Роль адренергических и имидазолиновых рецепторов в регуляции миокардиального Са2+-транспорта агматином в норме и патологии Мальцев Александр Владимирович

Содержание к диссертации

Введение

1. Обзор литературы 8

1.1. Типы Са2+-каналов и их классификация 8

1.2. Структура Са2+-каналов 10

1.3. Агматин: структура, распространение, метаболизм 15

1.4. Транспорт агматина 20

1.5. Мишени агматина: прямое действие 23

1.5.1. Рецепторы и каналы 23

1.5.2. Ферменты 25

1.6. Мишени агматина: непрямое действие 28

1.6.1. Ионные каналы 28

1.6.2. Митохондрии 29

1.6.3. Ферменты и метаболизм 31

1.7. Системные эффекты агматина 32

1.8. Имидазолиновые рецепторы: открытие, классификация, структура 34

1.9. Лиганды имидазолиновых рецепторов 37

1.10. Сигнальные пути имидазолиновых рецепторов 39

2. Материалы и методы исследования 43

2.1. Выделение клеток 43

2.2. Электрофизиологические эксперименты 44

2.3. Флуоресцентная и конфокальная микроскопия 47

2.4. Спектрофлуориметрические измерения 49

2.5. ПЦР анализ 49

2.6. Вестерн-блоттинг лизата кардиоцитов 51

2.7. Иммуноцитохимические аспекты 51

2.8. Статистический анализ 52

3. Результаты и обсуждения 53

3.1. Агматин и VGCC 53

3.2. Сигнальные пути, связанные с действием агматина на VGCC 55

3.3. Агматин, NO-синтаза и VGCC 57

3.4. Действие агониста I1Rs на VGCC 59

3.5. Агматин и внутриклеточный уровень Са2+ 62

3.5.1. Действие агматина на флуоресценцию зонда Fluo4 62

3.5.2. Спонтанные Са2+-волны как модель для оценки действия веществ 63

3.5.3. Источники кальция для генерации спонтанных Са2+-волн 66

3.5.4. Классификация спонтанных Са2+-волн 70

3.5.5. Действие агматина на [Са2+]in в изолированных кардиоцитах 74

3.6. Агматин, [Са2+]in, RyRs и SERCA 77

3.7. Механизмы, лежащие в основе действия малых доз агматина на [Са2+]in 79

3.8. Действие агониста I1Rs на [Са2+]in 81

3.9. Активация I1Rs и высокие концентрации агматина 83

3.10. Агматин и синтез NO 3.11. Низкие концентрации агматина, [Са2+]in и 2-ARs 86

3.12. Действие агониста 2-ARs на [Са2+]in 88

3.13. Противодействие I1Rs и 2-ARs на функциональность eNOS 90

3.14. Присутствие 2-ARs на сарколемме изолированных кардиоцитов 95

3.15. Демонстрация I1Rs в изолированных кардиомиоцитах 97

3.16. Взаимоотношения I1Rs и 2-ARs при действии на VGCC и [Са2+]in 99

3.17. Взаимодействие I1Rs и 2-ARs с -адренергической системой 103

3.18. Функциональность 2-ARs у спонтанно-гипертензивных крыс (SHR) 108

3.19. Изменения I1R-сигналинга в кардиомиоцитах SHR 114

Заключение 116

Выводы 118

Цитированная литература 119

• Агматин: структура, распространение, метаболизм
• Источники кальция для генерации спонтанных Са2+-волн
• Противодействие I1Rs и 2-ARs на функциональность eNOS
• Функциональность 2-ARs у спонтанно-гипертензивных крыс (SHR)

Введение к работе

Актуальность проблемы

Агматин – эндогенный амин, образуемый при декарбоксилировании L-аргинина ферментом аргининдекарбоксилазой. Изначально открытый как интермедиат при синтезе полиаминов у бактерий, растений и многих беспозвоночных, впоследствии был обнаружен широко распространённым в организме млекопитающих (мозг, кишечник, лёгкие, печень, почки, мышечные ткани, семенники, сердце) [Li et al., 1994; Raasch et al., 1995; Regunathan and Reis, 2000]. Его фоновый уровень в плазме крови составляет около 3 мкМ/л [Lortie et al., 2000] и способен существенно изменяться при различных патофизиологических событиях в организме, что указывает на его вовлечение в нормальную гуморальную регуляцию [Molderings et al., 2012; Uzbay et al., 2012]. Кроме эндогенного синтеза в клетках и экзогенного поступления вместе с пищей, агматин синтезируется микрофлорой кишечника [Haenish et al., 2008].

В настоящее время агматин привлекает внимание исследователей как биологически активная молекула, обладающая широким спектром эффектов на сердечно-сосудистую, нервную, эндокринную системы. Так, введение агматина крысам снижает артериальное давление дозо-зависимым образом [Gao et al., 1995], подавляет пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов [Regunathan and Reis, 1997], обладает кардиопротекторным действием в модели ишемии-реперфузии [Greenberg et al., 2001]. Он обладает негативным хронотропным действием, снижая частоту сердечных сокращений, амплитуду потенциала действия, максимальную величину деполяризации, а также дозо-зависимо пролонгирует длительность потенциала действия в пейсмекерных клетках сино-атриального узла [Li et al., 1999]. Агматин снижает сердечный выброс, общее периферическое сопротивление сосудов у нормотензивных и соле-чувствительных гипертензивных крыс [Li and He, 2001], ингибирует раннюю и отсроченную следовую деполяризацию, вызванную изопротеренолом в папиллярной мышце морских свинок [Li and He, 1999]. Агматин широко используется в спортивных диетах как добавка (до 10 г./день), способствующая эффективному набору мышечной массы и оптимизации выполняемых нагрузок.

Убиквитарное свойство агматина вовлекаться в процессы клеточной сигнализации через регуляцию синтеза полиаминов (путресцина, спермидина, спермина) длительное время считалось его единственным механизмом действия, до тех пор, пока в 1994 году не вышла статья Li и др., в которой приведены доводы в пользу того, что агматин может являться эндогенным лигандом имидазолиновых рецепторов, запуская связанные с ними сигнальные пути [Li et al., 1994]. Позднее, стараниями многих исследовательских групп, было обнаружено сродство агматина разной степени селективности к ₂-адренорецепторам (₂-ARs), 5-HT₃ серотониновым рецепторам, D₂ дофамин-связывающим сайтам, -опиоидным, аденозиновым A₁-рецепторам [Szabo et al., 1995, Raasch et al., 2001; Zomkowski et al., 2002]. Агматин также влияет на проводимость ионных каналов, например, K⁺_АТФ-зависимых каналов, NMDA-рецепторов, H⁺-чувствительных каналов в нервной ткани (ASIC), Na⁺/H⁺-обменника [Bidet et al., 1990; Santhanam et al., 2007; Li and Xu, 2011]. Кроме того, были обнаружены мишени прямого и непрямого действия агматина,

являюшиеся ферментами (орнитиндекарбоксилаза, спермидин/спермин N-ацетилтрансфераза, изоформы NO-синтазы, матриксные металлопротеиназы, моноаминоксидазы) [Galea et al., 1996; Higashi et al., 2004; Haenisch et al., 2011]. Не так давно было показано, что агматин дозо-зависимо ингибирует потенциал-зависимые Ca²⁺-токи (VGCC) в кардиомиоцитах и культуре гиппокампальных нейронов [Li et al., 2002b; Zheng et al., 2004], а также снижает цитозольную концентрацию кальция ([Ca²⁺]_in) и уровень Ca²⁺, стимулированный некоторыми агентами [Li et al., 2002a]. Агматин ускоряет инактивацию Са²⁺-канала и замедляет возврат из инактивированного состояния [Li et al., 2002a]. Однако рецепторные и сигнальные механизмы его действия на Са²⁺-сигнализацию в сердечных клетках подробно исследованы не были.

Цели и задачи исследования

Основная цель работы – исследование подробных механизмов действия агматина на основные параметры Са²⁺-сигнализации (Са²⁺-каналы L-типа и [Ca²⁺]_in), а также на уровень оксида азота (NO) в изолированных кардиоцитах крыс в норме и патологии (модель спонтанно-гипертензивных крыс, SHR). Проверка предположения о наличии на сердечных клетках имидазолиновых рецепторов первого типа (I₁Rs) и ₂-ARs, как мишеней для действия агматина.

Задачи:

1. Исследовать действие агматина на потенциал-зависимые Са²⁺-токи L-типа (voltage-gated calcium channels, VGCC).

2. Разработать протокол для измерения внутриклеточного уровня Са²⁺.

3. Изучить механизмы действия агматина на [Ca²⁺]_in и продукцию NO.

4. Проверить предположение о наличии на изолированных кардиомиоцитах I₁Rs и ₂-ARs с помощью селективных рецепторных агонистов, а также с привлечением дополнительных методов (ОТ-ПЦР, иммуноцитохимия, вестерн-блоттинг).

5. Исследовать особенности действия агматина в изолированных кардиомиоцитах спонтанно-гипертензивных крыс (SHR).

Научная новизна работы и полученные результаты

Показано, что действие агматина на VGCC связано с активацией I₁Rs и сопряжённого с ними сигнального пути, включающего фосфатидилхолин-специфическую фосфолипазу С (PC-PLC) и изоформы протеинкиназы С (PKC). Впервые было обнаружено действие агониста I₁Rs – рилменидина на VGCC, указывающее на наличие периферических эффектов активации I₁Rs в рабочих клетках миокарда. Учитывая тот факт, что агонисты этих рецепторов (моксонидин и рилменидин) широко применяются в клинической практике, как антигипертензивные препараты последнего поколения, обнаруженные эффекты их нецентрального действия могут быть крайне важны для понимания возможных побочных действий при терапии агонистами/антагонистами I₁Rs. Кроме того, было обнаружено бифазное действие агматина на [Ca²⁺]_in: малые концентрации (1 – 500 мкМ) снижают уровень Са²⁺ в цитозоле, высокие (2 – 15 мМ) приводят к реверсии эффекта вплоть до увеличения Са²⁺. Установлено, что снижение [Ca²⁺]_in связано с активацией ₂-ARs, сопряжённого с ними PI₃K – Akt сигнального пути, который приводит к стимуляции эндотелиальной изоформы NO-синтазы (eNOS), и, соответственно, повышению продукции NO. Оксид

азота, в свою очередь, cGMP-независимо усиливает активность Са²⁺-АТФазы саркоплазматического ретикулума (SERCA), эффективно увеличивая закачку Са²⁺ в депо. Агонист ₂-ARs, гуанабенц, полностью воспроизводил эффекты малых доз агматина, и, по имеющимся у нас данным, это первое свидетельство вовлечения ₂-ARs в регуляцию цитозольного уровня Са²⁺ в сердечных клетках. Действие высоких концентраций агматина (2 – 15 мМ) связано с активацией I₁Rs – PC-PLC – PKC, что приводит к снижению синтеза NO и увеличению Са²⁺-выброса в цитозоль через рианодиновые рецепторы (RyRs). Исследования механизмов действия агониста I₁Rs подтвердили ингибирование eNOS и повышение Са²⁺ в цитозоле при активации этих рецепторов. Таким образом, полученные экспериментальные данные чётко обосновали наличие I₁Rs и ₂-ARs на мембране кардиомиоцитов, что и было подтверждено методами ОТ-ПЦР, иммуноцитохимии и вестерн-блоттинга.

Кроме того, впервые были получены результаты о различиях в функциональности ₂-ARs и I₁Rs в кардиомиоцитах SHR в сравнении с нормотензивными крысами. Показано, что физиологические ответы сердечных клеток, как в случае VGCC, так и в случае [Ca²⁺]_in, у SHR снижены почти вдвое.

Научно-практическая ценность

Полученные результаты показывают, что существующий рецепторный каталог для кардиомиоцитов должен быть дополнен, по крайней мере, I₁Rs и тремя подтипами ₂-адренорецепторов (_2А-, _2В-, _2С-ARs). Кроме этого, наши данные показывают функциональность обнаруженных рецепторов в регуляции процессов Са²⁺-сигнализации, что может иметь существенную терапевтическую ценность и открывает новые мишени для фармакологических аппликаций.

Апробация диссертации

Материалы были представлены на всероссийском конгрессе “Симбиоз-2010” (Нижний Новгород, 2010); конференции “Биология – наука XXI века” (Пущино, 2010); международных конференциях: “Ломоносов-2012” (Москва, 2012), “Экспериментальная и теоретическая биофизика” (Пущино, 2011, 2012, 2013). Результаты диссертации опубликованы в 5 работах в рецензируемых журналах, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и цитированную литературу. Работа изложена на 139 страницах, содержит 53 рисунка и 2 таблицы. Список литературы включает 330 ссылок.

Агматин: структура, распространение, метаболизм

Агматин – основной амин, образуемый при декарбоксилировании L-аргинина ферментом аргининдекарбоксилазой (ADC), был впервые идентифицирован Альбрехтом Косселем (Albrecht Kossel) в сперматозоидах сельди, в 1910 году [Kossel, 1910]. Впоследствии агматин был найден у бактерий, растений и большого числа беспозвоночных, как интермедиат при синтезе полиаминов [Melnykowycz and Johansson, 1955; Ramakrishna and Adiga, 1975; Tabor C.W. and Tabor H., 1984; Yamamoto et al., 1988]. Убиквитарное свойство агматина вовлекаться в процессы клеточного роста через биосинтез полиаминов (путресцина, спермидина, спермина) длительное время считалось его единственной функцией, до тех пор, пока в 1994 году не вышла статья Li и соавторов [Li et al., 1994], в которой приведены доводы в пользу того, что агматин может являться эндогенным лигандом имидазолиновых рецепторов, в связи с чем, было показано, что в мозге млекопитающих присутствует как агматин, так и ADC. Позднее, он также был обнаружен в аорте, тонком и толстом кишечнике, селезёнке, лёгких, почках, сердце, печени, мышечной ткани, семенниках и плазме крови [Raasch et al., 1995]. Концентрация агматина в плазме составляет около 3 мкМ/л [Lortie et al., 2000]. Кроме эндогенного синтеза в клетках и экзогенного поступления вместе с пищей, агматин синтезируется микрофлорой кишечника [Haenisch et al., 2008]. Распределение агматина в тканях сильно варьирует даже внутри вида, так его максимальная концентрация у крыс Sprague-Dawley обнаружена в желудке, а у крыс Long Evans – в надпочечниках. Подобная вариативность может объясняться различиями в регуляции ADC, ферментов деградации, или изменениями в аккумулировании и высвобождении этого амина. Зависимость концентрации агматина в тканях от возраста отсутствует, за исключением коры головного мозга. Так, показано, что его количество снижено на 50% в мозге старых крыс [Raasch et al., 1995]. На субклеточном уровне было установлено, что агматин локализуется, главным образом, в виде больших плотноядерных везикул в цитоплазме, в непосредственной близости от эндоплазматического ретикулума и митохондрий, что согласуется с расположением ADC, ответственной за его синтез [Otake et al., 1998].

Схематическое представление наиболее стабильных структур агматина в водном растворе в различных состояниях протонирования. Наиболее распространённая физиологическая форма агматина – дикатион.

Агматин (4-[аминобутил]-гуанидин) по химическому составу и свойствам представляет из себя следующее (рис. 2): молекулярная масса 130 Да; максимум поглощения в ультрафиолетовой области (200 нм) указывает на алифатическую структуру; положительная нингидриновая реакция подтверждает наличие аминогрупп [Raasch et al., 2001]. Несмотря на широкое распространение агматина, фермент его синтеза (ADC) как по структуре, так и по свойствам, существенно отличается в разных типах клеток. Прокариотическая и растительная ADC были очищены и клонированы [Bell and Malmberg, 1990]. У бактерий ADC экспрессируется в конститутивной (биосинтетической) и индуцибельной (биодеградативной) формах. Обе изоформы являются цитоплазматическими и зависят от пиридоксаль-фосфата и Mg2+ [Wu and Morris, 1973]. Растительная ADC синтезируется в виде профермента-предшественника, который в результате протеолитического расщепления образует комплекс из двух полипептидных фрагментов. Образуемый гетеродимерный комплекс представляет собой функционально активный фермент ADC, который локализуется в цитоплазме [Malmberg and Cellino, 1994]. ADC в организме млекопитающих была обнаружена в мозге, почках, эндотелии [Li et al., 1994; Lortie et al., 1996]. В отличие от прокариотической и растительной изоформ, ADC млекопитающих является связанной с мембранами митохондрий [Regunathan and Reis, 2000], а также обладает способностью использовать в качестве субстрата кроме L-аргинина ещё и орнитин [Hunter et al., 1991]. Недавно была клонирована ADC человека, и было показано, что она на 48% идентична орнитиндекарбоксилазе [Zhu et al., 2004], однако это не объясняет использование орнитина как дополнительного субстрата, поскольку ADC человека не обладает орнитиндекарбоксилазной активностью. Активность ADC млекопитающих существенно отличается от активности прокариотической или растительной ADC по многим физико-химическим свойствам: её температурный оптимум – 25 С (в отличие от 37 С у бактерий), сродство к L-аргинину в десятки раз ниже (KM = 0.75 мМ) [Li et al., 1995], активность ингибируется Са2+, не снижается при действии ингибиторов бактериальной ADC, а также орнитиндекарбоксилазы или NO-синтазы [Reis and Regunathan, 2000]. Только значения слабощёлочного pH-оптимума (8.3 и 8.4) являются близкими [Regunathan and Reis, 2000]. В клеточной культуре мозга неонатальных крыс активность ADC была низкой в нейронах, но гораздо более высокой в астроцитах [Regunathan et al., 1995]. Учитывая тот факт, что подобно другим нейротрансмиттерам, агматин Са2+-зависимо высвобождается из синаптосом в ответ на деполяризацию, можно предположить, что места синтеза агматина и его накопления могут различаться. Т.е. агматин синтезируется в глии, выходит во внеклеточное пространство, и далее – запасается и накапливается в нейронах для дальнейшего высвобождения [Reis and Regunathan, 1998]

В почке активность ADC была обнаружена в митохондриальной фракции как кортекса, так и медуллярного слоя, а тот факт, что микромолярные концентрации агматина были способны влиять на скорость клубочковой фильтрации, наводит на мысль о физиологической значимости агматина для нормального функционирования почек [Lortie et al., 1996]. В сосудистой системе известно, что агматин накапливается в эндотелиальных клетках и гладкомышечных клетках сосудов, но ADC экспрессируется только в эндотелии [Regunathan et al., 1996].

Катаболизм агматина в основном осуществляется двумя ферментами: агматиназой и диаминоксидазой [Morris, 2004]. Агматиназа классифицируется как член суперсемейства аргиназ и катализирует превращение агматина в путресцин с отщеплением мочевины [Panagiotidis et al., 1987]. Сравнение первичной структуры агматиназ разных видов позвоночных показывает, что некоторые аминокислотные остатки, необходимые для каталитической активности фермента отсутствуют, например, у мышей. Это указывает на существование видоспецифичных различий в механизмах регулирования уровня агматина [Morris, 2003]. Недавно была клонирована агматиназа человека, и было показано, что она на 42% идентична аргиназам I и II [Iyer et al., 2002]. Наибольшая концентрация агматиназы обнаружена в печени, почках, мозге [Mistry et al., 2002; Dallmann et al., 2004]. Агматиназа локализуется на внешней митохондриальной мембране, и что удивительно, обладает довольно низким сродством к агматину (KM = 5.3 мМ) [Reis and Regunathan, 2000]. Принимая во внимание ещё и тот факт, что слабым сродством к нему также обладает аргиназа [Reczkowski and Ash, 1994], возникает вопрос относительно отсутствия высокоспецифичной системы деградации агматина. До сих пор остаётся непонятным, с чем это может быть связано.

Ещё один фермент катаболизма агматина – диаминоксидаза (субстратами которой являются и другие диамины, например, путресцин), катализирует превращение агматина в агматин-альдегид, который затем под действием алкогольдегидрогеназы превращается в 4-гуанидино-бутановую кислоту [Satriano et al., 2001b]. Диаминоксидаза была обнаружена в почках, коже, плаценте, тонком кишечнике, крови, макрофагах, гладкомышечных клетках сосудов, желудке; отсутствовала в мозге, сердце, печени, надпочечниках, скелетной мышце. Константа Михаэлиса для утилизации агматина диаминоксидазой является низкой (около 5 мкМ), что говорит о достаточно высоком сродстве [Lortie et al., 1996]. Однако данные о роли диаминоксидазы в утилизации агматина противоречивы. Так в гепатоцитах крыс около 50% экзогенно добавленного агматина расщепляются диаминоксидазой [Cabella et al., 2001], но при длительной блокаде диаминоксидазы не было обнаружено никаких изменений в плазменном или тканевом уровнях агматина. Кроме того, диаминоксидаза отсутствует в местах наиболее активного синтеза агматина (например, мозг, эндотелий, печень) [Lortie et al., 1996].

Источники кальция для генерации спонтанных Са2+-волн

Спонтанные Са2+-волны в изолированных кардиомиоцитах наблюдались в каждой выделенной первичной диссоциированной культуре сердечных клеток левого желудочка крыс всех возрастов. Число клеток в популяции, генерирующее спонтанные Са2+-волны, составляло около 20 ± 5%. Морфологически спонтанно-активные клетки ничем не отличались от нормальных клеток, в которых спонтанных Са2+-волн не наблюдалось: отчётливая исчерченная структура, ровные, но не сглаженные края, прямоугольная, без скруглений форма кардиомиоцита. Числовые пределы встречаемости и морфология спонтанно-активных кардиомиоцитов свидетельствуют о том, что вероятнее всего такие кардиомиоциты относятся к типу “рабочих” клеток миокарда, а не к атипичным кардиоцитам проводящей системы, побочно оказавшимся среди миокардиальных клеток. Далее нами были исследованы физиологические свойства кардиомиоцитов, генерирующих спонтанные Са2+-волны.

Зависимость Са2+-волн от внеклеточного уровня ионов Са2+ ([Са2+]ex)

Чтобы проверить, насколько Са2+-волны зависят от экстраклеточного уровня ионов кальция, мы снизили концентрацию [Са2+]ex до 1 мкМ, используя для расчета необходимой концентрации ЭГТА стандартную программу-калькулятор (http://www.stanford.edu/ cpatton/CaEGTAS.htm). На рис. 18 а, б приведены типичные записи Са2+-волн, полученные при [Са2+]ex = 1 мкМ. Во всех экспериментах усредненные значения амплитуды и частоты Са2+-волн существенно уменьшались (до 25.9 ± 11.3%, p 0.05 – для частоты, 36.9 ± 8.5%, p 0.05 – для амплитуды, n = 23, рис. 19). Са2+-волны могли исчезать к 5-6 минуте со времени подачи раствора с ЭГТА, но при этом интенсивность флуоресценции красителя постепенно нарастала, что указывало на утечку Са2+ из внутриклеточного депо (рис. 18а).

Зависимость Са2+-волн от источников внеклеточного Са2+

В дальнейшем, все эксперименты проводились при [Са2+]ex = 1.3 мМ. Селективный блокатор VGCC – нифедипин (10 мкМ) никогда не приводил к полному подавлению волн, снижая частоту (до 57.9 ± 15.8%, p 0.05) и в меньшей степени – амплитуду (до 83.2 ± 10.8%, p 0.05, n = 19, рис. 18в, 19). Тот факт, что нифедипин никогда не приводил к полному подавлению волн (рис. 18в), наводит на мысль, что VGCC не являются триггерами спонтанных волн, т.е. их участие в генерации Са2+-осцилляций вторично и является следствием появления волн, но не причиной. Вероятно, сначала возникает выброс Са2+ через RyRs, а уже затем – вход Са2+ через VGCC. Ингибитор обратной формы Na+/Са2+-обменного механизма – соединение KB-R7943 (10 мкМ) практически не влиял ни на частоту (109.7 ± 10.3%, p 0.05), ни на амплитуду спонтанных Са2+-волн (108.3 ± 9.5%, p 0.05, n = 21, рис. 18г, 19), что свидетельствует о незначительном участии Na+/Са2+-транспортёра в генерации спонтанных Са2+-волн.

Кроме того, было исследовано возможное участие в формировании Са2+-волн каналов, регулируемых высвобождением Са2+ из внутриклеточных депо (store-operated channels, SOC-каналов). Неспецифический ингибитор SOC-каналов – 2АРВ (100 мкМ) уменьшал амплитуду спонтанных волн (до 70.6 ± 13.8%, p 0.05, рис. 18д), но не приводил к их полному подавлению (частота составляла 110.6 ± 8.8%, p 0.05, n = 16, рис. 19). Участие SOC-каналов представляется вполне логичным, потому что их открывание обеспечивается опустошением SR, что происходит каждый раз когда идёт мощный выброс Са2+ через RyRs. Однако, участие SOC-каналов также вторично, о чём свидетельствует восстановление частоты спонтанных Са2+-волн после блокады SOC-каналов. Таким образом, внешние источники Са2+, несмотря на своё участие в генерации спонтанных волн, не являются определяющими.

Зависимость Са2+-волн от внутриклеточных источников кальция

Далее мы исследовали влияние ингибиторов каналов внутриклеточных депо на распространение спонтанных волн. Ксестоспонгин С (блокатор инозитол-3-фосфат-чувствительных рецепторов – IP3Rs, 1 мкМ) в первые минуты после подачи в экспериментальную камеру мог снижать частоту Са2+-волн, однако в течение 5-7 минут она начинала возрастать и динамика возвращалась к исходным значениям (89.2 ± 15.5%, p 0.05 – для частоты, 90.2 ± 10.5%, p 0.05 – для амплитуды, n = 14, рис. 18е, 19), что свидетельствует о модуляторной роли IP3Rs в распространении спонтанных Са2+-волн, которая может быть легко скомпенсирована при их фармакологической блокаде. Рианодин же, напротив, приводил к полному исчезновению волн (n = 17, рис. 18ж, 19), из чего следует, что выброс депонированного Са2+ через RyRs является определяющим среди прочих механизмов, участвующих в генерации спонтанных волн. Полученные экспериментальные данные согласуются с данными о транскрипционном уровне Са2+-высвобождающих каналов в SR. Известно, что экспрессия IP3Rs на два порядка ниже, чем RyRs [Kockscamper et al., 2008].

На рис. 19 представлены гистограммы, отображающие действие соединений, используемых в описанных выше экспериментах, на средние значения частоты (рис. 19а) и амплитуды (рис. 19б) спонтанных Са2+-волн в сравнении с контролем. Из приведенных гистограмм видно, что при постоянной внешней концентрации Са2+ в растворе (1.3мМ), основной вклад в спонтанные Са2+-волны вносили утечка и выброс Са2+ из SR через RyRs, вход Са2+ через VGCC и SOC-каналы.

Противодействие I1Rs и 2-ARs на функциональность eNOS

Основываясь на экспериментах по прямому измерению NO зондом DAF-FM при действии разных доз агматина, мы предположили, что стимуляция 2-ARs при помощи агонистов будет увеличивать активность NOS и приводить к накоплению в кардиомиоцитах NO, а активация имидазолиновых рецепторов первого типа ингибировать NOS-активность. На рис. 32 показан синтез NO, индуцированный низкими дозами агматина, при блокаде 2-ARs и связанных с ними сигнальных путей. Неудивительно, что блокатор эндотелиальной NO-синтазы – L-NIO предотвращал продукцию оксида азота 100 мкМ агматина до 14.7 ± 5.3% (с 78.0 ± 11.0% в контроле, n = 11, p 0.05). На фоне блокатора нейрональной изоформы NOS – соединения A5727, синтез NO агматином сохранялся, составляя 65.4 ± 15.1% (n = 9, p 0.05). Продукция NO также предотвращалась раувольсцином (до 15.4 ± 9.3 %, n = 9, p 0.05), вортманнином (до 7.5 ± 6.4%, n = 8, p 0.05) и ингибитором Akt1/2 киназы (до 4.8 ± 7.6%, n = 7, p 0.05).

Как было показано в разделе 3.10., блокада I1Rs приводила к тому, что высокие концентрации агматина (15 мМ), не приводящие к достоверному синтезу NO сами по себе, вновь были способны индуцировать существенную продукцию оксида азота. На рис. 33 показано, что ингибирование PC-PLC и PKC-изоформ, активация которых сопряжена с активацией I1Rs в изолированных кардиоцитах, приводило к тому, что 15 мМ агматина увеличивали синтез NO. Так, на фоне D609 детектируемый уровень NO увеличивался на 75.7 ± 13.3% (против 12.4 ± 9.3% в контроле, n = 7, p 0.05). В сердечных клетках, предварительно обработанных кальфостином С, NO-сигнал при аппликации 15 мМ агматина возрастал на 99.3 ± 15.6% (n = 8, p 0.05).

Кроме того, мы использовали селективные агонисты 2-ARs и I1Rs, чтобы дополнительно проверить прямое участие указанных рецепторов в регуляции активности еNOS (рис. 34). Активация 2-ARs гуанабенцом (10 мкМ) вызывала существенную продукцию оксида азота, повышая его базальный уровень на 56.5 ± 7.6% (n = 7). Стимуляция I1Rs рилменидином (10 мкМ) сама по себе не приводила к достоверным изменениям в уровне NO (1.4 ± 1.8%, n = 5), однако оказалась способной повлиять на синтез NO, вызванный активацией 2-ARs. Гуанабенц (10 мкМ), апплицированный на кардиомиоциты, предварительно обработанные рилменидином (10 мкМ) был не в состоянии индуцировать увеличение уровня NO (3.2 ± 2.4%, n = 6, p 0.05). Полученные данные свидетельствуют о противодействии сигнальных путей от I1Rs и 2-ARs в отношении активности eNOS.

Молекулярные основания, за счёт которых активация 2-ARs и I1Rs приводят к противонаправленным эффектам в отношении eNOS, могут быть связаны с её регуляцией путём фосфорилирования киназами, вовлечёнными в трансдукцию сигналов от этих рецепторов. Серин-1179 и треонин-497 в структуре eNOS были идентифицированы как ключевые остатки, отвечающие за переход фермента из активного состояния в инактивированное, и обратно. Было показано, что фосфорилирование по серину-1179 AMP-зависимой протеинкиназой, PKA и Akt-киназой, а также дефосфорилирование по треонину-497 протеинфосфатазой 1 (PP1) активирует eNOS [Michell et al., 2001]. В то же время, дефосфорилирование энзима по серину-1179 протеинфосфатазой 2А (PP2A) и PKC-опосредуемое фосфорилирование по треонину-497 - ингибируют активность eNOS [Chen et al., 2014]. В нашем случае, низкие дозы агматина или гуанабенц, активируя 2-ARs, запускали G - PI3K - Akt сигнальный путь, который приводил к активации eNOS. Высокие концентрации агматина или рилменидин, запуская сигналинг от I1Rs через PC-PLC - DAG - PKC приводили к переходу eNOS в неактивное состояние. Причём, инактивированная таким способом eNOS была неспособна продуцировать оксид азота, связанный с запуском 2-ARs-сигналинга. Как было обнаружено в настоящей работе, синтез NO тесным образом связан с регуляцией внутриклеточного уровня кальция: увеличение продукции оксида азота посредством eNOS снижает [Ca in, тогда как переход eNOS в неактивное состояние, например, за счёт PKC-зависимого фосфорилирования, приводит к накоплению фоновых концентраций Са в цитозоле. Поскольку активация 2-ARs низкими концентрациями агматина была неэффективна в ингиировании Са выброса через RyRs в кардиомиоцитах, генерирующих спонтанные Са2+-волны, а блокаторы SERCA предотвращали действие агматина, можно сделать вывод о том, что ключевой мишенью NO является именно SERCA. Это хорошо согласуется с литературными данными, так как было показано, что прямое S-нитрозилирование самого канального комплекса SERCA [Adachi et al., 2004; Tong et al., 2010] и/или связанного с ним ингибиторного белка – фосфоламбана [Catalucci et al., 2009; Garofalo et al., 2009] оксидом азота приводит к усилению закачивания Са2+ в саркоплазматический ретикулум. В конечном итоге, уровень [Ca2+]in падает, потенциируя накопление Са2+ в депо. Теоретически, данный механизм может быть важным для регуляции инотропии мышечных клеток миокарда, поскольку аккумулированный в депо кальций выбрасывается в ответ на входящий при деполяризующем стимуле через VGCC Са2+-ток. Чем больше Ca2+ выбрасывается из ретикулума, тем больше сила сокращения мышечной клетки и миокарда в целом. Таким образом, NO, регулирующий Са2+-емкость в ретикулуме, представляется крайне важным для нормального функционирования кардиомиоцитов и сердечной ткани в целом. Это согласуется с исследованиями по действию ингибиторов eNOS на системном уровне: их введение приводило к снижению сердечного выброса, увеличению dP/dt и максимального давления в левом желудочке во время сокращения [Prendergast et al., 1997; Casadei and Sears, 2003]. Можно предположить, что активация 2-ARs, приводящая к NO-SERCA-опосредуемому снижению [Ca2+]in будет фасилитировать сократимость сердечной мыщцы. Однако, данное предположение нуждается в проверке, как на уровне отдельных клеток, так и на тканевом, и уровне целого сердца.

Активация I1Rs – PC-PLC – DAG – PKC в наших экспериментах приводила к ингибированию eNOS – NO – SERCA-сигналинга, снижая закачивание Са2+ во внутриклеточное депо и стимулируя выброс Са2+ из ретикулума через RyRs, что вызывает увеличение [Ca2+]in в цитозоле. Это представляется интересной обратной связью, влияющей на сократимость кардиомиоцитов. Так, показано, что стимуляция -изоформы PKC, которая широко экспрессируется в сердечных клетках, вызывает прямое фосфорилирование белка-ингибитора PP1, приводя к активации фосфатазы PP1, что в конечном итоге вызывает дефосфорилирование фосфоламбана. Фосфоламбан, потерявший остаток фосфорной кислоты, несущей отрицательный заряд, электростатически взаимодействует с SERCA-канальным комплексом, вызывая его ингибирование [Braz et al., 2004]. Вполне вероятно, что оба механизма (PKC – PP1 ингибитор – фосфоламбан и инактивация eNOS за счёт PKC-зависимого фосфорилирования по треонину-497), наряду с активацией выброса Са2+ из RyRs вносят вклад в повышение [Ca2+]in. Полученные данные вполне коррелируют с хорошо известным для сердечной мышцы PKC-зависимым отрицательным инотропным эффектом [Capogrossi et al., 1990; Braz et al., 2004]. Сама же тесная взаимосвязь уровня NO и [Ca2+]in указывает на важную роль eNOS для регуляции диастолической функции миокарда. Таким образом, мы полагаем, что как 2-ARs, так и I1Rs в кардиомиоцитах вовлекаются в процессы функционирования клеток, а управление их активацией/ингибированием является фармакологически значимым для кардиопротекции. На рис. 35 представлена предполагаемая схема событий, происходящих при стимуляции 2-ARs и I1Rs.

Функциональность 2-ARs у спонтанно-гипертензивных крыс (SHR)

Крысы линии SHR (spontaneously hypertensive rats, спонтанно-гипертензивные крысы) были выведены в 1963 году и давно используются как модель при изучении ряда сердечно-сосудистых заболеваний: гипертензии, гипертрофии миокарда, инсулиновой резистентности, гиперинсулинемии, гиперхолестеролемии [Okamoto, 1969; Swislocki and Tsuzuki, 1993]. Миокард SHR гипертрофирован и имеет увеличенную сократимость, однако не обладает признаками сердечной недостаточности. Плотность VGCC-токов и среднее значение амплитуды Са2+-спарков в сердечных клетках SHR повышены. Увеличение входящего Са2+-тока не связано с модификацией его кинетики, а увеличение Са2+-спарков не коррелирует с изменением плотности рианодиновых рецепторов, кальсеквестрина, SERCA или фосфоламбана [Shorofsky et. al., 1999]. Существенные изменения в регуляции процессов кальциевой сигнализации в сердечных клетках спонтанно-гипертензивных крыс представляют огромный интерес, поскольку они напрямую связаны с развивающимися в сердце патофизиологическими событиями. Выяснение механизмов модуляции этих процессов с целью дальнейшей коррекции фармакологическими препаратами является фундаментальной задачей, обладающей огромной практической ценностью. Поэтому, нами была исследована функциональность обнаруженных на сарколемме кардиомиоцитов 2-ARs и I1Rs у SHR.

Агматин в концентрациях 10, 100, 500 мкМ, 2, 10, 15 мМ дозо-зависимым образом снижал [Ca2+]in в спонтанно-активных кардиомиоцитах на 5.1 ± 4.9% (n = 6), 12.5 ± 5.7% (n = 7), 20.5 ± 7.6% (n = 6), 25.3 ± 8.7% (n = 8), 37.0 ± 7.4% (n = 6), 36.5 ± 8.5% (n = 12) относительно контрольного уровня. Сравнение кривых дозо-зависимого действия агматина на внутриклеточный уровень кальция в кардиомиоцитах нормотензивных крыс и SHR показывает, что его действие принципиально отличается (рис. 47): для действия агматина на клетки спонтанно-гипертензивных крыс отсутствует фаза реверсии, обусловленная I1Rs, а кривая дозо-зависимости имеет вид типичной сигмоиды. При этом, максимальный эффект при выходе кривой на плато почти вдвое меньше уровня снижения [Ca2+]in при выходе на плато кривой агматина для кардиомиоцитов нормотензивных крыс. Направленность действия агматина на [Ca2+]in в кардиоцитах SHR позволяет предполагать, что его эффекты в них реализуются исключительно за счёт 2-ARs.

Дальнейшие эксперименты были направлены на проверку вовлечённости 2-ARs в реализацию эффектов агматина у SHR. Для исследований была выбрана высокая концентрация агматина – 15 мМ. В кардиоцитах нормотензивных крыс эта концентрация приводила к запуску I1R – PC-PLC – DAG – PKC сигналинга, ингибированию eNOS и увеличению [Ca2+]in. Однако в экспериментах на SHR, миллимолярные дозы агматина оказались связаны с сигнальными путями, активируемыми 2-адренорецепторами. Так, раувольсцин, вортманнин и Akt-киназы ингибитор полностью предотвращали снижение [Ca2+]in агматином у SHR до 3.8 ± 5.1% (n = 9, p 0.05), 8.7 ± 4.4% (n = 8, p 0.05) и 5.4 ± 4.7% (n = 7, p 0.05), соответственно (рис. 48), против 36.5 ± 8.5% снижения в контроле, подтверждая принципиальность 2-AR – PI3K – Akt сигнального механизма для действия агматина. Эффект 15 мМ агматина также исчезал на фоне ингибирования eNOS соединением L-NIO, снижение на 1.9 ± 3.3% (n = 9, p 0.05, рис. 48), показывая, что именно эндотелиальная изоформа NO-синтазы является нижележащей (downstream) мишенью 2-ARs.

Для дополнительного подтверждения агматин-зависимой стимуляции eNOS через активацию 2-ARs в кардиомиоцитах SHR, мы прямо измерили продукцию оксида азота в изолированных клетках (рис. 49). 15 мМ агматина приводили к повышению уровня NO на 42.5 ± 6.6% (n = 8, p 0.05), которое предотвращалось на фоне раувольсцина (до 1.8 ± 2.2%, n = 7, p 0.05), вортманнина (до 2.5 ± 3.3%, n = 8, p 0.05), ингибитора Akt-киназы (до 4.4 ± 4.2%, n = 7, p 0.05) и L-NIO (до 0.8 ± 3.1%, n = 9, p 0.05).

Таким образом, действие миллимолярных доз агматина в кардиомиоцитах SHR было связано не с I1Rs, как у нормотензивных крыс, а с активацией 2-ARs и синтеза NO. Стоит отметить, что 2-ARs-опосредуемая продукция агматином оксида азота, наблюдаемая при действии низких концентраций агматина у нормотензивных крыс, была почти вдвое выше, чем у SHR. NO-зависимое снижение [Ca2+]in агматином у нормотензивных крыс было выражено гораздо существеннее, чем у спонтанно-гипертензивных, также примерно в два раза (рис. 47). Наблюдаемые результаты хорошо коррелируют с данными, полученными относительно работы NO-cGMP сигналинга в кардиомиоцитах SHR. Так, было показано, что в миокарде SHR снижена экспрессия eNOS [Bayraktutan et. al., 1998; Piech A. et. al., 2003]. При этом наблюдается компенсаторный механизм за счёт увеличения экспрессии нейрональной изоформы, nNOS, локализованной в SR [Massion et al., 2003; Piech et al., 2003]. Однако стоит полагать, что такая компенсация может быть неэффективной, поскольку молекула NO, фактически являясь свободным радикалом, обладает высокой реакционной способностью, может взаимодействовать со многими сотнями внутриклеточных мишеней и диффундирует только на небольшие расстояния [Balbatun et al., 2003]. Таким образом, действие NO реализуется очень локально, и его эффекты, главным образом, будут связаны с теми мишенями, которые находятся в непосредственной близости к месту его синтеза. Вероятно, NO, синтезируемый nNOS в SR, в меньшей степени способен приводить к активации cGMP – PKG сигнального каскада. Есть данные, что NO, продуцируемый nNOS ответственен за S-нитрозилирование RyRs, которое увеличивает утечку Са2+ в цитоплазму, что приводит к Са2+-перегрузке и аритмогенным эффектам [Gonzalez et al., 2007].

Кроме того, в сердцах SHR было обнаружено почти двукратное снижение экспрессии SERCA [Dupont et al., 2012], что приводило к сниженному закачиванию Са2+ в депо, и могло лежать в основе нарушений сократимости миокарда, наблюдаемых у спонтанно-гипертензивных крыс. Мы решили исследовать обнаруженный в кардиомиоцитах нормотензивных крыс NO – SERCA-зависимый путь снижения [Ca2+]in в цитозоле, путём аппликации прямого NO-донора – соединения SNAP. На рис. 50 представлено типичное действие SNAP на спонтанные Са2+-волны, наблюдаемые в кардиомиоцитах нормотензивных крыс и SHR.

Как и предполагалось, снижение [Ca2+]in гуанабенцем в кардиомиоцитах SHR было существенно менее выраженным, чем у нормотензивных крыс. Так, например, концентрация 50 мкМ снижали средний уровень Са2+ на 27.6 ± 5.6% (против 64.9 ± 11.2% у нормотензивных животных), что подтверждает сниженную функциональность 2-ARs у спонтанно-гипертензивных крыс. Это снижение, по-видимому, связано с подавлением (down-regulation) NO-сигналинга и суммарной SERCA-активности по утилизации цитозольного Са2+. Вероятно, это может иметь значение для развития у SHR адренергического стресса, запускающего развитие нефункциональной гипертрофии миокарда и увеличение систолического кровяного давления уже в молодом возрасте (с 4-ой недели). 2-адренорецепторы, функционируя, как отрицательная обратная связь для катехоламин-стимулирующих влияний на сердце представляются важной фармакологической мишенью для компенсации нарушений Са2+-гомеостаза при начинающей гипертензии, гипертрофии или сердечной недостаточности.