Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 17
1.1. Методы моделирования белок-белковых взаимодействий 18
1.1.1. Факторы, влияющие на взаимодействие белков. Типы моделей белок белковых взаимодействий 18
1.1.1.1. Кинетическая модель взаимодействия белков. Закон действующих масс 18
1.1.1.2. Исследование взаимодействия отдельных молекул. Роль стерических факторов 19
1.1.1.3. Роль электростатических взаимодействий макромолекул 22
1.1.1.4. Роль окружения. Учет внутренней структуры биологической клетки 25
1.1.1.5. Роль конформационной подвижности макромолекул 28
1.1.2. Моделирование движения отдельных макромолекул 29
1.1.2.1. Уравнение Ланжевена для броуновской частицы 30
1.1.2.2. Гидродинамические параметры броуновской частицы 30
1.1.2.3. Решение уравнения Ланжевена 31
1.1.2.4. Метод броуновской динамики 32
1.1.2.5. Контактные взаимодействия. Метод исключенного объема 32
1.1.2.6. Дальнодействующие электростатические взаимодействия 33 Учёт поляризации среды и наличия подвижных ионов. Уравнение Пуассона-Больцмана 34
Расчет электростатической силы 35
1.1.2.7. Начальные и граничные условия 37
1.1.2.8. Программная реализация метода броуновской динамики 38
1.1.3. Анализ результатов молекулярного моделирования 39
1.1.3.1. Критерии образования белок-белковых комплексов 39
1.1.3.2. Анализ диффузионно-столкновительного комплекса 41
1.1.3.3. Вычисление константы скорости реакции ассоциации ка 43
1.1.3.4. Моделирование процессов электронного транспорта 45
1.2. Модели белок-белковых реакций с участием мобильных белков переносчиков в фотосинтетическом электронном транспорте 46
1.2.1. Структура комплекса белков пластоцианина и цитохрома f и кинетика его образования 48
1.2.2. Моделирование взаимодействия белков пластоцианина и цитохрома f высших растений методом броуновской динамики 53
1.2.3. Моделирование электронного транспорта у зеленых водорослей и
1.2.4. Модели взаимодействия фотосистемы I с донорами и акцепторами -мобильными переносчиками электрона 58
Глава 2. Разработка методики проведения вычислительных экспериментов и анализа полученных результатов 64
2.1. Программное обеспечение многочастичной броуновской динамики
2.1.2. Гидродинамические свойства молекул 67
2.1.3. Электростатические взаимодействия макромолекул 68
2.1.4. Предварительный анализ взаимного расположения макромолекул 70
2.1.5. Оценка кинетических параметров межмолекулярных взаимодействий 71
2.2. Метод количественной оценки роли электростатических
взаимодействий в формировании диффузионно-столкновительного
2.3. Метод идентификации промежуточных метастабильных состояний белок-белковых комплексов, основанный на частоте встречаемости похожих структур 76
Глава 3. Результаты и обсуждение 78
3.1. Исследование роли электростатических взаимодействий на разных стадиях диффузионного сближения белков пластоцианина и цитохрома f 78
3.2. Количественная оценка роли электростатических взаимодействий во взаимной ориентации молекул белков при их контакте в результате диффузионного сближения 86
3.3. Идентификация промежуточных состояний белок-белковых комплексов пластоцианина и цитохрома f в процессе диффузионного сближения 98
Заключение 109
Выводы 116
Список литературы
- Факторы, влияющие на взаимодействие белков. Типы моделей белок белковых взаимодействий
- Анализ результатов молекулярного моделирования
- Электростатические взаимодействия макромолекул
- Количественная оценка роли электростатических взаимодействий во взаимной ориентации молекул белков при их контакте в результате диффузионного сближения
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Специфические взаимодействия между белковыми молекулами играют ключевую роль во многих биологических процессах. Одни из наиболее быстрых белок-белковых реакций в клетке – реакции мобильных белков – переносчиков электрона с их окислительно-восстановительными партнёрами. Высокая эффективность работы электрон-транспортной цепи достигается за счёт высокой скорости переноса электронов между крупными малоподвижными белковыми комплексами, осуществляемого мобильными переносчиками.
Считается, что основным фактором, ускоряющим белок-белковые реакции, являются электростатические взаимодействия между электрическими зарядами на поверхности белка, однако в настоящее время нет единой общепринятой концепции, всесторонне трактующей роль электростатических взаимодействий в ускорении белок-белковых реакций. Можно предположить, что быстрота протекания этих реакций достигается за счёт кооперативного действия целого ряда механизмов. Одним из эффективных методов изучения динамики реакций является имитационное компьютерное моделирование. Получение большого числа достаточно «длинных» траекторий движения взаимодействующих молекул позволяет детально проанализировать события, происходящие при образовании белок-белкового комплекса, и установить физические механизмы процессов специфического «узнавания» макромолекулами своих реакционных партнёров. Выяснения роли электростатических взаимодействий на разных стадиях формирования функционально активного комплекса станет важным шагом на пути к направленному конструированию биомакромолекул с заданными функциональными свойствами для нужд биотехнологии и биомедицины.
Степень разработанности темы исследования. Исследованию роли электростатических взаимодействий в формировании белок-белковых комплексов вообще и комплекса белков пластоцианина и цитохрома f в частности посвящено большое число экспериментальных и теоретических работ. Не вызывает сомнения, что высокая скорость переноса электрона между этими белками связана с электростатическими взаимодействиями макромолекул, однако конкретный механизм ускорения остаётся под вопросом, так как ни одна из предложенных моделей не может объяснить весь массив экспериментальных данных. Экспериментально пока не удаётся идентифицировать промежуточные стадии процесса образования комплекса этих белков. В связи с этим большое значение приобретают имитационные молекулярные модели, которые дополняют возможности экспериментальных методов исследования, позволяя пронаблюдать процесс образования белок-белкового комплекса в динамике. Полноатомные молекулярно-динамические модели предъявляют чрезвычайно высокие требования к вычислительным ресурсам, поэтому в настоящее время с их помощью удаётся промоделировать только отдельные стадии процесса ассоциации белков. Более простые модели, которые воспроизводят движение макромолекул с учётом электростатических взаимодействий, но без учёта конформационной подвижности (метод броуновской динамики). Получаемые с помощью этого метода оценки константы скорости реакции находятся в хорошем согласии с экспериментальными данными. Основное внимание в большинстве выполненных с применением метода броуновской динамики работах уделялось определению интегрального параметра белок-белковых взаимодействий – скорости образования функционально активных комплексов, а также идентификации сайтов связывания молекул друг с другом. Использование в настоящей работе этого метода в сочетании с современными методами статистического анализа позволит выявить качественно различающиеся по роли электростатических взаимодействий стадии образования белок-белковых комплексов.
Цели и задачи работы. Целью данной работы является исследование роли электростатических взаимодействий между молекулами фотосинтетических электрон-транспортных белков пластоцианина и цитохрома f в формировании специфического белок-белкового комплекса при их диффузионном сближении. В работе поставлены следующие задачи:
-
Получить количественные характеристики электростатических взаимодействий между белками пластоцианином и цитохромом f в зависимости от расстояния между их реакционными центрами и оценить влияние этих взаимодействий на среднее время сближения реакционных центров до заданных расстояний.
-
Получить количественные характеристики влияния электростатических сил на взаимную ориентацию молекул белков пластоцианина и цитохрома f при контакте молекулярных поверхностей белков.
-
Идентифицировать и охарактеризовать энергетически выгодные метастабильные состояния комплекса белков пластоцианина и цитохрома f.
-
Выявить и охарактеризовать качественно различные по отношению к роли электростатических взаимодействий стадии диффузионного сближения белков пластоцианина и цитохрома f и описать сценарий формирования функционально активного комплекса этих белков.
Методология и методы исследования. Взаимодействие макромолекул в работе исследуется с помощью имитационной модели, основанной на методе броуновской динамики. Макромолекулы белков рассматриваются как твёрдые тела, движущиеся в непрерывной вязкой среде. Тепловое движение молекул растворителя учитывается в виде случайной силы, действующей на макромолекулы. Для расчёта электростатических взаимодействий между макромолекулами используется уравнение Пуассона-Больцмана, учитывающее неоднородность диэлектрических свойств среды и наличие в ней мобильных ионов. В рамках работы описанная модель реализована в виде компьютерной программы ProKSim. Программа написана на языке C++ и позволяет
рассчитывать траектории движения макромолекул и проводить их предварительный анализ. Вычислительные эксперименты по взаимодействию молекул пластоцианина и цитохрома f проводятся в двух вариантах: с учётом электростатических взаимодействий между макромолекулами и без их учёта. Сравнение полученных в этих экспериментах выборок взаимных ориентаций молекул позволяет качественно и количественно оценить роль электростатических сил на разных стадиях сближения макромолекул. Анализ частоты встречаемости похожих друг на друга взаимных ориентаций позволяет разбить ансамбль на отдельные кластеры, соответствующие энергетически выгодным метастабильным состояниям комплекса белков.
Положения, выносимые на защиту. С помощью метода броуновской динамики исследована роль дальнодействующих электростатических взаимодействий на разных стадиях формирования электрон-транспортного комплекса белков пластоцианина и цитохрома f. При расстоянии между реакционными центрами этих белков больше 3–3,5 нм электростатические взаимодействия препятствуют неспецифическому слипанию этих белков, направляя движение отрицательно заряженной молекулы пластоцианина к положительно заряженной области поверхности цитохрома f. Приближение пластоцианина к этой области приводит к ограничению его поступательной подвижности, так как энергия электростатического притяжения молекул друг к другу оказывается близкой к энергии их теплового движения. При этом сохраняется возможность вращения молекулы пластоцианина вокруг её центра масс, что обеспечивает нахождение такой взаимной ориентации макромолекул, в которой за счёт комплементарности электрически заряженных областей электростатические взаимодействия значительно усиливаются и приводят к тесному сближению молекул и контакту их поверхностей. Обнаружено и охарактеризовано два варианта взаимных ориентаций пластоцианина и цитохрома f, в которых происходит такое сближение. Один из них идентифицирован как промежуточный комплекс, возникающий в процессе
формирования функционально активной электрон-транспортной конфигурации, а второй – как непродуктивный комплекс.
Научная новизна работы. В работе предложены методические подходы, позволяющие охарактеризовать роль электростатических взаимодействий в процессе образования функционально активного белок-белкового комплекса. Впервые были выявлены и охарактеризованы качественно различающиеся по роли электростатических взаимодействий стадии процесса сближения белков пластоцианина и цитохрома f при образовании электрон-транспортного комплекса. С помощью метода кластерного анализа идентифицированы промежуточные метастабильные состояния, возникающие при взаимодействии этих белков. Показано, что в непродуктивном комплексе электростатическое притяжение ограничивает подвижность белков, препятствуя их вращению вокруг области контакта и сближению реакционных центров молекул. В продуктивном предварительном комплексе сильные электростатические взаимодействия не препятствуют вращению пластоцианина вокруг области контакта с цитохромом f и сближению реакционных центров белков.
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая и практическая значимость работы заключается в разработке методов, позволяющих с помощью молекулярного моделирования охарактеризовать роль электростатических взаимодействий в процессе образования функционально активного белок-белкового комплекса. Результаты исследования позволяют выявить физические факторы, обеспечивающие быстрое и эффективное формирование специфического функционально активного комплекса. Предложенные в работе методы и подходы реализованы в виде свободно распространяемого программного комплекса для моделирования методом многочастичной броуновской динамики ProKSim (Protein Kinetics Simulator) и могут быть использованы для изучения взаимодействия белков различной природы.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность приведенных результатов подтверждается корректной статистической обработкой полученных в вычислительных экспериментах данных и их согласованностью с литературными источниками. По материалам диссертации опубликовано 45 работ, из них 6 – в журналах, рекомендованных ВАК для соискателей ученых степеней, 5 – в сборниках статей и научных трудов конференций и 34 – в сборниках тезисов докладов международных конференций. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на: IV и V Съездах биофизиков России, Нижний Новгород, 2013, Ростов-на-Дону, 2015; Международной школе «Вычислительное и теоретическое моделирование биологических взаимодействий», Дубна, 2013; V Международной конференции «Математическая биология и биоинформатика» (ICMBB14), Пущино, 2014; Международных конференциях серии «Математика. Компьютер. Образование», Дубна, 2014, Пущино, 2013, 2015; Международной научно-методической конференции "Современные проблемы биофизики сложных систем. Информационно-образовательные процессы", Воронеж, 2013; Молодежной научно-практической конференции «Биофизика биоэнергетических процессов», Звенигородская биостанция им. С.Н. Скадовского МГУ им. М.В. Ломоносова, 2013; семинарах кафедры биофизики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.
Структура и объем работы. Диссертационная работа включает 145 страниц машинописного текста, 1 таблицу, 35 рисунков, и содержит «Список сокращений», «Введение», три главы («Обзор литературы», «Разработка методики проведения вычислительных экспериментов и анализа полученных результатов» и «Результаты и обсуждение»), «Заключение», «Выводы», «Список литературы» и два приложения («Пример конфигурационного файла программы ProKSim» и «Основанный на частоте встречаемости схожих объектов метод иерархического кластерного анализа»). Список цитированной литературы включает 240 источников.
Факторы, влияющие на взаимодействие белков. Типы моделей белок белковых взаимодействий
Исследованию роли электростатических взаимодействий в формировании белок-белковых комплексов посвящено чрезвычайно большое число экспериментальных и теоретических работ. Общий обзор современных представлений можно найти, например, в [Janin, 2000; Janin, 2013; Schreiber, 2009]. Непосредственное наблюдение кинетики белок-белковых реакций представляет значительные сложности, так как большинство реакций между белками не сопровождается какими либо легко детектируемыми изменениями их физико-химических свойств. В этом смысле электрон-транспортные белки представляют собой удобный объект для исследований, так как в результате окислительно-восстановительной реакции изменяются колебательные свойства реакционных центров белков. Благодаря этому кинетика реакции между такими белками может быть зарегистрирована с помощью таких биофизических методов, как оптическая абсорбционная спектрометрия в видимой и инфракрасной области и спектрометрия электронного парамагнитного резонанса. При проведении реакции между выделенными белками в растворе используются методы остановленного потока и импульсного фотолиза, позволяющие весьма точно определять скорость чрезвычайно быстрых реакций [Варфоломеев, 1999]. Накоплен большой объём данных по кинетике взаимодействия мобильных переносчиков электрона – цитохрома c, пластоцианина и ферредоксина – с их физиологическими реакционными партнёрами. Пара белков пластоцианин и цитохром f часто используется как стандартная модельная система для изучения свойств короткоживущих белок-белковых комплексов. Для нескольких видов фотосинтезирующих организмов исследована зависимость скорости реакции между пластоцианином и цитохромом f от pH и ионной силы раствора [Crowley, 2004; Kannt, 1996; Meyer, 1993; Niwa, 1980]. Не вызывает сомнения, что высокая скорость переноса электрона между этими белками связана с электростатическими взаимодействиями макромолекул, однако конкретный механизм ускорения остаётся под вопросом, так как ни одна из предложенных моделей не может объяснить весь массив экспериментальных данных. Это может быть связано с тем, что процесс образования комплекса белков пластоцианина и цитохрома f включает несколько стадий, однако промежуточные переходные состояния идентифицированы не были.
Строение белков пластоцианина и цитохрома f и их свойства хорошо изучены [Freeman, 2006; Gray, 1992; Gross, 1996; Prince, 1995]. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) позволила установить взаимное расположение молекул пластоцианина и цитохрома f в комплексе [Albarran, 2007; Crowley, 2001; Crowley, 2004; Cruz-Gallardo, 2012; Lange, 2005; Ubbink, 1998]. Диапазон возможных взаимных ориентаций молекул пластоцианина и цитохрома f высших растений, определённый по данным ЯМР, весьма невелик. Предполагается, что этот комплекс соответствует функционально активному состоянию, в котором происходит перенос электрона между молекулами. Промежуточных состояний, которые были предсказаны на основе анализа кинетических данных, в этих экспериментах обнаружить не удалось. Однако при перекрестном сшивании белков с помощью химических агентов [Morand, 1989; Qin, 1993] были получены ковалентно связанные комплексы, в которых электронный транспорт не происходит. Одним из возможных объяснений этого является то, что ковалентное сшивание молекул происходит в конфигурации, соответствующей неактивному промежуточному состоянию, однако точную структуру этого комплекса установить не удалось.
Сопоставление данных о структуре белков и их комплекса с данными по кинетике белок-белковых взаимодействий для дикого типа и ряда мутантных форм позволило определить значимость отдельных аминокислотных остатков для обеспечения быстрой ассоциации этих белков и быстрого переноса электрона между их реакционными центрами [Gong, 2000b; Gong, 2000a; He, 1991; Illerhaus, 2000; Kannt, 1996; Modi, 1992]. Показано, что наиболее сильное влияние на скорость реакции между пластоцианином и цитохромом f оказывают мутации, изменяющие распределение зарядов вблизи реакционных центров этих белков. Идентифицирована область положительного заряда вблизи гема в цитохроме f и две области отрицательного заряда на поверхности пластоцианина. Кроме того, на поверхности этих белков имеются области экспонирования гидрофобных аминокислотных остатков. Мутации в электрически заряженных областях приводят к значительному изменению скорости переноса электрона между белками, что подтверждает важность электростатических взаимодействий между молекулами для быстрого протекания этой реакции.
Ключевую роль в понимании механизмов белок-белковых взаимодействий играют теоретические исследования. Значительное число работ посвящено анализу электрических полей, окружающих макромолекулы [Сивожелезов, 1998; Durell, 1990; Kuki, 2010; Kumar, 2002; Nakamura, 1996; Neves-Petersen, 2003; Pearson Jr., 1996; Sheinerman, 2000; Sinha, 2002; Zhang, 2011]. Исследование эволюционной изменчивости белков показало, что распределение электрического потенциала вблизи поверхности белка может быть более консервативно, чем собственно структура белка. Это позволило выдвинуть гипотезу, что в качестве уникальных маркёров, определяющих взаимное «узнавание» реакционными партнёрами друг друга, выступают не отдельные точечные заряды на поверхности белка, а протяжённые области положительного и отрицательного потенциала, окружающие макромолекулу [Сивожелезов, 2010]. Для фотосинтетических электрон-транспортных белков показано, что наблюдаемое в филогенетическом ряду значительное изменение распределения электрических зарядов на одном белке не приводит к нарушению «узнавания» белками друг друга, так как сопровождается соответствующими изменениями его реакционного партнёра [la Rosa De, 2002; Navarro, 1997].
С помощью экспериментальных методов исследования была получена информация о белках пластоцианине и цитохроме f в свободном состоянии и в функционально активном комплексе, однако эти методы не позволяют исследовать процесс образования этого комплекса. Для наблюдения процессов образования белок-белковых комплексов в динамике используются имитационные молекулярные модели разной степени подробности. Представляется перспективным применение полноатомных молекулярно-динамических моделей, однако такие модели предъявляют чрезвычайно высокие требования к вычислительным ресурсам, поэтому в настоящее время с их помощью удаётся промоделировать только отдельные стадии процесса ассоциации белков [Abriata, 2015; Ahmad, 2011; Tuffery, 2012]. Несколькими группами исследований были разработаны более простые модели, которые воспроизводят движение макромолекул с учётом их электростатических взаимодействий, но без учёта конформационной подвижности (метод броуновской динамики) [Ermak, 1978; Gabdoulline, 1998; Northrup, 1990]. Хотя эти модели учитывают только некоторые факторы, существенные для взаимодействия макромолекул, полученные в вычислительных экспериментах зависимости константы скорости реакции между пластоцианином и цитохромом f от параметров среды (pH, ионная сила) и распределения электрических зарядов на поверхности белка (точечные мутации – замены отдельных заряженных аминокислотных остатков) [Коваленко, 2007; Коваленко, 2008; Kovalenko, 2006; Pearson Jr., 1998; Rienzo De, 2001] находятся в хорошем согласии с экспериментальными данными, что свидетельствует об адекватности такого подхода для моделирования взаимодействия белков.
Модели броуновской динамики были использованы для воспроизведения белок-белковых реакций с учётом сложного интерьера внутриклеточных компартментов. Было показано, что геометрические ограничения диффузии и неоднородное распределение малоподвижных трансмембранных белковых комплексов приводят к появлению сложной многофазной кинетики взаимодействия мобильных белков – переносчиков электрона с этими комплексами [Князева, 2010a]. Эти результаты хорошо соотносятся с многофазной кинетикой окисления цитохрома f и восстановления фотосистемы I в экспериментах на субхлоропластных частицах. С помощью броуновских моделей исследована зависимость скорости пристыковки мобильных белков-переносчиков к трансмембранным белковым комплексам от изменения поверхностного заряда на мембране [Князева, 2010b] и переключение потока электронов от фотосистемы I между различными акцепторами при изменении pH [Дьяконова, 2016].
Анализ результатов молекулярного моделирования
Также с помощью направленного мутагенеза была исследована роль отдельных аминокислотных оостатков цитохрома f на скорость связывания с пластоцианином и скорость электронного транспорта в комплексе. Показано, что замена положительно заряженных остатков лизина K58, K65 и K187 цитохрома f на нейтральные или отрицательно заряженные приводит к значительному уменьшению константы скорости связывания цитохрома f с пластоцианином. К меньшему связыванию с пластоцианином приводит и замена расположенного поблизости от гема остатка тирозина Y60 на серин. Мутации Y1F и Q7N лишь незначительно влияют на связывание цитохрома f с пластоцианином и перенос электрона между белками, а мутант F4Y характеризуется несколько большей скоростью связывания и электронного транспорта, чем дикий тип [Gong, 2000b; Gong, 2000a].
Таким образом, полученные с помощью различных экспериментальных методов данные свидетельствуют о том, что у большинства организмов электростатические взаимодействия между белками пластоцианом и цитохромом f существенно влияют на скорость электронного транспорта между этими белками. Большинство экспериментов проведено с растворимой формой цитохрома f в условиях in vitro. В работах [Soriano, 1996; Soriano, 1998] кинетика этих реакций в растворе сопоставляется с кинетикой окисления цитохрома f зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii в условиях in vivo. Исследовано несколько мутатных форм цитохрома f: двойной мутант K188N-K189Q, тройной мутант K58Q-K65S-K66E и форма со всеми пятью мутациями K58Q-K65S-K66E-K188N-K189Q. Для всех этих мутантных форм отмечено более медленное окисления цитохрома f после короткой световой вспышки, приводящей к окислению пластоцианина фотосистемой I, однако это замедление сравнительно невелико и не превышает 1,25 раза по сравнению с диким типом. На основе полученных данных авторы рассмотренных статей предполагают, что электростатические взаимодействия по разному участвуют во взаимодействии пластоцианина с растворимой формой цитохрома f и со встроенным в мембрану цитохромным b6f комплексом.
В экспериментах по перекрестному сшиванию пластоцианина с растворимой формой цитохрома f с помощью карбодиимида (EDC) показано, что сшивание происходит в области полярных участков пластоцианина и цитохрома f: остаток аспарагиновой кислоты D44 пластоцианина образует связь с остатком лизина K187 цитохрома f, вторая связь образуется между остатком глутаминовой кислоты E60 пластоцианина и неидентифицированным аминокислотным остатком цитохрома f [Morand, 1989]. При этом в образующихся ковалентно связанных комплексах перенос электрона между гемом цитохрома f и медью пластоцианина невозможен [Qin, 1993]. На основании этих фактов было сделано предположение о том, что, по крайней мере у высших растений, процесс образования электрон-транспортного комплекса пластоцианина и цитохрома f проходит в два этапа [Lange, 2005; Ubbink, 1998]. Сначала происходит сближение белков в диффузионном режиме под действием дальнодействующих электростатических сил, при этом электростатические взаимодействия формируют своего рода «воронку», направляющую диффузию пластоцианина. После того, как взаимодействие комплементарных электрически заряженных участков двух белков приведет к диффузионному захвату (то есть такому состоянию, когда междумолекулярные взаимодействия препятствуют отдалению белков друг от друга, но не препятствуют их вращательному движению относительно друг друга), происходит вытеснение молекул воды из белок-белкового интерфейса, и гидрофобные участки двух белков приходят в непосредственный контакт. Именно в этом состоянии происходит перенос электрона между активными центрами двух молекул. В состоянии диффузионного захвата белки находятся достаточно далеко друг от друга и сохраняют значительную подвижность, поэтому это состояние не может быть исследовано экспериментальными методами (такими как ЯМР). Предполагается, что стадией, лимитирующей скорость формирования функционально активного комплекса, является диффузионное сближение молекул, а последующая перестройка диффузионно-столкновительного комплекса в финальный практически не влияет на ее скорость.
Показано, что у таких организмов, как цианобактерии Phormidium laminosum [Crowley, 2001; Hart, 2003; Schlarb-Ridley, 2002] и Prochlorothrix hollandica [Hulsker, 2008], электростатические взаимодействия мобильных переносчиков электрона (пластоцианина и цитохрома c6) с цитохромным комплексом значительно слабее, чем у высших растений. Это связано с тем, что у пластоцианина этих цианобактерий отрицательно заряженная область практически отсутствует, так как соответствующие аминокислоты заменены на незаряженные, либо их вообще нет. В результате отличается и структура комплексов – если у высших растений область контакта включает как гидрофобные, так и заряженные участки (боковая ориентация side-on ), то у цианобактерий она существенно меньше и включает только гидрофобный участок, прилегающий к атому меди (фронтальная ориентация head-on ) [Daz-Moreno, 2005a]. Равновесие реакции ассоциации у цианобактерий существенно более сдвинуто в сторону свободных белков, чем в случае белков из высших растений, однако наблюдаемая скорость реакции электронного транспорта между этими белками в физиологических условиях сравнима с таковой у высших растений. Предполагается, что это связано с различными механизмами образования финального комплекса: у цианобактерий основную роль играет не электростатический диффузионный захват молекулы пластоцианина, а сильные диполь-дипольные взаимодействия, помогающие правильной его ориентации относительно цитохромного комплекса при тесном сближении молекул. Благодаря этому получается, что реакция и в этом случае имеет диффузионно-контролируемый характер, однако ее скорость значительно меньше зависит от ионной силы раствора.
В работах [Albarran, 2007; Daz-Moreno, 2005b] исследовалось взаимодействие белков пластоцианина и цитохрома f у цианобактерии Nostoc sp. PCC 7119 (ранее известной как Anabaena variabilis). Показано, что структура комплекса этих белков занимает промежуточное положение между структурой комплекса высших растений (боковая ориентация) цианобактерий Phormidium laminosum и Prochlorothrix hollandica (фронтальная ориентация). В формировании комплекса значительную роль играют электростатические взаимодействия, но расположение электрических зарядов инвертировано по сравнению с высшими растениями: положительно заряженная область находится на пластоцианине (аминокислотные остатки K11, K35, K51, K57, K62 и R93), а отрицательно заряженные – на цитохроме f (D64, D100, E108, E165, E189 и D190). В комплексе в непосредственном контакте находятся аминокислотные остатки K57 и K62 пластоцианина и, соответственно, E189 и D64 цитохрома f. Кинетические и термодинамические параметры взаимодействия белков близки к таковым у высших растений.Q
Электростатические взаимодействия макромолекул
В данной работе под диффузионно-столкновительным комплексом понимается ансамбль взаимных ориентаций контактирующих молекул. Движение макромолекул в используемой модели броуновской динамики определяется хаотическим тепловым движением и электростатическими взаимодействиями между молекулами. При отсутствии электростатических взаимодействий диффузионно-столкновительный комплекс представляет собой непрерывный ряд переходящих друг в друга случайных ориентаций, локальная плотность этого ансамбля определяется формой молекул. Электростатические взаимодействия между макромолекулами приводят к перераспределению плотности ансамбля, увеличивая частоту встречаемости энергетически выгодных взаимных ориентаций молекул. Однако вызванные электростатическими взаимодействиями изменения в «устройстве» этого ансамбля не сводятся к повышению доли более выгодных в энергетическом плане взаимных ориентаций макромолекул по сравнению с менее выгодными, так как происходит и изменение соотношения различных ориентаций с одинаковой энергией. Для того, чтобы оценить, насколько сильно изменяются взаимные ориентации молекул, необходимо проанализировать геометрические параметры полученной в вычислительном эксперименте выборки конфигураций и сравнить их с «эталонными» выборками. Так как мы хотим получить самую грубую оценку роли электростатических взаимодействий, выражающуюся одним числом, предположим, что интересуюший нас ансамбль конфигураций может быть представлен как суперпозиция двух ансамблей, в одном из которых роль электростатических взаимодействий может быть принята за единицу («электростатический ансамбль»), а в другом - за ноль («тепловой ансамбль»). Случайная конфигурация из анализируемого ансамбля с вероятностью w3JI окажется конфигурацией из «электростатического» ансамбля и с вероятностью 1 — w3Jl - из «теплового».
Для получение в вычислительном эксперименте достаточно качественной выборки из «теплового» ансамбля» необходимо отключить учёт электростатических взаимодействий между макромолекулами в конфигурационном файле программы ProKSim (см. Приложение 1). Более сложной задачей является получение выборки, определяемой только электростатическими взаимодействиями. В отсутствие теплового движения ансамбль конфигураций представлен дискретным набором энергетически выгодных структур, соответствующих локальным энергетическим минимумам, соотношение долей различных структур в ансамбле определяется энергетическим ландшафтом. Детальное исследование энергетического ландшафта представляет нетривиальную и в общем случае не решённую проблему, однако для получения эталонной выборки, позволяющий оценить величину w3JI, нет необходимости в таком детальном анализе.
План эксперимента для получения исследуемой и эталонных выборок включает проведение двух типов вычислительных экспериментов, в которых сближение молекул моделируется с помощью метода броуновской динамики. В одном случае при расчёте сил, действующих на макромолекулу, учитываются и тепловое движение, и электростатические взаимодействия с реакционным партнёром (будем называть это экспериментами типа 1), в другом - движение рассматривается без учёта электростатических взаимодействий (тип 2). В проводимых экспериментах производится отбор структур для последующего анализа. Отбираются либо те конфигурации, в которых макромолекулы сближены на расстояние, меньшее порогового (критерий типа а), либо те конфигурации, для которых энергия электростатического притяжение макромолекул превышает пороговое значение (то есть энергия электростатического взаимодействия отрицательна и ниже отрицательного же порогового значения, критерий типа б). Для анализа необходимо провести большое число вычислительных экспериментов и получить три выборки взаимных расположений молекул: 1 а - моделирование с учётом электростатических взаимодействий, отбор по расстоянию
между молекулами (исследуемуя выборка), 1б - моделирование с учётом электростатических взаимодействий, отбор по энергии
электростатического взаимодействия (вклад электростатических взаимодействий 100%), 2а - моделирование без учёта электростатических взаимодействий, отбор по расстоянию
между молекулами (вклад электростатических взаимодействий - 0%). При получении эталонной выборки, соответствующей 100%-ному вкладу электростатических взаимодействий (1б) мы руководствуемся двумя соображениями. Первое заключается в том, что энергетически невыгодные взаимные ориентации молекул в чисто электростатическом ансамбле встечаются реже, чем в чисто случайном (так как энергетически выгодные ориентации встречаются чаще). Выбирая пороговое значение для отбора энергетически выгодных конфигураций, мы полагаем, что конфигурации с более высокой энергией (то есть менее энергетически выгодные) встречаются в электростатическом ансамбле настолько редко, что ими можно пренебречь. Второе соображение заключается в том, что небольшие «неровности» энергетического ландшафта в почти плоской области, соответствующей практически полному отсутствию взаимодействий, приводят к появлению чрезвычайно большого числа слабо выраженных локальных минимумов энергии электростатического взаимодействия, хаотически заполняющих пространство взаимных ориентаций молекул. По сути распределение структур по этим минимумам является случайным, и мы не должны рассматривать это распределение как обусловленное электростатическими взаимодействиями. Аналогично, в том случае, если электрические заряды расположены на поверхности белка практически равномерно, то даже сильные электростатические взаимодействия между ними фактически не будут оказывать существенного влияния на взаимную ориентацию макромолекул при контакте. Подходящим для большинства случаев представляется выбор порогового значения энергии электростатических взаимодействий порядка величины –кТ. Выбор порогового значения является правильным в том случае, если полученные выборки энергетически выгодных и случайных ориентаций значительно различаются. Если при любом пороговом значении выборки очень похожи друг на друга, это очевидно означает, что роль электростатических взаимодействий в рассматриваемом случае пренебрежимо мала.
В качестве универсальной меры расстояния между структурами в конфигурационном пространстве традиционно используется минимальное среднеквадратичное отклонение положений атомов при наилучшем выравнивании (RMSD, [Kabsch, 1976]). Анализируя попарные расстояния между структурами, можно идентифицировать «плотные» области, соответствующие стабильным и метастабильным конфигурациям (см. раздел 2.2). В качестве характерного «отпечатка», характеризующего ансамбль структур в целом, может быть выбрано распределение структур по значению RMSD по сравнению с выбранной эталонной структурой, либо всё множество попарных расстояний (RMSD) между структурами в ансамбле. В данной работе был использован первый подход. В качестве эталонной структуры использовалась типичная структура выборки 1а, то есть та конфигурация, среднее расстояние от которой до остальных структур в этой выборке минимально. Для трёх выборок структур (1а, 1б и 2а) рассчитывали среднеквадратичные отклонения положений -углеродных атомов белков при наилучшем выравнивании г между каждой структурой и эталонной структурой. По этим расстояниям были построены выборочные функции (гистограммы) распределения для каждого ансамбля /1а, /1б и/2а в диапазоне от 0 до 4 нм с шагом 0,1 нм
Количественная оценка роли электростатических взаимодействий во взаимной ориентации молекул белков при их контакте в результате диффузионного сближения
Энергия электростатического притяжения между молекулами пластоцианина и цитохрома f в функционально активном комплексе ( 13kT) в несколько раз превышает энергию теплового движения. Благодаря этому белки могут сравнительно долго находиться в связанном состоянии, что обеспечивает возможность протекания окислительно-восстановительной реакции между их реакционными центрами. Увеличение энергии притяжения белков друг к другу приводит к постепенному снижению относительной подвижности макромолекул. Для того, чтобы детально охарактеризовать отдельные стадии формирования белок-белкового комплекса пластоцианина и цитохрома f, был проведён структурный анализ ансамблей энергетически выгодных взаимных ориентаций макромолекул, возникающие при их диффузионном сближении. При исследовании ставилась задача идентификации качественно различных состояний, характеризующих этот процесс. Под состоянием в данном случае понимается набор таких взаимных ориентаций молекул, которые эволюционируют друг в друга с существенно большей вероятностью, чем в какую-либо ориентацию, принадлежащую другому состоянию. Определяемые таким образом состояния могут быть иерархически «вложены» друг в друга. При рассмотрении ансамбля отобранных при молекулярном моделировании взаимных ориентаций макромолекул состояние представляется как «плотная», то есть содержащая большое количество похожих друг на друга структур, группа, отделённая от других плотных групп разреженными областями. Для поиска таких групп представляется естественным использовать тот или иной метод кластерного анализа. Для классификации состояний был выбран метод, предложенный [Ankerst, 1999; Elke, 2006; Sander, 2003]. Этот метод был адаптирован для обработки результатов молекулярного моделирования (см. раздел 2.2 и Приложение 2).
Показано, что при начальном сближении макромолекул за счёт энергетической воронки молекула пластоцианина оказывается вблизи от положительно заряженной области цитохрома f (аминокислоты K58, K65, K66, R184, K185, K187 и R209). Когда энергия электростатического притяжения макромолекул приблизительно равна энергии их теплового движения, электростатические взаимодействия ограничивают поступательные степени свободы молекулы пластоцианина, препятствуя её уходу от положительно заряженной области цитохрома f, но её ориентация (в смысле вращения вокруг собственного центра масс) может быть практически любой. Вне зависимости от ориентации молекулы пластоцианина, большой суммарный отрицательный заряд молекулы приводит к её удержанию в этой области. При этом молекула пластоцианина может практически свободно вращаться вокруг своего центра масс за счет теплового движения (ансамбль а.1). Это состояние может быть охарактеризовано как диффузионный захват молекулы пластоцианина электростатическим полем цитохрома f. Вращение молекулы пластоцианина вокруг её центра масс позволяет перебрать множество различных ориентаций пластоцианина относительно цитохрома f и «отыскать» среди них наиболее энергетически выгодные, в которых происходит сближение противоположно заряженных областей двух белков.
Идентифицировано два пути стабилизации комплекса пластоцианина с цитохромом f. В первом варианте образуется только одна область контакта: отрицательно заряженная петля D42E43D44E45 пластоцианина располагается в центре положительно заряженной области цитохрома f, контактируя как с аминокислотными остатками K58, K65 и K66, так и с петлей R184K185E186K187 (ансамбль б.1). Взаимодействие этих областей формирует гибкий шарнир, который прочно связывает две молекулы, но не препятствует их вращению вокруг области сочленения и сближению реакционных центров. Этот ансамбль включает в себя большое разнообразие взаимных ориентаций макромолекул, некоторые из которых близки к конфигурации функционально активного комплекса. Поэтому ансамбль таких ориентаций был идентифицирован как «предварительный» комплекс, образующийся в ходе формирования функционально активного состояния. Существование такого электростатически обусловленного энергетически выгодного промежуточного состояния было постулировано ранее [Ubbink, 1998], однако детали его строения были неизвестны.
Хотя электростатическое притяжение между пластоцианином и цитохромом f во взаимной ориентации, идентифицированной по по данным ядерного магнитного резонанса (PDB ID: 2PCF [Ubbink, 1998]), весьма значительно ( 13kT), при моделировании методом броуновской динамики появление таких взаимных расположений макромолекул оказывается весьма редким событием. Это даёт основание предположить, что стабилизация функционально активного комплекса связана с действием тех факторов, которые не учитываются в модели броуновской динамики. Одним из таких факторов является присутствие в непосредственной близости от реакционных центров пластоцианина и цитохрома f целого ряда гидрофобных аминокислотных остатков, сближение которых может способствовать стабилизации функционально активного комплекса этих молекул. Показано, что в предварительном комплексе может происходить сближение гидрофобных областей, окружающих реакционные центры пластоцианина и цитохрома f. Мы полагаем, что соседство заряженных и гидрофобных областей является важным фактором, обеспечивающим быстрое формирование функционально активного комплекса: электростатические взаимодействия способствуют ускорению нахождения белками стерически правильной взаимной ориентации, а гидрофобные взаимодействия препятствуют разрушению этой ориентации тепловым движением.
Кроме того, сближение реакционных центров может сопровождаться конформационными изменениями белковых молекул, которые также не могут быть учтены в модели броуновской динамики. Корректный учёт этих факторов возможен при использовании полноатомных молекулярно-механических моделей с явным учётом молекул растворителя (см. раздел 1.1.1.5), однако вычислительные ресурсы, необходимые для моделирования всех стадий сближения макромолекул и образования функционально активного методом молекулярной динамики, в настоящее время недоступны. Для того, чтобы провести реконструкцию процесса формирования функционально активного белок-белкового комплекса – начиная от свободных белков и заканчивая функционально активной электрон-транспортной конфигурацией – целесообразно использовать комбинированные иерархические модели, в которых для каждого уровня взаимодействия используется наиболее подходящий метод моделирования. Разработка таких комбинированных моделей взаимодействия белков в настоящее время ведётся нашей научной группой, и предложенные в настоящей работе подходы к анализу промежуточных состояний будут использованы в этих моделях.