Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Аутосомно-доминантные церебеллярные атаксии 11
1.1.1. Клиническая картина АДЦА на примере СЦА2 12
1.1.2. Молекулярные основы патогенеза АДЦА на примере СЦА2 14
1.2. Клетки Пуркинье – ключевой элемент коры мозжечка 16
1.2.1. Гомеостаз кальция в КП 18
1.2.2. Биофизические и физиологические свойства КП 21
1.2.3. Нарушение свойств КП при АДЦА 26
1.3. Кальций-активируемые калиевые каналы малой проводимости 34
1.3.1. Строение и функции SK каналов 35
1.3.2. SK каналы как потенциальная мишень для терапии АДЦА 39
Глава 2. Материалы и методы 42
2.1. Модуляторы SK каналов 42
2.2. Методы работы с животными
2.2.1. Бридинг и генотипирование 43
2.2.2. Методы оценки моторной активности 44
2.3. Методы электрофизиологии 45
2.3.1. Метод локальной фиксации потенциала КП на мозжечковых срезах 45
2.3.2. Внеклеточная регистрация активности КП in vivo 48
2.4. Статистический анализ 49
Глава 3. Результаты 53
3.1. Нарушения моторной активности в мышах линии SCA2-58Q 53
3.2. Характеристики спонтанной активности КП СЦА2 мышей in vitro 55
3.3. Активаторы SK каналов нормализуют активность СЦА2 КП in vitro 59
3.4. Модуляция активности КП лабораторных мышей in vivo 3.4.1. Влияние поверхностной аппликации активаторов SK каналов на свойства КП 65
3.4.2. Влияние внутривенных инъекций СуРРА на свойства КП 70
3.4.3. Влияние внутрибрюшинных инъекций ингибитора SK каналов NS8593 на активность КП 78
3.4.4. Влияние внутрибрюшинных инъекций CHZ на активность КП 84
3.5. Спонтанная активность КП мышей линии SCA2-58Q in vivo 87
3.5.1. Типы активности КП СЦА2 мышей in vivo 88
3.5.2. Характеристики спонтанной активности КП СЦА2 мышей in vivo 96
3.6. CHZ нормализует активность СЦА2 КП in vivo 103
3.6.1. Активатор SK каналов обращает пачечную активность СЦА2 КП в тоническую 104
3.6.2. Пример расчёта коэффициента 107
Глава 4. Обсуждение 112
4.1. Электрофизиологические свойства КП ДТ и СЦА2 мышей 112
4.2. Активация SK каналов как метод терапии заболевания атаксии 120
Выводы 123
Благодарности 124
Список сокращений 125
Список публикаций по теме диссертации 128
Список литературы 132
- Клиническая картина АДЦА на примере СЦА2
- Бридинг и генотипирование
- Характеристики спонтанной активности КП СЦА2 мышей in vitro
- Активация SK каналов как метод терапии заболевания атаксии
Клиническая картина АДЦА на примере СЦА2
Недавние исследования выявили, что вход ионов кальция в КП через VGCC является чрезвычайно важным для правильной синаптической передачи от ЛВ к КП во время постнатального развития. Эти данные были получены с помощью одновременного использования методов патч-клампа в конфигурации whole-cell и двухфотонного кальциевого имиджинга in vivo в КП мышей дикого типа и мутантных мышей с КП-специфичным нокаутом генов VGCC каналов P/Q типа [26]. Для КП также характерна высокая экспрессия кальмодулин-связывающего транскрипционного активатора 1-го типа (CAMTA1 – calmodulin-binding transcription activator 1). Делеция гена CAMTA1 на мышиной модели приводила к появлению тяжёлых симптомов атаксии, сопровождающихся дегенерацией КП и атрофией мозжечка [27]. Принято считать, что долговременная депрессия (LTD) синаптической передачи между ПВ и КП является главным основополагающим принципом моторного обучения. В КП наблюдается экспрессия кальций/кальмодулин-зависимой протеин киназы II (CaMKII – calcium/calmodulin-dependent protein kinase II). Было показано, что активация CaMKII приводит к продолжительному увеличению уровня циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), важной сигнальной молекулы, являющейся вторичным посредником и принимающей участие в сигнальном механизме LTD, запускаемым CaMKII [28].
Таким образом, можно сделать вывод о том, что в КП наблюдается экспрессия различных кальциевых сенсоров с целью слаженного поддержания кальциевого гомеостаза в этих нейронах. Существует два основных пути попадания ионов кальция в цитоплазму КП. Оба способа подразумевают присутствие молекул глутамата, возбуждающего нейромедиатора. Первый путь представляет собой вход ионов кальция через VGCC каналы из интерстициальной жидкости. Активация данных каналов происходит при деполяризации мембраны, вызываемой работой AMPA рецепторов (рецепторов -амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты). Второй путь связан с активацией метаботропного глутаматного рецептора (mGluR – metabotropic glutamate receptor), приводящей к выбросу ионов кальция из эндоплазматического ретикулума (ЭПР) в цитоплазму клетки посредством активации рецептора инозитолтрифосфата (IP3R – inositol 1,4,5riphosphate receptor). Данный кальциевый выброс принято называть инозитолтрифосфат-индуцируемым кальциевым выходом (IICR – InsP3-induced calcium release) [29].
IP3R представляет собой внутриклеточный кальциевый канал, который опосредует выброс ионов кальция преимущественно из ЭПР. Чаще всего IP3R активируется молекулами IP3, что приводит к IICR. IP3R принимает участие в регуляции многих важных физиологических процессов, включая обучение и память, поведение, клеточное деление и пролиферацию, дифференциацию, оплодотворение, развитие и гибель клеток. Существует три подтипа IP3R, в нейронах, в частности, в КП, доминирующей изоформой является IP3R 1-го типа. Гиперактивация IP3R1 приводит к увеличению кальциевого выброса из ЭПР. Данное наблюдение позволяет сделать вывод о том, что нарушение кальциевой сигнализации в нейронах может играть ключевую роль в патогенезе некоторых нейродегенеративных заболеваний, таких, как БХ, СЦА и болезнь Альцгеймера. Для подтверждения данной гипотезы были проведены экспериментальные испытания на трансгенных мышах. Связь между аномальной кальциевой сигнализацией и клеточной смертью нейронов была продемонстрирована в экспериментах на мышиных моделях заболеваний БХ, СЦА2 и СЦА3 [30]. Описанные в литературе данные свидетельствуют о том, что аномальная кальциевая сигнализация может играть важную роль в патогенезе СЦА1, 5, 6, 14 и 15/16. Таким образом, можно сделать вывод о том, что IICR может быть одной из причин патофизиологических процессов, протекающих в нейронах, в частности, в КП, и ведущих к нейродегенерации [29].
Физиологические функции IP3R были чётко идентифицированы в экспериментах на мутантных мышах. Было показано, что в большинстве случаев делеция гена IP3R1 приводила к летали в период пренатального развития. Подопытные мыши, которым удавалось выжить, проявляли тяжёлые симптомы атаксии и умирали в период раннего детства. Результаты снятия электроэнцефалограммы с данных мутантных мышей показали, что мыши страдали эпилепсией, что говорит о том, что IP3R1 и связанная с ним кальциевая сигнализация являются необходимыми для выполнения важных функций головного мозга [31].
Сигнал в клетки Пуркинье поступает по двум различным афферентным входам: по системам лазящих и мшистых волокон (Рис. 1.1). Лазящие волокна берут начало в нижней оливе и являются частью спино-оливо-мозжечкового пути, по которому поступает информация от мышечных, кожных и суставных рецепторов. Кроме того, по системе лазящих волокон в мозжечок поступает информация от рецепторов вестибулярной системы [32], висцеральных органов [33], а также зрительная и слуховая афферентация [34, 35]. Мшистые волокна идут в составе спино-мозжечковых, кунео-мозжечкового, текто-мосто мозжечкового и спино-ретикуло-мозжечкового трактов, передавая самую разнообразную сенсорную информацию.
Лазящие волокна образуют непосредственные контакты с клеткой Пуркинье, тогда как взаимодействие мшистых волокон идет через гранулярные клетки и их аксоны, представляющие собой параллельные волокна. Конвергенция многочисленных аксонов гранулярных клеток и единственного лазящего волокна на каждую клетку Пуркинье является уникальной особенностью, характерной для нейронной схемы мозжечка, хорошо известной со времён Рамон-и-Кахаля. Клетки Пуркинье генерируют два различных типа спайков: простые и сложные. Возникновение сложных спайков обусловлено многочисленными синапсами, формируемыми между единственным лазящим волокном и проксимальной частью дендритного дерева клетки Пуркинье. Они состоят из соматических Na+-зависимых потенциалов действия и последующих серий малых Ca2+-зависимых потенциалов действия. Возникают сложные спайки нерегулярно и имеют низкую частоту – около 1 Гц. Простые спайки генерируются клеткой Пуркинье в ответ на возбуждение, приходящее по мшистым волокнам. Их появление в паттерне активности при регистрации in vivo также отличается нерегулярностью [36]. Однако при работе на срезах мозжечка было показано, что в таких условиях разряд клетки Пуркинье характеризуется большей регулярностью и обусловлен наличием внутреннего пейсмекера [37]. Было выдвинуто предположение о том, что простые спайки представляют собой Na+-зависимые потенциалы действия (ПД), возникающие в области клеточной сомы [38]. Частота простых спайков зависит от условий проведения эксперимента и составляет в среднем 20-100 Гц при внеклеточной регистрации in vivo [38, 39], в случае работы на срезах это значение варьирует от 17 до 150 Гц [40].
Неотъемлемым свойством мембраны клеток Пуркинье является бистабильность. Данное свойство характерно для возбудимой мембраны большинства нейронов и представляет собой переходы между различными состояниями клеточной мембраны, которые могут регулироваться короткими импульсами тока гиперполяризации и деполяризации, а также могут быть прекращены при значительно сильной инжекции отрицательного или положительного постоянного тока [41]. Другими словами, бистабильность – это сосуществование двух типов электрофизиологической активности. Например, пачечной и тонической активности или тонической и молчащей [42]. Исследования на различных типах нейронов ЦНС, а именно, на нейронах таламуса [43], нейронах коры таламуса [44], интернейронах гиппокампа [45], на крупных нейросекреторных клетках [46] и других нейронах, для которых характерна спонтанная активность, показали, что суммарный ток катионов Ih, вызванный гиперполяризацией мембраны, играет ключевую роль в контроле периодичности генерации ПД как в случае тонической, так и в случае пачечной электрофизиологической активности [47]. Однако, в работе на культуре клеток Пуркинье было показано, что напрямую ток Ih не вовлечён в формирование ПД в случае тонической активности [40].
Бридинг и генотипирование
Было подтверждено, что средний вес мышей был одинаков для каждой экспериментальной группы. Усреднённые по каждой экспериментальной группе результаты прохождения теста «прогулка по перекладине» показали, что для СЦА2 мышей наблюдается незначительное увеличение среднего значения быстроты пробега (Рис. 3.1А) по планкам различного диаметра по сравнению с группой ДТ мышей. Результаты анализа количества соскальзывания лап (Рис. 3.1Б) показали, что в случае пробега по планкам диаметром 5 и 17 мм у СЦА2 мышей отмечается статистически незначительное увеличение соскальзывания лап по сравнению с ДТ мышами, в то же время в случае пробега по планке диаметром 11 мм наблюдается значительное ( - р 0.01) увеличение количества соскальзывания лап по сравнению с ДТ мышами. Полученные результаты совпадают с экспериментальными данными, полученными ранее [80], и говорят о том, что у СЦА2 мышей в возрасте 6 месяцев происходит ухудшение координации и чёткости движений, о чём можно судить по увеличению количества соскальзывания лап в случае СЦА2 мышей по сравнению с ДТ мышами. Статистически незначимое увеличение быстроты пробега по планке в случае СЦА2 мышей также обусловливается начальной стадией возникновения нарушений моторной активности мутантных мышей и скорее всего вызвано тем, что у СЦА2 мышей на ранних этапах развития заболевания уже наблюдаются нарушения механизмов моторной памяти, что приводит к замедлению выработки двигательных навыков в процессе обучения. Совпадение полученных экспериментальных данных с опубликованными ранее результатами ([80]) подтверждает, что в случае используемой в экспериментах трансгенной линии SCA2-58Q не наблюдается потери поведенческого фенотипа
С целью оценки функционального состояния КП мышей трансгенной линии SCA2-58Q была проведена серия экспериментов по регистрации спонтанной активности КП в отсутствие синаптической передачи на КП от других нейронов мозжечка на срезах мозжечка СЦА2 и ДТ мышей в возрасте 6-ти, 12-ти, 24-х, 36-ти и 48-ми недель. Метод регистрации электрофизиологической активности КП in vitro на мозжечковых срезах подопытных мышей, также как и проводимый анализ полученных результатов, был подробно описан ранее (см. 2.3.1). В каждом эксперименте активность КП классифицировалась как тоническая, либо пачечная, на основе записи сигнала длиной 5 мин. Паттерн активности КП классифицировался как тонический, если он состоял из редко прерывающихся тонических спайков, обладающих относительно постоянной частотой (Рис. 3.2А). Клетка обладала пачечной активностью, если было определено, что более 5% МИИ попадает за пределы интервала ( x - 3; x + 3), где x – среднее значение МИИ, – среднеквадратичное отклонение (Рис. 3.2Б).
Полученные данные показали, что более 80% КП молодых мышей генерируют тонический сигнал как в случае СЦА2, так и в случае ДТ мышей в возрасте 6-ти и 12-ти недель (Рис. 3.2В). Однако в СЦА2 мышах старшего возраста доля тонических клеток значительно уменьшалась по сравнению с ДТ мышами той же возрастной группы (р 0.05, р 0.01; Рис. 3.2В). Так, в случае ДТ мышей возраста 24-х недель наблюдалось (91 ± 10) % (количество мышей, n = 4) КП с тонической активностью, тогда как у СЦА2 мышей того же возраста отмечалось всего (64 ± 9) % (n = 7) КП, которые генерировали тонический сигнал (р 0.05; Рис. 3.2В). Доля КП, генерирующих тонический сигнал, в ДТ мышах в возрасте 36-ти недель уменьшалась до (87 ± 3) % (n = 2), а в СЦА2 мышах того же возраста – до (62 ± 6) % (n = 3, р 0.01; Рис. 3.2В). С увеличением возраста подопытных животных разница в электрофизиологических свойствах КП становилась всё более существенной. При работе на срезах мозжечка мышей в возрасте 48-ми недель методом луз-патч было показано, что доля КП, генерирующих тоническую активность уменьшалась до значения в (81 ± 4) % (n = 4) в мышах дикого типа, при этом процентное соотношение количества тонических клеток в случае СЦА2 мышей уменьшалось до (56 ± 10) % (n = 3, р 0.01; Рис. 3.2В).
Спонтанная активность КП мозжечковых срезов ДТ и СЦА2 мышей. Регистрация сигнала проводилась методом локальной фиксации потенциала (метод патч-кламп). Спонтанная электрофизиологическая активность КП была проанализирована для ДТ и СЦА2 мышей в возрасте 6-ти, 12-ти, 24-х, 36-ти и 48-ми недель. Активность КП классифицировалась как тоническая (А) или пачечная (Б) на основе анализа пятиминутной записи электрофизиологической активности КП. Приведены примеры фрагментов записей тонической (А) и пачечной активности (Б) КП у ДТ и СЦА2 мышей в возрасте 24 недели. (В) Доля тонических клеток была подсчитана как процент от общего количества клеток, проявляющих электрофизиологическую активность, результаты представлены в графическом виде. Можно видеть, что в возрасте 24-х, 36-ти и 48-ми недель в случае СЦА2 мышей наблюдается значительно меньшее количество тонических клеток по сравнению с ДТ мышами. Результаты представлены в виде среднего значения доли тонических клеток ± SEM. Достоверность различий: - р 0.05, - р 0.01 [20]. Проанализировав распределение тонических клеток в ДТ и СЦА2 мышах разных возрастных групп, далее был представлен анализ характеристик спонтанной активности, а именно, для КП с тонической активностью были определены средние значения частоты генерации ПД и КВ МИИ (Рис. 3.3). Было показано, что для молодых мышей в возрасте 6-ти и 12-ти недель для обоих генотипов наблюдаются одинаковые значения частоты генерации активности и её регулярности (Рис. 3.3). Однако, с увеличением возраста у КП СЦА2 мышей начинало наблюдаться статистически значимое уменьшение частоты генерации спайков (р 0.01, р 0.001; Рис. 3.3А) и увеличение изменчивости генерируемой тонической активности (р 0.05, р 0.0001; Рис. 3.3Б) по сравнению с ДТ мышами той же возрастной группы. Так, у КП СЦА2 мышей в возрасте 24-х недель наблюдалась более медленная частота генерации активности по сравнению с КП ДТ мышей того же возраста. В среднем, КП ДТ мышей данной возрастной группы генерировали ПД с частотой (51 ± 3) Гц (m = 19 нейронов), в то время как КП СЦА2 мышей того же возраста генерировали тоническую активность с частотой (37 ± 3) Гц (m = 19, р 0.01; Рис. 3.3А). При этом статистически значимых отличий в вариации МИИ между КП мутантных мышей и мышей дикого типа данной возрастной группы обнаружено не было (Рис. 3.3Б). В случае ДТ мышей в возрасте 36-ти недель КП генерировали тонический электрофизиологический сигнал с частотой (58 ± 7) Гц (m = 14), в то же время, в случае СЦА2 мышей того же возраста частота генерации ПД у тонических клеток составляла (29 ± 4) Гц (m = 22, р 0.001; Рис. 3.3А). В добавок к значительному понижению частоты ПД, в случае СЦА2 КП наблюдалось значительное увеличение значения КВ МИИ, составившее 0.28 ± 0.05 (m = 22), по сравнению с ДТ КП, в случае которых среднее значение КВ МИИ составило 0.13 ± 0.03 (m = 14, р 0.05; Рис. 3.3Б). Самая старшая экспериментальная группа состояла из мышей в возрасте 48-ми недель. Анализ частоты генерации ПД в случае тонических КП показал, что для группы ДТ мышей данный параметр оставался на прежнем уровне и составлял (55 ± 4) Гц (m = 24). При этом частота активности СЦА2 КП продолжала уменьшаться и составила (25 ± 6) Гц (т = 13, р 0.001; Рис. 3.3А). Для данной возрастной группы наблюдалось повышение значения КВ МИИ: до 0.20 ± 0.03 (т = 24) в случае ДТ КП и до 0.49 ± 0.05 (т = 13) в случае СЦА2 КП (р 0.0001; Рис. 3.3А).
Характеристики спонтанной тонической активности КП мозжечковых срезов ДТ и СЦА2 мышей. Спонтанная тоническая активность КП была проанализирована для ДТ и СЦА2 мышей в возрасте 6-ти, 12-ти, 24-х, 36-ти и 48-ми недель. (А) Была проанализирована частота генерации ПД в случае тонической активности КП. Частота активности в случае СЦА2 мышей в возрасте 24-х, 36-ти и 48-ми недель была значительно ниже, чем в случае ДТ мышей того же возраста. (Б) Было проанализировано значение КВ МИИ КП с тонической активностью. В случае СЦА2 мышей в возрасте 36-ти и 48-ми недель КП с тонической активностью генерировали менее регулярный сигнал, чем КП ДТ мышей того же возраста. Результаты представлены в виде среднего значения величины ± SEM. Достоверность различий: - р 0.05, - р 0.01, - р 0.001, - р 0.0001 [20].
Характеристики спонтанной активности КП СЦА2 мышей in vitro
В исследованиях на срезах мозжечка мутантных мышей, больных СЦА2, было показано, что модуляторы СуРРА и NS309 нормализуют спайковую активность клеток Пуркинье, обращая пачечную активность в тоническую. При этом действие на тоническую активность клеток выражалось в уменьшении частоты спайков [65]. В настоящих исследованиях in vivo наблюдался похожий эффект воздействия рассматриваемых модуляторов на частоту ПС клеток Пуркинье: действие модулятора NS309 приводило к более значимому понижению частоты по сравнению с действием CyPРА [65]. Как уже говорилось ранее, более низкая эффективность применения СуРРА по сравнению с NS309 в данных экспериментах возможно обусловлена тем, что СуРРА, являясь активатором SK3/SK2 каналов, проявляет относительно низкое сродство к SK каналам 2-го типа, которые являются преобладающей изоформой в клетках Пуркинье и, соответственно, более высокое к SK каналам 3-го типа. В то же время модулятор SK/IK каналов NS309 оказывает эффективное воздействие на все подтипы SK каналов, в том числе и на SK каналы 2-го типа [113].
Таким образом, в настоящей работе впервые было продемонстрировано, что SK каналы действительно способны регулировать работу клеток Пуркинье мозжечка, ограничивая частоту разряда, генерируемого этими клетками, в условиях проведения эксперимента in vivo. Также было выявлено, что в опытах, выполненных на целом животном, влияние модуляторов SK каналов на работу клеток Пуркинье происходит подобным образом, как и в случае исследований in vitro. Данные результаты были важны для последующих этапов научной работы. В дальнейшем были проведены подобные исследования с использованием других способов доставки исследуемых веществ, например, с помощью внутривенных инъекций, что было важно для модуляции способа доставки веществ в организм, общепринятого в клинике.
Итак, методом внеклеточной регистрации активности от одиночного отведения КП была показана принципиальная возможность модуляции работы клеток Пуркинье мозжечка in vivo посредством поверхностной аппликации растворов активаторов SK каналов (Рис. 3.9). Однако данный способ доставки потенциальных терапевтических средств не является приемлемым для клинических испытаний, поэтому было решено провести серию экспериментов по внутривенному введению растворов одного из исследуемых веществ и оценки влияния активации SK каналов на электрофизиологические свойства КП in vivo в данном случае. В качестве тестируемого активатора SK каналов было выбрано вещество СуРРА, поскольку данный модулятор имеет высокую специфичность активации SK каналов 2-го и 3-го типа.
В рамках настоящих исследований была проведена серия экспериментов по внеклеточной регистрации активности КП коры интактного мозжечка in vivo на беспородных лабораторных мышах-самцах Mus musculus в возрасте 6 мес. Методика внеклеточной регистрации от одиночного отведения КП коры мозжечка in vivo подробно изложена в 2.3.2. Введение используемых веществ осуществляли путем внутривенной инъекции в хвостовую вену подопытного животного. Объём вводимого раствора составлял 150-200 мкл в зависимости от веса мыши. Используемая концентрация раствора составляла 1 мМ СуРРА. В качестве контроля тестировали действие чистого физиологического раствора. Непрерывную запись активности проводили в течение 5 мин до инъекции препарата и 30 мин после. Также проводили короткие 30-ти секундные записи через 60, 90, 120, 150 и 180 мин после внутривенной инъекции. Влияние модулятора оценивали для каждой клетки через 30, 60, 90, 120, 150 и 180 мин после внутривенной инъекции по изменению частоты простых спайков (ПС). Всего в опытах было зарегистрировано 33 случая активности клеток Пуркинье, из которых статистически было обработано 12 клеток, поскольку регистрируемая импульсная активность остальных нейронов не сохранялась в течение 3-х часов после внутривенной инъекции. Поскольку в представленных экспериментах исследовалось влияние модулятора SK2/SK3 каналов СуРРА и поскольку известно, что SK каналы вовлечены в генерацию простых спайков [58], анализа частоты сложных спайков не проводили. Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим применением теста Бонферрони. Определяли средние значения частоты ПС. Данные представляли в виде относительных частот с учетом среднеквадратичного отклонения, т.е. (Fi/F0) ± , где F0 – значение частоты ПС за 5 мин до инъекции тестируемого вещества, Fi – значение частоты ПС после инъекции вещества (оценивали для каждой клетки через 30, 60, 90, 120, 150 и 180 мин после внутривенной инъекции), – среднеквадратичное отклонение.
В большинстве экспериментов частота спонтанных простых спайков составляла 15-50 Гц, при этом встречались сигналы с частотой от 4 до 90 Гц. В качестве контроля были проведены эксперименты, в которых проводили внутривенную инъекцию в хвостовую вену мыши с чистым физиологическим раствором. Характерный пример регистрации до и после внутривенной инъекции физиологического раствора приведён на Рис. 3.10.
Активация SK каналов как метод терапии заболевания атаксии
Тем не менее, большинство предыдущих исследований на мышиных моделях атаксии были представлены с использованием методов электрофизиологии in vitro на срезах мозжечка [16, 20, 65, 66, 69, 70, 109]. Функциональные свойства КП могут быть нарушены при нарезании срезов и могут отличаться от свойств КП in vivo. Методом внеклеточной регистрации активности от одиночного отведения КП мышей с мутацией в гене CACNA1A, кодирующем порообразующую субъединицу VGCC каналов P/Q типа, ранее было показано, что в случае мутантных мышей наблюдается большее количество КП с иррегулярной активностью, при этом другие характеристики активности не изменялись [64]. Авторы публикации сделали вывод о том, что полученные данные подтверждают идею о влиянии регулярности активности КП на обработку сенсомоторной информации [64]. Другая исследовательская группа представила эксперименты по внеклеточной записи активности КП in vivo в случае мышей, инфицированных аденоассоциированным вирусом (ААВ), кодирующим два различных варианта человеческого С-концевого (СТ) участка белкового канала P/Q типа, полученных в результате разных вариантов сплайсинга (СТ-короткий без вставки полиглутамина и СТ-длинный с 27-ью остатками глутамина, поскольку данная мутация наблюдается в случае СЦА6 пациентов). В экспериментах было показано, что КП мышей, геном которых содержал вставку СТ-длинного участка, генерируют простые спайки менее регулярно, чем клетки в контроле и клетки, экспрессирующие СТ-короткий участок [144]. Было показано, что мутации, наблюдаемые в случае многих церебеллярных атаксий, приводят к изменениям пространственно-временных характеристик паттерна спайковой активности и промежутков молчания [140]. Большинство данных мутаций представляют собой мутации в различных белках кальциевой сигнализации, а также мутации в кальциевых сенсорах [140], что ещё раз подтверждает важную роль внутриклеточного гомеостаза кальция для поддержания и выживания КП [29].В рамках данного исследования было проведено расширение предварительных экспериментов на срезах мозжечка мышей трансгенной линии SCA2-58Q in vitro [20, 65], представленных в настоящей работе, на модель in vivo [84]. До сих пор электрофизиологические исследования на трансгенных мышах со вставкой полиглутамина в мутантном белке были ограничены экспериментами in vitro на срезах мозжечка [16, 20, 65, 69]. В настоящей работе с помощью метода внеклеточной регистрации активности КП in vivo было проведено сравнение функциональных свойств КП интактного мозжечка ДТ и СЦА2 мышей разного возраста [84]. Было представлено и проанализировано около 170-ти записей импульсного сигнала КП мутантных мышей и мышей дикого типа. В результате анализа полученных данных было выявлено, что КП способны генерировать различные паттерны электрофизиологической активности in vivo. С целью квантификации результатов, наблюдаемые паттерны активности были разделены на четыре группы: тонические (Рис. 3.20), иррегулярно-тонические (Рис. 3.21), иррегулярные (Рис. 3.22) и пачечные (Рис. 3.23). Данная классификация была представлена на основе анализа распределения МИИ для 30-ти секундного периода записи активности в случае каждого эксперимента. В соответствии с литературными данными [40, 50, 60-63, 143], в настоящих экспериментах 80-90% КП мышей дикого типа генерировали тоническую и иррегулярно-тоническую активность в случае всех рассматриваемых возрастных групп (Рис. 3.26, 3.29). В отличие от клеток мышей дикого типа, в случае КП СЦА2 мышей наблюдалась значительная и прогрессирующая с возрастом потеря регулярности импульсного сигнала (Рис. 3.29). К годовалому возрасту в случае СЦА2 мышей только 20% КП генерировало тонический или иррегулярно-тонический импульсный сигнал, тогда как 80% КП генерировали иррегулярную и пачечную активность (Рис. 3.26, 3.29). Данные результаты соотносятся с результатами, полученными in vitro на срезах мозжечка стареющих СЦА2 мышей. Так, 76% КП срезов мозжечка, полученных из мышей дикого типа в возрасте 48 недель, генерировали тоническую активность и только 56% КП СЦА2 мышей того же возраста имели тонический импульсный сигнал in vitro (Рис. 3.2, [20, 65]).
В добавок к исследованию паттернов активности, был также представлен анализ бистабильности КП на примере иррегулярно-тонических клеток ДТ и СЦА2 мышей в возрасте 9 мес. Полученные результаты показали, что уровень бистабильности значительно выше в случае КП СЦА2 мышей по сравнению с КП ДТ мышей того же возраста. Хотя частота генерации простых спайков клетками Пуркинье в случае СЦА2 и ДТ мышей возраста 9 мес была одинакова, характеристики формы распределения МИИ (КВ МИИ, скошенность и эксцесс распределения) идентифицировали большую степень нестабильности в случае СЦА2 мышей по сравнению с ДТ мышами (Рис. 3.28). Бистабильность как неотъемлемое свойство КП может играть ключевую роль в обработке и хранении сенсомоторной информации в церебеллярном кортексе [41]. Увеличенный уровень бистабильности в случае СЦА2 мышей может вносить свой вклад в формирование менее регулярной активности КП в случае данных трансгенных мышей [145].
Также в настоящей работе было показано, что частота генерации простых спайков тонических КП in vivo уменьшается с возрастом в ДТ и СЦА2 мышах. Так, средняя частота активности КП ДТ мышей составляла 29 Гц в возрасте 6 мес. и 14 Гц в возрасте 12 мес. (Рис. 3.27). При этом было выявлено, что СЦА2 КП генерируют импульсный сигнал с такой же частотой, либо быстрее, чем ДТ КП того же возраста (Рис. 3.27). Данное наблюдение отличается от результатов, полученных методами электрофизиологии in vitro. На срезах мозжечка ДТ и СЦА2 мышей было показано, что в случае СЦА2 КП наблюдается понижение частоты генерации импульсной активности по сравнению с ДТ КП (Рис.3.3). Итак, данные, полученные методами электрофизиологии in vivo показали другую зависимость частоты генерации спайков между рассматриваемыми экспериментальными группами, что отличается от данных, полученных методами электрофизиологии in vitro на мышиных моделях СЦА2 ранее и в настоящей работе (Рис. 3.3А [16, 20, 65]). Из полученных результатов можно сделать вывод о том, что увеличение доли пачечных клеток и уменьшение тонических является наиболее вероятной причиной ухудшения моторных функций и фенотипа атаксии в стареющих мышах трансгенной линии SCA2-58Q [20, 65, 80, 114]. Причина потери точности генерации активности клетками Пуркинье СЦА2 мышей может заключаться в токсичном влиянии мутантного белка атаксин-2 и сопутствующим нарушении внутриклеточной сигнализации кальция, опосредованной рецептором инозитол-(1, 4, 5)-трифосфата [29, 30, 82]. Для будущих исследований крайне важным будет применение метода анализа электрофизиологической активности in vivo, используемого в настоящей работе, относительно других моделей атаксии с характерной экспансией полиглутамина, например, СЦА1 и СЦА3.
Помимо анализа простых спайков, в настоящей работе был также представлен анализ сложных спайков клеток Пуркинье интактного мозжечка СЦА2 мышей и мышей дикого типа. КП генерируют сложные спайки при активации оливо-мозжечковым трактом, при этом нарушения оливо-мозжечкового пути наблюдались ранее в случае мышей трансгенной линии SCA1-82Q [72]. В экспериментах, представленных в настоящей работе, наблюдалось понижение частоты генерации сложных спайков с увеличением возраста подопытных животных как в случае ДТ мышей, так и в случае СЦА2 мышей. Средняя частота генерации сложных спайков была ниже у СЦА2 мышей в возрасте 9 и 12 мес по сравнению с ДТ мышами того же возраста, однако наблюдаемая разница не достигала статистически значимого уровня в связи с огромным разбросом регистрируемых значений.