Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 11
Клетки харовых водорослей — классический объект мембранной биологии 11
Неоднородное светозависимое распределение рн и фотосинтетической активности вдоль Клетки Chara 13
Первичные процессы в ответной реакции растительных клеток на механический стресс 19
Круговое движение цитоплазмы 23
Глава II. Материалы и методы 32
Объект и среда 32
Экспериментальная установка 32
Микроэлектродные измерения рн 34
Измерения флуоресценции хлоропластов с помощью метода насыщающих световых импульсов 35
Механическая стимуляция клеток 37
Измерение мембранного потенциала 38
Локальная фотостимуляция клетки 38
Удаление хлоропластов 40
Электрическая стимуляция клеток 40
Применение ингибиторов и мембраноактивных агентов 40
Анализ экспериментальных данных и статистическая обработка результатов 41
ГЛАВА III.Результаты и интерпретация 42
Роль ионных механизмов и латерального транспорта в ответе растительной клетки на механический стресс 42
1. Образование щелочной зоны на поверхности клетки при микроперфорации 42
1.1. Изменения рН апопласта в месте укола клеточной стенки 42
1.2. Пространственное распределение рНо возле места укола КС 46
1.3. Изменения рН на поверхности клетки при повреждении тонопласта 48
1.4. Отток Н+ из вакуоли в цитоплазму в области перфорации 50
2. Основные компоненты клеточного ответа – сдвигов рНо – на механический стресс 52
2.1. Влияние осмотического давления среды 53
2.2. Участие Са2+ 55
2.3. Участие цитоскелета 58
3. Роль хлоропластов в ответной реакции на микроповреждение клеточной стенки 63
3.1. Зависимость щелочного сдвига рН апопласта при механостимуляции от условий освещения 63
3.2. Влияние диурона на сдвиги рНо при микроперфорации 64
3.3. Измерения рН при микроперфорации участков клетки с удаленными хлоропластами 65
4. Различия механизмов образования щелочных зон в апопласте при действии света и микроперфорации 67
Дальние взаимодействия хлоропластов, опосредованные латеральным транспортом молекул с потоком цитоплазмы 70
1. Изменения фактического уровня флуоресценции хлоропластов (F ) при локальном освещении удаленного участка клетки 72
1.1. Дальняя латеральная передача фотоиндуцированного сигнала 72
1.2. Световая индукция ответа флуоресценции хлоропластов на дистанционное локальное освещение 76
1.3. Роль переносчиков электронов на акцепторной стороне ФСI 80
1.4. Зависимость фотоиндуцированных изменений F от скорости потока цитоплазмы 85
1.5. Фотоиндуцированные изменения F при кратковременной остановке движения цитоплазмы 90
2. Роль дистанционных взаимодействий между хлоропластами при микроповреждениях клеточной стенки 98
2.1. Влияние локального освещения на рН апопласта при микроперфорации клеточной стенки 98
2.2. Сдвиги рН в зоне микроперфорации КС при освещении удаленного участка 101
ГЛАВА IV.Обсуждение 105
Выводы 115
Список литературы 117
- Первичные процессы в ответной реакции растительных клеток на механический стресс
- Измерения флуоресценции хлоропластов с помощью метода насыщающих световых импульсов
- Изменения рН на поверхности клетки при повреждении тонопласта
- Световая индукция ответа флуоресценции хлоропластов на дистанционное локальное освещение
Первичные процессы в ответной реакции растительных клеток на механический стресс
Клетки харовых водорослей являются уникальным и одним из наиболее изученных растительных объектов, используемых при исследовании растительных клеток. Как модельный объект Chara обладает рядом выгодных особенностей. Во-первых, междоузлия харовых водорослей — это гигантские цилиндрические клетки (длиной более 50 мм и диаметром 0.5–1.0 мм), обладающие четко определенной геометрией. Во-вторых, гигантские междоузлия харовых водорослей Nitella, Nitellopsis, Chara corallina позволяют изучать многие фундаментальные процессы (мембранный транспорт, явления самоорганизации, электрогенез, возбудимость, биологическую подвижность) на уровне одиночной клетки. В-третьих, клетки харовых водорослей непрерывно поддерживают интенсивное движение цитоплазмы – циклоз или циклозис, который является удобным показателем жизнеспособности клеток, а его кратковременная остановка – показателем электрического возбуждения. Клетки харовых водорослей исключительно удобны для экспериментального манипулирования, так как их крупные размеры открывают широкие возможности для внутриклеточной перфузии, внутриклеточной регистрации потенциалов, введения ионоселективных датчиков, микроинъекции и получения капель протоплазмы.
Мембраны клеток харовых водорослей обладают способностью к электрическому возбуждению. В ответ на различные стимулы клетки харовых водорослей способны генерировать потенциалы действия (амплитудой до 150-200 мВ), сопровождающиеся временной остановкой кругового движения цитоплазмы. Способность клеток Chara к генерации потенциала действия (ПД) позволяет исследовать влияние электрического возбуждения на клеточный метаболизм. На этих клетках в течение многих лет исследовали механизмы электровозбудимости мембран (Hope and Findlay 1964; Kishimoto and Tazawa 1965; Hope and Walker 1975; Oda and Linstead 1975). Механизм генерации ПД у харовых водорослей изучен достаточно полно (Lunevsky et al. 1983; Plieth et al. 1998b). Ключевым событием в генерации ПД является повышение концентрации Са2+ в цитоплазме при возбуждении (Kikuyama and Tazawa 1983; Lunevsky et al. 1983; Sanders et al. 2002). Методом фиксации напряжения на целых клетках Chara выявлены потенциал-зависимые Са2+-каналы и Са2+-зависимые хлорные каналы. Увеличение [Са2+] в цитоплазме вызывает открывание Cl– каналов плазмалеммы. Вход Са2+ и выход Cl– приводят к деполяризации клеточной мембраны. В связи с изменением мембранного потенциала открываются (на несколько секунд) К+-каналы, и поток К+ наружу обеспечивает реполяризацию мембраны. Во время ПД происходит многократное возрастание внутриклеточного уровня Ca2+: от 200 нM до 10–40 мкM (Berestovsky and Kataev 2005; Hepler 2005).
Другой характерной особенностью этих клеток служит наличие мощных электрогенных ионных насосов, в частности H+-насосов плазмалеммы и тонопласта (Бобров и др. 1979; Tazawa 2003). Показано, что H+ насос плазмалеммы — АТФ зависимый (Kawamura and Tazawa 1980; Serrano et al. 1988; Tominaga et al. 2001). Энергия электрохимического градиента протонов, создаваемого Н+-насосом, используется в процессе минерального питания клетки, в частности, для поступления ионов калия. Протонный насос участвует в поддержании внутриклеточного рН и электрогенеза, стимулирует фотосинтез водных растений.
Клеткам харовых водорослей свойственно интенсивное непрерывное движение цитоплазмы (со скоростью 50–100 мкм/с при температуре 20–30С), которое относят к одной из форм немышечной подвижности. Изучению циклозиса посвящены работы Kamiya 50–70-х гг. (Kamiya 1981) и более поздние исследования (Nothnagel et al. 1981; Sugi and Chaen 2003). Движущей силой циклозиса является АТФ-зависимое взаимодействие актиновых филаментов, прикрепленных к слою хлоропластов, с цитоплазматическими молекулами миозина, соединенными с подвижными частицами цитоплазмы (Nothnagel et al. 1981; Sugi and Chaen 2003). Известно, что концентрация Са2+ в цитоплазме влияет на скорость циклозиса. Так, при помещении клетки Chara в темноту, происходит выход Са2+ из хлоропластов (Sai and Johnson 2002), что приводит к фосфорилированию головок миозина и замедлению циклозиса (Plieth et al. 1998a). Поток останавливается сразу после возбуждения клетки и начинает восстанавливаться спустя примерно 30 с после ПД, параллельно с уменьшением [Ca2+]цит (Kamiya 1959).
Измерения флуоресценции хлоропластов с помощью метода насыщающих световых импульсов
Действующий свет направляли на клетку сверху. Источником света служила галогенная лампа верхнего осветителя микроскопа Axiovert 25-CFL. Интенсивность действующего света понижали с помощью нейтральных стеклянных светофильтров.
Источником измерительного света и насыщающих световых импульсов в системе Microscopy РАМ служил светодиод NS ВG 500 (Nichia, Япония) с излучением в синей области спектра. Для отделения флуоресценции хлорофилла от возбуждающего синего света использовали комбинацию светофильтров, поставляемую с прибором. Свет возбуждения флуоресценции проходил через синий светофильтр BG 39 (Schott, Германия) и направлялся на объект с помощью светоделительной пластинки R65 (Balzers, Лихтенштейн). Свет флуоресценции, направляемый к фотоумножителю, проходил через фильтр DT Yellow (Balzers) и красный светофильтр RG 645 (Schott), которые не пропускали рассеянный синий свет. Сигналы флуоресценции и рН приводили к цифровым значениям с помощью аналого-цифрового преобразователя CED 1401 (Cambridge Electronic Design, Великобритания). Для обработки сигналов использовали программу WinControl (Walz, Германия).
Механическая стимуляция клеток
Механическую стимуляцию клеток проводили с помощью стеклянных микропипеток с диаметром кончика менее 1 мкм. Их готовили на устройстве для вертикального вытягивания микроэлектродов МЭ-4. Микропипетки для перфорации КС вытягивали из стеклянных капилляров (стекло пирекс) с наружным диаметром 1.1 мм.
Три микроманипулятора были установлены рядом с микроскопом, что позволило точно позиционировать рН-микроэлектрод, микропипетку для механостимуляции, а также оплавленный капилляр (внешний диаметр 1 мм), служащий в качестве опоры для клетки в месте укола. Все микроинструменты подводили к клетке под небольшим углом к горизонтальной плоскости. Угол между сенсором рН и стимулирующей пипеткой составлял 45, оплавленный капилляр-упор располагали с противоположной стороны клетки под примерно одинаковым углом к рН-электроду и микропипетке.
Измерения рН проводили на расстоянии 5–10 мкм от поверхности интернодальной клетки Chara. Стимулирующую микропипетку вводили в клетку на глубину нескольких микрометров и через 1-2 с отводили. Для следующей экспериментальной записи смещались в нетронутую область клетки. Последующую механическую стимуляцию междоузлия проводили на расстоянии 0.2 мм от места предыдущего укола. Таким образом, несколько повторяющихся записей изменений рНо проводили на одной клетке длиной несколько сантиметров. Измерение мембранного потенциала В серии экспериментов укалывающая пипетка была заполнена раствором 1 M KCl. В таком варианте проводили измерения мембранного потенциала для контроля над глубиной введения стимулирующей микропипетки. Для измерения мембранного потенциала микроэлектрод, включенный в измерительную цепь, соединяли с входом электрометра VAJ-51 (Германия), который измеряет разность потенциалов по отношению к хлорсеребряному электроду сравнения. Микроэлектроды вводили в цитоплазму клетки, стараясь не допустить попадания в вакуоль. Критерием попадания в цитоплазму служило отсутствие генерации потенциала действия и временной остановки цитоплазмы (Бобров и др. 1973).
Локальная фотостимуляция клетки Для изучения дальних взаимодействий между хлоропластами использовали комбинацию импульсно-модулированной микрофлуориметрии и локального освещения удаленного участка клетки.
Для локальной фотостимуляции участка клетки на удалении d = 1.5-5 мм от места измерения использовали кварцевый световод (диаметр оптоволокна 400 мкм), соединенный со светодиодным источником белого света (светодиод Luxeon LXK2-PWN2-S00, Lumileds, США). Плотность потока квантов на выходе световода составляла 500 мкмоль/(м2 с) (Bulychev and Dodonova 2011). Свободный конец световода закрепляли в держателе микроинструмента и подводили вплотную к верхней части клетки с помощью микроманипулятора КМ-1 под углом 30–45 к горизонтальной плоскости, но так, чтобы световод не касался клетки. После юстировки положения оптоволокна в поле зрения, световод смещали микрометрическим винтом манипулятора на расстояние 1.5-5 мм (расстояние d) вверх по течению цитоплазмы от анализируемого участка (рис. 7, позиция 1). В некоторых случаях также проводили измерения в позиции 2, т.е. источник света располагался ниже по ходу движения цитоплазмы от места измерения.
Чтобы сократить число интермедиатов, участвующих в обмене между хлоропластами и цитоплазмой на интенсивном свету, использовали сравнительно короткие световые импульсы локального освещения (30 с). В этом случае состав цитоплазмы модифицируется только за счет быстро обмениваемых компонентов. В целях сравнения в ряде опытов использовали импульсы большей длительности (60 с).
Изменения рН на поверхности клетки при повреждении тонопласта
Основное внимание было уделено изменениям F , вызываемым локальной световой стимуляцией удаленного участка клетки (пик при t 400с) и фотоиндукции передачи сигналов с потоком цитоплазмы. На основе записей, аналогичных показанным на рис. 27Б, были построены кинетические кривые для эффективного квантового выхода потока электронов в ФСII (F/Fm ). Они приведены на рис. 27В. Результаты выявили кратковременное падение F/Fm в ответ на отдаленную локальную фотостимуляцию. На основе данных для F and Fm , показанных на рис. 27Б, были рассчитаны коэффициенты фото- и нефотохимического тушения (qP и qN, (van Kooten and Snel 1990; Schreiber 2004) в любой момент после включения действующего света и при локальной фотостимуляции. Хотя экспериментальное определение параметра Fo, содержащегося в уравнениях для расчета qP и qN, затруднено, Fo можно рассчитать по данным измерений флуоресценции, воспользовавшись формулой, предложенной в работе (Oxborough and Baker 1997). Проведенный в соответствии с этим методом анализ тушения флуоресценции показал, что уменьшение фотохимического тушения (qP) при максимальном сдвиге F было в 6 раз больше, чем ослабление нефотохимического тушения (qN). Таким образом, увеличение F и соответствующее падение квантового выхода ФСII (F/Fm ) было вызвано уменьшением фотохимического тушения в связи с восстановлением QA. Скорость линейного транспорта электронов пропорциональна интенсивности действующего света и эффективному квантовому выходу ФСII (F/Fm ). Анализируемый участок клетки в течение всего эксперимента (начиная с момента включения t 20 с) находился на действующем свету постоянной интенсивности. Таким образом, наблюдаемый спад F/Fm ( 10%) на рис. 27В при t 400 с указывает на замедление скорости транспорта электронов в хлоропластах. Следовательно, транспортируемый «сигнал» является метаболически активным и вызывает временное торможение линейного потока электронов в ЭТЦ фотосинтеза. 1.3. Роль переносчиков электронов на акцепторной стороне ФСІ Явление индукции фотосинтеза связано с СО2-зависимым транспортом электронов на акцепторной стороне ФСI (Walker 1973), что приводит к активации ферментов темновых стадий фотосинтеза при участии ферредоксина и тиоредоксина (см. обзор в (Foyer and Noctor 2009; Kopczewski and Kuniak 2013)). Известно, что восстановление НАДФ+ у адаптированных к темноте листьев начинается не сразу после включения света, а лишь после некоторого лаг-периода, длительность которого достигает десятков секунд. Эта задержка определяется фотоактивацией ферредоксин-НАДФ+ редуктазы (ФНР), которая инактивируется после инкубации в темноте (Harbinson and Hedley 1993). Транспорт электрона на НАДФ+ можно предотвратить, используя метилвиологен (паракват, МВ2+), который перенаправляет электроны на молекулярный О2 в качестве конечного акцептора.
Для выяснения роли переносчиков электронов на акцепторной стороне ФСI в дальних взаимодействиях между хлоропластами, было изучено влияние метилвиологена на изменения F , опосредованные потоком цитоплазмы. На рис. 28 приведены результаты одновременных измерений флуоресценции F и рН в апопласте на одном и том же участке клетки. В контрольных условиях (рис. 28А) наблюдался стандартный ответ по F (кривая 1), который сопровождался небольшим уменьшением рН у поверхности клетки (формирование кислой зоны, кривая 2).
Добавление 25 мкМ МВ2+ в омывающий клетку раствор не оказывало какого-либо влияния на вызываемые локальной фотостимуляцией изменения флуоресценции F и рНо даже после 30 мин инкубации (рис. 28Б). Это согласуется с ранее полученными данными о том, что метилвиологен не проникает через плазмалемму клеток Chara и остается недоступным для хлоропластов, по крайней мере, в областях со слабо кислыми значениями рН в апопласте (Krupenina et al. 2011). Вместе с тем, было показано, что сразу после генерации ПД МВ2+ попадает в хлоропласты и переключает поток электронов на восстановление О2 (Bulychev and Krupenina 2008; Krupenina et al. 2011). Сходные результаты — проникновение этого агента внутрь клетки при возбуждении клетки — получены и в наших опытах. Переключение СО2-зависимого пути переноса электронов на катализируемое метилвиологеном восстановление кислорода, устраняло изменения флуоресценции F и рН в апопласте, вызываемые дистанционной локальной фотостимуляцией клетки (рис. 28В). Таким образом, в световой индукции изменений флуоресценции в ответ на локальную фотостимуляцию удаленного участка клетки участвуют реакции на донорной стороне ФСI и, возможно, темновые реакции цикла Кальвина.
Роль путей транспорта электрона на акцепторной стороне ФСI может быть также изучена с помощью ингибитора флавин-содержащих ферментов, дифенилениодониума (DPI), который подавляет активность ферредоксин-НАДФ+ редуктазы хлоропластов и цианобактерий (Corneille et al. 1998; Koike et al. 2008). На рис. 29 показано, что дальние взаимодействия между хлоропластами, опосредованные циклозом, обратимо инактивируются в темноте (рис 29А) и необратимо подавляются после внесения в среду 10 мкм DPI (рис. 29Б). Спустя 7 мин после добавления DPI сдвиги F, наблюдаемые в ответ на локальное освещение, были подавлены на 90 %, а спустя 12 мин изменения фактической флуоресценции в ответ на действие локального света полностью исчезали.
Световая индукция ответа флуоресценции хлоропластов на дистанционное локальное освещение
Финальная стадия дальних взаимодействий между хлоропластами, опосредованных циклозом, схожа с первой, но протекает в обратном направлении. Увеличение содержания НАДФН или НАДН в строме хлоропласта за счет работы окислительно-восстановительного шаттла в результате влияет на редокс состояние пластохинонов и акцептора QA. Механизм этого влияния остается гипотетическим. С одной стороны, избыток НАДФН в строме и недостаток акцепторов ФСI в условиях непрерывного возбуждения обеих фотосистем может способствовать фотохимическому восстановлению всех переносчиков в ЭТЦ фотосинтеза, включая QA, что приводит к возрастанию фактического уровня флуоресценции F . С другой стороны, возможно происходит нефотохимическое восстановление пластохинона (PQ) и QA за счет активности НАДФН-пластохинон редуктазы или ферредоксин-пластохинон редуктазы. Функциональная активность этих ферментных систем ранее обнаружена по увеличению флуоресценции хлорофилла в темно-адаптированных пластидах при добавлении НАДФН или ферредоксина (Fd) к суспензии осмотически лизированных хлоропластов (Endo et al. 1997; Corneille et al. 1998) .
Таким образом, течение цитоплазмы выступает в качестве важного участника регуляции и возникновения пространственной неоднородности фотосинтеза. Такие регуляторные механизмы функционируют в условиях естественного одностороннего освещения водорослей, при котором движение цитоплазмы по спиральной траектории перемещает субстраты или сигнальные вещества между освещенной и затененной сторонами клетки. Наличие прозрачных нейтральных зон в слое хлоропластов усиливает неоднородность освещения на затененной стороне междоузлия, что способствует формированию пространственных структур фотосинтеза и транспорта Н+. Аналогичные механизмы включаются в действие при быстро меняющемся распределении солнечных бликов по длине междоузлий в природных водоемах. Сигналы, генерируемые в потоке цитоплазмы при непродолжительном попадании яркого светового луча на небольшой участок клетки, продолжают свое движение в потоке и после прекращения светового импульса. Эти сигналы могут эффективно влиять на фотосинтез в участках, расположенных далеко от места падения яркого луча, и проявляться с длительной (до 100 с) задержкой после угасания импульса света.
Многие авторы подчеркивали тесную связь между движением цитоплазмы и жизнеспособностью клеток (Pickard 2003; Verchot-Lubicz and Goldstein 2010). Мы предполагаем, что циклоз может играть значительную роль для
предотвращения локального накопления токсичных продуктов при длительной фотостимуляции отдельных участков фотосинтезирующей клетки. Известно, что интенсивное освещение сопровождается образованием активных форм кислорода (АФК), избыточное накопление которых может вызывать повреждение многих компонентов клетки. В работе (Eremin et al. 2013) с помощью флуоресцентного зонда на Н2О2 было показано, что локальная концентрация АФК частично понижается за счет их непрерывного удаления с потоком цитоплазмы. Накопление фотопродуктов так же может нарушать взаимодействия миозина с филаментами актина, что будет сказываться на динамике восстановления скорости движения после генерации ПД. Известно много факторов, влияющих на скорость движения. К ним относятся изменения уровня Ca2+ в цитоплазме, а также содержание АТФ, АДФ, фосфата и ряда других метаболитов. В условиях остановленного потока, локальные концентрации АФК или других метаболитов могут существенно возрастать и оказывать негативное влияние на подвижность цитоплазмы. Полученные данные говорят о том, что даже непродолжительное (30 с) локальное освещение в условиях неподвижной цитоплазмы замедляет восстановление движения цитоплазмы (Булычев и Комарова 2014b). В связи с этим можно ожидать, что интенсивное освещение клетки в условиях остановленного движения цитоплазмы оказывает более сильное повреждающее действие, чем такое же освещение клеток с активным переносом и перемешиванием внутренней среды. Таким образом, роль движения цитоплазмы в дальних взаимодействиях между хлоропластами может также заключаться в удалении из стромы избытка образовавшихся интермедиатов под действием яркого света, тем самым происходит минимизация повреждающего действия избыточного освещения.
Функционирование регуляторных механизмов в растительных клетках, поддерживаемых течением цитоплазмы, в настоящее время остается недооцененным; тем не менее, перенос сигнальных веществ с потоком представляет особый класс внутриклеточных взаимодействий, которые заслуживают дальнейшего внимательного изучения.
Показано, что интермедиаты, переносимые с потоком цитоплазмы, не только повышают флуоресценцию хлоропластов F , но одновременно стимулируют и входящий поток Н+ через плазмалемму, вызываемый микроперфорацией КС (Bulychev and Komarova 2016; Булычев и Комарова 2016). По-видимому, восстановительные эквиваленты, выступающие в качестве транспортируемого с потоком интермедиата, не только поступают в хлоропласты в области фонового освещения, но и поддерживают активность мембранной системы, ответственной за возрастание рНо при повреждении КС. В генерации сдвигов рН на плазмалемме при микроповреждении возможно участвует НАДH оксидаза плазмалеммы; в этом направлении намечены дальнейшие исследования с применением новых электрохимических датчиков микро- и нанометрических размеров.