Введение к работе
Актуальность проблемы. Развитие промышленного производства усиливает воздействие на окружающую среду, и это, в первую очередь, отражается на состоянии водоемов и почв. Одновременно с интенсификацией того или иного производства увеличиваются и объёмы жидких промышленных и бытовых отходов. Хорошо известно экотоксичное воздействие хлор- и фосфорорганических пестицидов, нефтепродуктов, производных тяжелых металлов на природные биологические объекты. Разработка эффективных методов анализа состояния объектов окружающей среды, включая проведение постоянного мониторинга качества воды и состояния почв, становится особенно актуальной.
Получение информации о наличии экотоксикантов в режиме реального времени прежде всего в воде позволяет своевременно выявлять загрязнения и принимать меры по их ликвидации. В этой связи разработка подходов к созданию технологий экспресс-определения токсичности водных образцов в проточных аналитических системах является особенно актуальной. Также важной является возможность проведения экомониторинга состояния почв без проведения сложной пробоподготовки.
В настоящее время для проведения анализа состава природных сред на наличие экотоксикантов используются разнообразные физико-химические и биологические методы. Первая группа методов дает оценку концентрации загрязнителей с высокой точностью и чувствительностью, однако вследствие проведения многоэтапной пробоподготовки и применения специального оборудования получение информации о наличии токсичных веществ в режиме реального времени с помощью данных методов является проблематичным. Устранение указанных недостатков представляется возможным при использовании биологических методов индикации экотоксикантов, основанных на применении биоиндикаторов (БИ) - живых организмов, способных давать специфический ответ на присутствие в среде экотоксикантов. Значительным преимуществом БИ является их способность реагировать на широкий спектр экотоксикантов различных классов, в то время, как физико-химические методы анализа узкоспецифичны, и при наличии сложной анализируемой матрицы требуется применение более чем одной методики анализа.
Среди широкого спектра БИ эффективными для использования признаны клетки микроорганизмов - микроводорослей и фотобактерий. В основе функционирования данных БИ лежат изменения параметров флуоресценции хлорофилла (для клеток микроводорослей) или параметров биолюминесценции бактериальной люциферазной системы (для клеток
фотобактерий) в результате воздействия экотоксикантов на клетки микроорганизмов.
Стабилизация характеристик клеток микроорганизмов при их применении в аналитических целях с обеспечением их удержания и эффективным функционированием в течение длительного времени в проточных системах достигается иммобилизацией клеток БИ с использованием разнообразных носителей.
Вместе с тем, пока нет четких критериев выбора характеристик и состава носителя для иммобилизации биоиндикаторов, метода и условий иммобилизации клеток, включая подготовку клеток к иммобилизации -накопление биомассы, подлежащей иммобилизации, в которой максимально сохранена целостность и метаболическая активность клеток.
Разработка новых биочувствительных элементов (БЭ) в виде иммобилизованных клеток микроводорослей или фотобактерий, подбор носителей для иммобилизации с целью достижения высокой эффективности функционирования клеток микроорганизмов, особенно в проточной среде, являются актуальными как для биотехнологии получения таких БЭ, так и для экологической биофизики, устанавливающей общие закономерности влияния физико-химических условий проведения анализа на аналитические и кинетические характеристики иммобилизованных клеток при определении экотоксикантов. Кроме того, разработка новых БЭ необходима для того, чтобы заполнить ниши фундаментальных знаний о свойствах иммобилизованных клеток, а также получить представление о возможности оптимизации условий получения такого рода систем, позволяющих повысить их чувствительность (порог определения) по отношению к соответствующим загрязнителям.
Основной целью данной работы являлась разработка биочувствительных элементов в виде иммобилизованных клеток микроводорослей (MB) и фотобактерий, позволяющих определять в проточных системах присутствие экотоксикантов в концентрациях ниже предельно допустимых (ПДК), и исследование операционных характеристик БЭ при их использовании в различных условиях.
В работе решались следующие основные задачи:
- разработка биотехнологических подходов к получению БЭ в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта (ПВС) клеток микроорганизмов на основе клеток микроводорослей Chlorella species, Thalassiosira weissflogii, а также фотобактерий Photobacterium phosphoreum;
исследование биофизических параметров и операционных характеристик БЭ в виде иммобилизованных клеток микроорганизмов (интенсивность и стабильность аналитического сигнала иммобилизованных клеток при хранения и мониторинге экотоксикантов; температурные диапазоны применения иммобилизованных клеток);
оценка кинетических параметров взаимодействия клеток микроорганизмов с экотоксикантами и нижних пределов обнаружения экотоксикантов, обоснование возможности повышения чувствительности БЭ для детекции соответствующих загрязнителей.
Научная новизна работы.
На основе применения методов кибернетики предложено для описания биохимической реакции взаимодействия клеток фотобактерий с экотоксикантами использовать модель изотермического реактора идеального вытеснения. Получено кинетическое уравнение изменения концентрации активных клеток фотобактерий в ячейке в ходе биохимической реакции с экотоксикантом.
Впервые установлено удельное количество активных молей различных классов экотоксикантов, приводящее к тушению биолюминесценции клетки фотобактерий. Показано, что повышение чувствительности клеток фотобактерий к экотоксикантам достигается уменьшением удельного количества активных молей экотоксикантов.
В биофизических исследованиях клеток фотобактерий родов Photobacterium и Vibrio, иммобилизованных в криогель ПВС впервые обнаружено явление смещения в сторону более коротких длин волн пика интенсивности биолюминесценции клеток фотобактерий.
Установлено, что иммобилизация малых концентраций (до 10%) клеток микроводорослей Chlorella sp. и Т. weissflogii в криогель ПВС путем включения клеток в матрицы носителя при ее формировании в условиях отрицательных температур приводит к повреждению фотосинтетического аппарата (ФСА) клеток микроводорослей.
Предложен новый метод иммобилизации клеток микроводорослей Chlorella sp. и Thalassiosira weissflogii введением клеток микроорганизмов в сформированную матрицу носителя, позволяющий избежать повреждения ФСА клеток микроводорослей, наблюдаемого при формировании матрицы носителя в условиях отрицательных температур.
Практическая значимость работы.
Впервые для достижения наилучших условий формирования БЭ обоснованы биотехнологические параметры получения БЭ на основе клеток фотобактерий и микроводорослей, иммобилизованных в криогель ПВС, для определения присутствия экотоксикантов в природных средах.
Предложен новый метод иммобилизации клеток микроводорослей, введением клеток микроорганизмов в сформированную матрицу носителя - криогель ПВС, под действием центробежных сил при центрифугировании.
Предложены конкретные составы БЭ на основе клеток микроорганизмов (микроводорослей Chlorella sp. и Т. weissflogii и фотобактерий P. phosphoreum) для определения в природных средах присутствия экотоксикантов в концентрациях ниже ПДК.
Обоснованы оптимальные условия хранения БЭ, позволяющие стабилизировать высокий уровень аналитического сигнала иммобилизованных клеток:
хранение БЭ на основе клеток фотобактерий свыше 50 недель при температуре -80С не приводит к значительной потере аналитических характеристик;
хранение БЭ на основе клеток микроводорослей свыше 30 суток в оптимизированных условиях освещения (интенсивность и соотношения длительности фаз «свет : темнота») не приводит к значительному снижению величины аналитического сигнала.
Обоснованы оптимальные условия функционирования
разработанных БЭ при определении присутствия экотоксикантов (температурные режимы, скорости протока среды, для клеток микроводорослей - режимы внешнего освещения).
Личный вклад автора. В ходе исследования автором лично производилось планирование экспериментов, статистическая обработка экспериментальных данных, оформление результатов работы, а также подготовка научных публикаций по результатам работы и участие с докладами на научных конференциях.
Автором самостоятельно разработан подход к моделированию биохимической реакции взаимодействия иммобилизованных клеток фотобактерий с экотоксикантами в ячейке и предложена математическая модель, описывающая данный процесс в условиях проточной водной среды.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийских и Международных конференциях: II и III Международных конференциях «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, Россия, 2008, 2009); VIII, XIX, X, XI ежегодных международных молодежных конференциях ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, Россия, 2008, 2009, 2010, 2011); Итоговых конференциях по результатам выполнения мероприятий за 2008 и 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы»
ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 - 2012 годы», (Москва, Россия, 2008, 2009); Международных конференциях «Сотрудничество для решения проблемы отходов» (Харьков, Украина, 2009, 2011); Международной конференции «Biocatalysis-2009: Fundamentals & applications» (Архангельск, Россия, 2009); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, Россия, 2009); Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, Россия, 2010); 14-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, Россия, 2010); Международной научно-практической конференции «Юность за экологический прогресс» (Баку, Азербайджан, 2010); Ш-й Международной научно-практической конференции «Научно-техническое творчество молодежи - путь к обществу, основанному на знаниях» (Москва, Россия, 2011). Положения, выносимые на защиту.
-
Биочувствительные элементы в виде иммобилизованных клеток фотобактерий или MB для определения различных классов экотоксикантов в водных проточных средах. Способы получения и составы БЭ.
-
Кинетические и операционные характеристики взаимодействия БЭ с экотоксикантами.
-
Математическая модель, описывающая биохимическую реакцию иммобилизованных клеток фотобактерий с экотоксикантами в ячейке в условиях проточной водной среды.
Публикации. По материалам диссертации представлено 20 публикаций, из них: 2 статьи в международных журналах, входящих в списки цитирования ВАК, 2 Патента РФ на изобретение, 16 тезисов докладов в материалах Международных и Всероссийских конференций, симпозиумов и конгрессов.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 177 ссылок. Работа изложена на 153 страницах, содержит 41 рисунок и 39 таблиц.
