тироксин) (Malkevitch et al., 1997), полифосфаты (Pavlov et al., 2005) и др.

Дискуссия о том, почему пропадает при некоторых условиях чувствительность к циклоспорину А позволила предложить ряд механизмов индукции поры в митохондриях. Так Дж. Лемастерсом предположено, что митохондриальная пора функционирует в 2 режимах (Не and Lemasters, 2002). При относительно низких концентрациях индуцирующих агентов (окислителей, экзогенных пептидов, гормонов и др.) открытие поры активируется Са и ингибируется циклоспорином А. При увеличении концентрации индукторов открытие митохондриальной поры не регулируется ни Са , ни циклоспорином А. При этом размер поры в обоих состояниях почти не отличается. Предложена гипотетическая модель образования поры, в которой митохондриальная пора формируется при раскручивании интегральных мембранных белков под действием Са , окислителей и других стрессорных агентов (Kowaltowski et al., 2001; Не and Lemasters, 2002). Эти белки образуют в мембране кластеры, которые изначально прикрыты шапероно-подобными белками митохондриальной мембраны. Когда число белковых кластеров превышает число доступных шаперонов (при увеличенном воздействии модуляторов), происходит открытие нерегулируемой поры (Не and Lemasters, 2002).

Однако в настоящее время нет прямых доказательств существования таких шапероно подобных белков в митохондриальной мембране. В начале 2000-х годов показано, что одними из индукторов циклоспорин А нечувствительной Са -зависимой поры являются насыщенные длинноцепочечные жирные кислоты. Участие свободных жирных кислот в открытии митохондриальной поры известно давно (Wojtczak and Lehninger, 1961; Ленинджер, 1966; Hunter et al., 1976). Еще в гипотезе о липидной природе митохондриальной поры предположено, что накопление продуктов фосфолипазы Аг в митохондриях является возможной причиной пермеабилизации мембраны органелл (Pfeiffer et al., 1978; Pfeiffer at al., 1979; Beatrice et al., 1980; Broekemeier at al, 1985). Позже, с утверждением представления о белковой природе митохондриальной поры (когда было обнаружено ингибирующее действие циклоспорина А), роль жирных кислот в качестве индукторов поры пересмотрели. На сегодняшний день активация свободными жирными кислотами открытия МРТ поры описывается 2 механизмами. Во-первых, свободные жирные кислоты являются разобщителями (Schonfeld and Bohnensack, 1997; Wieckowski and Wojtczak, 1998; Bodrova et al., 2000), а разобщение способствует открытию поры (Zoratti and Szabo, 1995). Во-вторых, жирные кислоты способны индуцировать МРТ пору через взаимодействие с аденилаттранслокатором. Было предположено, что жирные кислоты стабилизировали его в «с» конформации, которая благоприятна для формирования поры (Schonfeld and Bohnensack, 1997; Wieckowski and Wojtczak, 1998; Wieckowski et al., 2000). Все эти эффекты жирных кислот подавлялись циклоспорином А, хотя со временем он терял способность ингибировать открытие поры (Broekemeier and Pfeiffer, 1989; Broekemeier and Pfeiffer, 1995). Стоит учесть, что влияние жирных кислот наблюдалось на фоне какого-либо из индукторов митохондриальной поры (например, неорганического фосфата), поэтому оценить их собственный вклад в этот процесс достаточно сложно.

В отсутствие дополнительных триггеров митохондриальной поры насыщенная жирная кислота - пальмитиновая, способна индуцировать в присутствие невысоких концентраций ионов Са открытие циклоспорин А-нечувствительной митохондриальной поры (Sultan and Sokolove, 2001а). Процесс индукции циклоспорин А-нечувствительной поры пальмитиновой кислотой подробно охарактеризован. В связи с тем, что пора была циклоспорин А-нечувствительной, предложено название «nonclassical permeability transition» (неклассический переход проницаемости). Однако, авторы не смогли предложить молекулярный механизм, как происходит индукция этой поры. Было понятно, что для индукции поры важен процесс связывания Са с жирными кислотами. Авторы решили, что кальций-связывание транзитивно и, по всей видимости, должно способствовать тому, чтобы доставить кальций к какому-то сайту циклоспорин А-нечувствительной поры.

Однако проведенные в нашей лаборатории исследования продемонстрировали противоположную картину. Насыщенные жирные кислоты связывают кальций с высоким сродством (Кд для пальмитиновой кислоты равна 5 мкМ при рН 8.5), которое на 1-2 порядка выше, чем сродство ненасыщенных жирных кислот и других липидов (Mironova et al., 2001). Такое сродство практически исключает диссоциацию комплексов жирной кислоты с кальцием в митохондриальном матриксе. Поэтому можно заключить, что описание возможного механизма пальмитат/Са -индуцируемой поры было основано на неверных предпосылках, а следовательно, механизм формирования этой поры может быть другим.

Таким образом, исследования по кальций связыванию жирных кислот, проведенные в нашей лаборатории и отсутствие молекулярного механизма образования циклоспорин А-нечувствительной поры, индуцированной пальмитиновой кислотой и Са позволили приступить к настоящей работе и проработать молекулярные механизмы образования, регуляции а также физиологической значимости пальмитат/Са -индуцируемой пермеабилизации митохондрий. Важность ее обусловлена еще и тем, что пальмитиновая кислота является индуктором апоптоза, а открытие митохондриальной поры, индуцируемой этой кислотой, может являться триггерным механизмом для запуска клеточной гибели. О механизмах клеточной смерти пойдет речь в следующем разделе.

В начале 70-х годов прошлого века в литературе появился новый термин «апоптоз» (Kerr et al., 1972). Этот термин означал тип клеточной гибели, отличный от уже известного на тот момент некроза. Было предположено, что апоптоз - форма гибели клеток, регулируемая на генетическом уровне. Считается, что апоптоз необходим для удаления нежелательных клеток в процессе органогенеза, контроля клеточного гомеостаза во взрослых организмах, а также развития ряда патологий (Kerr et al., 1972; Umansky, 1982; Kerr, 2002). Нарушение процессов регуляции апоптоза приводит к различным аномалиям, например, развитию опухолей и аутоиммунных заболеваний (Torchinsky et al., 1995; Mason etal., 2013).

Некроз - случайная неконтролируемая (нерегулируемая) форма клеточной гибели. Факторы, вызывающие некроз, обычно являются внешними для клеток и тканей: физическое повреждение (механический стресс или лизис клеток детергентами), инфекции, токсины, травматические повреждения. Некроз сопровождается быстрым набуханием клетки. В результате происходит разрыв цитоплазматической и клеточных мембран, разрушение внутриклеточных компонентов и, как следствие, гибель клетки (Mehendale et al., 1994).

В случае апоптоза цитоплазматическая мембрана клеток остается целой. Клетки при этом уменьшаются в размере. Происходит конденсация хроматина и фрагментация ядра. Впоследствии происходит фрагментация (дробление) клетки и образование апоптозных телец, которые представляют собой отдельные фрагменты клетки, окруженные мембраной (Самуилов и др., 2000; Elmore, 2007). После образования апоптосомных телец происходит их распознавание и поглощение макрофагами (Kerr et al., 1972; Самуилов и др., 2000).

Считается, что развитие клеточной гибели по пути некроза или апоптоза во многом зависит от внутриклеточной концентрации НАД и АТФ. Резкое падение внутриклеточного уровня АТФ говорит об индукции некроза клетки (Tsujimoto, 1997; Oliver et al,. 1999; Gramaglia et al., 2004). В то же время апоптоз энергозависим и на его ранних стадиях требуется обязательное наличие АТФ (Kroemer et al, 1998; Elmore, 2007).

Известно, что во время апоптоза наблюдается межнуклеосомная фрагментация ДНК. При этом происходит «нарезание» коротких фрагментов по 200 нуклеотидных пар (Liu et al, 1997; Kroemer et al., 1998). Образование фрагментов ДНК в апоптозных клетках наблюдалось при действии множество факторов. На сегодняшний день считается, что фрагминтация ДНК является достаточно поздним событием в апоптозе (Cohen et al., 1992). Фрагментация опосредована несколькими эндонуклеазами, среди которых ядерная Са /Mg -зависимая эндонуклеаза и каспаз-активируемая эндонуклеаза (Seiliev et al., 1992; Sakahira et al., 1998).

Изучение механизма активации этих ферментов показало, что одной из причин их активации может быть подавление активности поли(АДФ-рибоза) полимеразы, которая модифицирует гистоны и белки, участвующие в репарации повреждений ДНК (Nelipovich et al., 1988). С другой стороны показано, что избыточная активация поли(АДФ-рибоза) полимеразы, например при гиперстимуляции NMDA рецепторов или окислительном стрессе, приводит к клеточной гибели. Было продемонстрировано, что ингибиторы этого фермента, защищают клетку от гибели при патогенных воздействиях, в том числе и при гиперстимуляции глутаматных рецепторов (Southan and Szabo, 2003; Jagtap and Szabo, 2005; Fatokun et al., 2008; Strosznajder et al., 2010). Предположено, что гибель клеток при гиперактивации поли(АДФ-рибоза) полимеразы связана с исчерпанием запасов НАД в ядре и цитоплазме (Barr and Conley, 2007; Beneke and Biirkle, 2007). Таким образом, можно предположить, что процессы, связанные с гиперактивацией поли(АДФ-рибоза) полимеразы (куда относится и отсроченная кальциевая дисрегуляция при глутаматной перегрузке NMDA рецепторов, о которой речь пойдет в результатах исследования), приводят к некротической гибели клетки.

Другой характерной особенностью апоптоза является появление на внешнем монослое плазматической мембраны молекул фосфатидилсерина, который обычно присутствует во внутреннем монослое мембраны (Diaz and Schroit, 1996; Martin et al., 1995). На сегодняшний день появление фосфатидилсерина на внешней поверхности клеточной мембраны считается одним из главных маркеров апоптоза, хотя и в случае некроза было зафиксировано подобное явление (Hirt et al., 2000). Считается, что появление фосфатидилсерина снаружи клетки способствует узнаванию поврежденной клетки макрофагами (или Купферовскими клетками печени) и ее фагоцитозу (Kroemer et al., 1998; Canbay et al., 2003).

Ключевым событием апоптоза считается активация цистеиновых протеаз (каспаз), которые инициируют серию протеолитических реакций, приводящих в конечном счете, к апоптотической клеточной гибели. Каспазы играют важную роль как в запуске, так и в терминации апоптоза. Они расщепляют специфические субстраты и, тем самым, опосредуют большинство характерных изменений: образование апоптозных телец, конденсацию хроматина, фрагментацию ДНК и др. (Zhivotovsky et al., 1999). В то же время, существует и апотоз клеток, независимый от каспаз. В таком случае, развитие клеточной гибели (включая и конденсацию хроматина, фрагментацию ДНК) идет по несколько иному механизму (Zamzami et al., 1996).

Считается, что апоптоз, как форма клеточной гибели, может быть реализован по 2 путям: рецептор-зависимому («внешнему») и органелл-зависимому («внутреннему» пути) (Самуилов и др., 2000; Borutaite and Brown, 2003; Koff et al., 2015). Первый тип опосредован через связывание внеклеточных лигандов (Fas лиганд, фактор некроза опухолей (TNF-a), и TRAIL) с соответствующими специфическими рецепторами на поверхности клетки (так называемые «рецепторы смерти»). К рецепторам смерти относятся Fas (также известный как CD95), TNF-a-рецептор 1 (TNF-R1), а также рецепторы смерти 4 и 5 (DR4 и DR5, также известные как TRAIL-R1 и TRAIL-R2, соответственно) (Faubion and Gores, 1999; Koff et al., 2015). Лиганды преимущественно экспрессируются клетками иммунной системы и играют важную роль в уничтожении инфицированных, трансформированных или поврежденных клеток (Guicciardi and Gores, 2005; Akazawa and Gores, 2007; Koff et al., 2015).

Определение фазовой сеперации в мембранах липосом с помощью нонил-акридинового оранжевого

Известно, что насыщенные жирные кислоты, имеющие различное количество атомов углерода в молекуле, сильно отличаются друг от друга по растворимости в липидах (Smith and Tanford, 1973; Sallee, 1974; Kamp and Hamilton, 1993; Richieri et al., 1995; Hamilton, 1998; Hoyrup et al., 2001). В модельных средах, где в качестве липидной фазы использовалась какая-либо гомогенная гидрофобная жидкость, показано, что с увеличением длины ацильной цепи всего на два атома углерода коэффициент распределения липид/вода для жирных кислот возрастает в 14 раз (Smith and Tanford, 1973; Sallee, 1974). Подобные результаты были получены различными методами и в том случае, когда в качестве гидрофобной среды использовались различные искусственные и природные фосфолипидные мембраны (Kamp and Hamilton, 1993; Richieri et al., 1995; Hamilton, 1998; Hoyrup et al., 2001). В опытах на однослойных липосомах, изготовленных из яичного фосфатидилхолина или синтетических ДПФХ, ДМФХ, установлено, что с увеличением длины ацильной цепи на два атома углерода коэффициент распределения липид/вода для насыщенных жирных кислот возрастает приблизительно на порядок (Anel et al., 1993; Kamp and Hamilton, 1993; Hoyrup, 2001). Поэтому при одной и той же применяемой концентрации количество длинноцепочечных жирных кислот в гидрофобной области мембраны будет больше, чем короткоцепочечных. Подобная зависимость наблюдается и для ненасыщенных жирных кислот: появление одной двойной связи в молекуле снижает коэффициент распределения жирной кислоты в смеси липид/вода практически на порядок по отношению к их насыщенному аналогу (Anel et al., 1993).

Таким образом, дополнительным фактором, влияющим на пермеабилизацию липосом жирными кислотами является количество жирной кислоты, которая находится в мембране и взаимодействует с Са (рис. 7). Это относится как к короткоцепочечным жирным кислотам (сравнительно высокая гидрофильность), так и к длинноцепочечным кислотам (высокая критическая концентрация мицеллообразования и при попадании их в водный буфер происходит быстрое образование мицелл (Mukerjee and Mysels, 1971; Абрамзон и Гаев, 1979, Piper et al., 1983; Hoyrup et al., 2001), что затрудняет их встраивание в фосфолипидный бислой). Однако, основным фактором, влияющим на пермеабилизацию липосомальной мембраны, является способность жирной кислоты образовывать прочный комплекс с ионами Са .

Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению Са зависимой пермеабилизации митохондрий и действию на органеллы жирных кислот, остается еще достаточно невыясненных вопросов в этой области биоэнергетики (Pressman and Lardy, 1956; Zborobski and Wojtczak, 1963; Haworth and Hunter, 1979; Zoratti and Szabo, 1995: Schonfeld and Bohnensack, 1997; Di Paola and Lorusso, 2006; Bernardi and Di Lisa; 2015).

При перегрузке митохондрий Са происходит открытие во внутренней мембране митохондрий поры, известной как МРТ-пора. Эта пора представляет собой белковый мегаканал, состоящий из аденилаттранслокатора (или других белков-переносчиков анионов внутренней мембраны митохондрий), порина, циклофилина Д и ряда других мембранных митохондриальных белков (Zoratti et al., 2005; Bernardi, 2013; Bernardi and Di Lisa; 2014). Открытие этой поры ингибируется циклоспорином A (Fournier et al., 1987; Crompton et al., 1988; Zoratti and Szabo, 1995). Параллельно с группой американских коллег (Sultan and Sokolove, 2001) мы обнаружили, что насыщенные жирные кислоты способны индуцировать набухание митохондрий, нечувствительное к циклоспорину А.

Как показано на рисунке 10А, добавление 15 мкМ пальмитиновой кислоты и 30 мкМ Са к митохондриям в изотонических условиях приводит к быстрому и высокоамплитудному падению оптической плотности суспензии митохондрий, что свидетельствует о процессе набухания органелл. Пальмитат/Са -индуцированное набухание органелл продемонстрировано с помощью электронной микроскопии (рис. ПА и Б). Набухание л+ митохондрий, вызванное пальмитиновой кислотой и Са , не ингибируется циклоспорином А и, в отличие от набухания, индуцированного открытием МРТ-поры, протекает без лаг-периода. Ультраструктура митохондрий печени крыс до (А) и после (Б) добавления 15 мкМ ПК и 30 мкМ Са к митохондриям. Состав среды: 210 мМ маннитол, 70 мМ сахароза, 5 мМ янтарная кислота, 5 мкМ ЭГТА, 1 мкМ ротенон, 1 мкМ ЦсА, 10 мМ Hepes-KOH, рН 7.4. необходимо присутствие Са в митохондриальном матриксе. Следовательно, взаимодействие Са с пальмитиновой кислотой и индукция пермеабилизации происходит с матриксной стороны внутренней митохондриальной мембраны. Это важное отличие пальмитат/Са -индуцированного набухания митохондрий от пальмитат/Са -индуцированной пермеабилизации липосом, где связывание Са с кислотой происходит на наружной поверхности липосомальной мембраны. концентрации пальмитиновой кислоты (12А) и Са (12Б). 30 мкМ Са индуцирует ЦсА-нечувствительное набухание митохондрий в присутствии лишь 5 мкМ пальмитиновой кислоты (около 12.5 нмоль ПК/мг митохондриального белка). Согласно нашим и литературным данным (Usher et al., 1978; Wojtczak, 1969; Nixon and Chan, 1979; Le-Quoc and Le-Quoc, 1989; Owens, 1979; Mironova et al., 2004), содержание свободных жирных кислот в митохондриях составляет 15-30 нмоль/мг митохондриального белка. Следовательно, исходя из наших результатов, даже небольшое увеличение количества пальмитиновой кислоты будет приводить к изменению проницаемости митохондриальной мембраны, а превышение ее содержания в 2 раза вызовет практически максимальное митохондриальное набухание.

Зависимость скорости ЦсА-нечувствительного набухания митохондрий печени крыс от концентраций ПК (А) и Са2+ (Б). Среда инкубации как на рис. 11. Добавки: А) 5-30 мкМ ПК и 30 мкМ Са2+; Б) 15 мкМ ПК и 10-80 мкМ Са2+ Приведены средние ± ошибка средней (п=5). Аппроксимация данных была произведена функциями у=2.14+(-0.09-2.14)/(i+e(x"963)/341) (А) и у=1.79-1.74 0.896х(Б).

Концентрация Са , при которой в присутствии 15 мкМ ПК наблюдается максимальное набухание, равна 20 мкМ, что значительно меньше того количества Са , которое требуется для открытия ЦсА-чувствительной поры (Sultan and Sokolove, 2001а; Sultan and Sokolove, 2001b; Белослудцев и др., 2005). Однако, Са накапливается в митохондриальном матриксе. Поэтому действующая концентрация Са в митохондриях, вероятно, существенно выше, чем концентрация Са во внешней среде. ЦсА-нечувствительное набухание митохондрий, индуцированное пальмитиновой кислотой и Са , было продемонстрировано в нашей лаборатории не только на митохондриях печени, но и на митохондриях сердца крыс (Belosludtsev et al, 2009). Кроме того, с различной чувствительностью к индукторам поры набухают митохондрии печени крыс различных линий, мышей и сусликов (Belosludtsev et al., 2009; Venediktova et al., 2013).

Механизм Са -зависимой пермеабилизации мембран, индуцируемой жирными кислотами

Исследования, посвященные физиологической роли пермеабилизации митохондрий ионами Са , ведутся довольно давно. Еще до появления хемиосмотической теории П. Митчелла (Mitchell, 1961; Mitchell and Moyle, 1967) продемонстрировано набухание митохондрий и повреждение механизмов накопления энергии в присутствии

Са , фосфата и жирных кислот, а также ингибирование этих процессов ионами магния и адениновыми нуклеотидами (Raaflaub, 1953; Brenner-Holzach and Raaflaub, 1954; Lehninger, 1959; Wojtczak and Lehninger, 1961; Zborowski and Wojtczak, 1963; Azzi and Azzone, 1965). Эта пермеабилизация рассматривалась как артефакт в экспериментах in vitro и большой роли в механизмах клеточной патофизиологии ей не отводилось. Значительный прогресс в понимании физиологической и патофизиологической роли митохондриальной Са -зависимой поры достигнут в конце 80-х годов XX века, когда в ряде работ было предположено, что открытие МРТ-поры будет приводить к клеточной гибели (Crompton and Costi, 1988). Последующие исследования молекулярной природы МРТ-поры и механизмов ее регуляции показали, что открытие МРТ-поры при удалении индуцирующих пору агентов может быть не только постоянным, но и кратковременным (Petronilli et al., 1999; Wang et al., 2008, 2013; Fang et al., 2011). Таким образом, было предположено, что МРТ-пора может быть неселективной системой выброса Са из митохондрий (Bernardi and Petronilli; 1996; Ichas et al., 1997). Это говорит о том, что образование МРТ-поры в клетке может иметь и физиологическое значение.

Образование в митохондриальной мембране липидной пальмитат/Са -индуцируемой поры, в результате чего органеллы будут набухать, а мембранный потенциал падать, также может приводить к подобным последствиям - индукции клеточной гибели и выбросу ионов Са из митохондрий. Таким образом, в настоящем разделе будет продемонстрирована возможная физиологическая и патофизиологическая роль митохондриальной липидной пальмитат/Са -индуцируемой поры.

Пальмитиновая кислота является природным активатором апоптоза (Paumen et al., 1997; Sparagna et al., 2000; Listenberg L. et al., 2003; Hardy et al., 2003). Индукция апоптоза пальмитиновой кислотой наблюдается в различных типах клеток и может происходить как по каспаз-зависимому, так и каспаз-независимому пути (Ulloth et al., 2003). При этом происходит увеличение неспецифической проницаемости внутренней мембраны митохондрий и выброс проапоптотических белков - цитохрома с и апоптоз-индуцирующего фактора (АИФ).

Существует ряд гипотез о механизме пальмитат-индуцированного апоптоза, большинство из которых связано с нарушением метаболизма митохондриальных липидов, нарушением Са -гомеостаза и др. (Paumen et al., 1997; Kroesen et al., 2001; Hardy et al., 2003; Henique et al., 2010; Egnatchik et al., 2014). Образование митохондриальной поры также рассматривается как один из предполагаемых механизмов, поскольку во время клеточной гибели наблюдается нарушение внутриклеточного Са -гомеостаза. В ряде работ показано, что пальмитат-индуцированный апоптоз незначительно ингибируется циклоспорином A (Kong and Rabkin, 2000; Sparagna et al., 2000; Koshkin et al., 2008). В то же время, принято считать, что образование МРТ-поры во внутренней митохондриальной мембране связано, в первую очередь, не с апоптотической, а с некротической гибелью клеток (Crompton, 2003; Li et al., 2004).

Можно предположить, что одним из возможных механизмов пальмитат-ндуцированного апоптоза является открытие липидной поры, индуцируемой пальмитиновой кислотой и Са . При открытии пальмитат/Са -индуцируемой поры в митохондриях происходит набухание органелл - также, как и при открытии МРТ-поры.

Способность пальмитат/Са -индуцируемой поры к самопроизвольному закрыванию с последующей возможностью восстановления митохондриального мембранного потенциала также дает основание предположить участие этой поры в индукции пальмитат-зависимого апоптоза. Известно, что в течение апоптоза митохондрии должны поддерживать определенный уровень АТФ (Liu et al., 1996).

Важным индикатором участия какого-либо процесса в развитии апоптоза является обнаружение в инкубационной среде проапоптотических белков. В результате экспериментов, проведенных в нашей лаборатории, было показано, что добавление к митохондриям пальмитиновой кислоты и Са (30 и 60 нмоль/мг митохондриального белка соответственно) приводит к ЦсА-нечувствительному выбросу из митохондрий проапоптотических белков: цитохрома с и АИФ (рис. 51). Количество вышедших цитохрома с и АИФ при пальмитат/Са -индуцированном набухании было меньше, чем при образовании ЦсА-чувствительной МРТ-поры в этих же условиях (Belosludtsev et al., 2006; Belosludtsev et al., 2009). Помимо пальмитиновой кислоты, выброс цитохрома с из митохондрий вызывает, в присутствии Са , и дикарбоновая а,со-гексадекандиовая кислота (Дубинин и др., 2014).

Отметим, что ненасыщенные жирные кислоты и неметаболизируемый аналог пальмитиновой кислоты, 2-бромопальмитиновая кислота, не вызывают апоптотической клеточной гибели. Более того, ненасыщенные жирные кислоты способны ингибировать развитие пальмитат-индуцированного апоптоза (Hardy et al., 2003; Chen et al., 2014; Maruyama et al., 2014). Предполагается, что этот эффект ненасыщенных жирных кислот связан с метаболизмом митохондриальных липидов, который изменяется под действием пальмитиновой кислоты (Hardy et al., 2003; Chen et al., 2014; Maruyama et al., 2014). Действие ненасыщенных жирных кислот совпадает с ингибирующим действием высоких концентраций олеиновой кислоты на индукцию пальмитат/Са -зависимого набухания митохондрий. супернатант

ЦсА-нечувствительный выход цитохрома с и апоптоз-индуцирующего фактора (АИФ) из митохондрий печени крыс, индуцированный 15 мкМ ПК и 30 мкМ Са . Состав среды: 210 мМ маннитол, 70 мМ сахароза, 5 мМ янтарная кислота, 5 мкМ ЭГТА, 1 мкМ ротенон, 1 мкМ ЦсА, 10 мМ Hepes-KOH, рН 7.4. MX - осадок митохондрий печени крыс (без добавок). Контр -супернатант митохондрий печени крыс (без добавок). ПК/Са - супернатант митохондрий печени крыс после добавления к ним ПК и Са .

Стоит учитывать, что практически любое изменение объема митохондрий в экспериментах in vitro может привести к выбросу из органелл проапоптотических белков. Показано, что выброс цитохрома с происходит, например, при изменении тоничности раствора или добавлении к митохондриям валиномицина (Gogvadze et al., 2006). Тем не менее, в случае пальмитат-индуцируемого апоптоза пора, индуцируемая пальмитиновой кислотой и Са , может являться триггерным механизмом. Проведение следующих экспериментов подтверждает это предположение.