Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 7
I. Мезенхимные стромальные клетки 7
1.1. История изучения МСК 7
1.2. Идентификация и культивирование МСК 9
1.3. Мультипотентность МСК 10
1.4. Участие МСК в регенерации тканей 11
1.5. Участие МСК в формировании ниши тканеспецифических стволовых клеток 11
II. Внутриклеточная кальциевая сигнализация 12
11.1. Общие представления о внутриклеточной кальциевой сигнализации 12
11.2. Кальциевые каналы плазматической мембраны 14
11.3. Кальциевые каналы мембран кальциевых депо 15
11.4. Кальциевые насосы внешней и внутренних мембран клетки. 18
11.5. Кальциевая сигнализация в мезенхимных стромальных клетках 18
III. Адренергическая сигнальная система 19
111.1. Краткая история исследования адренергических рецепторов 19
111.2. Классификация адренергических рецепторов и активируемые ими сигнальные пути 21
111.3. Адренергические рецепторы в МСК 24
111.4. Направленный агонизм 24
IV. Пуринэргическая сигнальная система 26
IV.1. Аденозиновые (Р1) рецепторы 28
IV.2. Р2-рецепторы 28
IV.3. Пуринергическая сигнализация в МСК 31
Материалы и методы исследования 34
1. Выделение МСК из жировой ткани и их культивирование 34
2. Подготовка клеток к эксперименту 34
3. Методика и экспериментальная установка для микрофотометрии 35
4. Методика и экспериментальная установка для фотолиза химических групп (uncaging) 35
5. Стимуляция клеток агонистами з
6. Статистическая обработка данных 37
7. Методика иммунофлуоресцентного окрашивания 37
8. ОТ-ПЦР 37
Результаты и их обсуждение 40
I. Функциональная гетерогенность МСК 40
II. Механизм генерации МСК Ca2+ ответов на норадреналин 42
11.1. Фосфоинозитидный трансдукциооный каскад в ответах МСК на норадреналин 43
11.2. Зависимость ответов МСК на норадреналин от его концентрации 46
11.3. Усиление Ca2+-ответа МСК на норадреналин с помощью Ca2+-индуцированного выброса Ca2+ из внутриклеточных депо 48
11.4. Роль IP3- и рианодиновых рецепторов в генерации ответов МСК на норадреналин 52
11.5. Типы адренорецепторов, обеспечивающие чувствительность МСК к норадреналину 54
11.6. Предполагаемый механизм генерации ответов МСК на норадреналин 58
III. Механизм генерации МСК Са2+ ответов на ATP 59
111.1. Типы пуринорецепторов, обеспечивающие чувствительность МСК к ATP 59
111.2. Фосфоинозитидный трансдукционый каскад в ответах МСК на ATP 62
111.3. Зависимость амплитуды ответов МСК на ATP от его концентрации 63
111.4. Усиление Ca2+-ответа МСК на ATP с помощью Ca2+-индуцированного выброса Ca2+ из внутриклеточных депо 64
111.5. Роль IP3- и рианодиновых рецепторов в генерации ответов МСК на скачкообразное повышение концентрации внутриклеточного Ca2+ 66
111.6. Предполагаемый механизм генерации ответов МСК на ATP 67
Заключение 68
Выводы 71
Список использованных сокращений 72
Список литературы 73
- Идентификация и культивирование МСК
- Кальциевая сигнализация в мезенхимных стромальных клетках
- Подготовка клеток к эксперименту
- Роль IP3- и рианодиновых рецепторов в генерации ответов МСК на норадреналин
Введение к работе
Актуальность проблемы
Мезенхимные стромальные клетки (МСК) представляют собой
недифференцированные мультипотентные клетки, популяция которых
поддерживается за счет пролиферации, и которые способны
дифференцироваться в клетки как минимум костной, хрящевой и жировой
тканей (Caplan, 2007; Dominici et al., 2009; Kalinina et al., 2011). МСК могут
быть выделены из многих тканей взрослого организма, однако основными их
источниками служат костный мозг и жировая ткань.
МСК обладают высоким терапевтическим потенциалом, и исследование различных аспектов их жизнедеятельности представляет несомненный академический и практический интерес. Большинство работ по исследованию МСК посвящены оценке их трансплантационного потенциала, исследованию механизмов, инициирующих и направляющих их дифференцировку, или анализу возможности управлять этими процессами in vitro. Гораздо меньшее внимание уделяется фундаментальным исследованиям сигнальных процессов в этих клетках. В силу этого существующие представления о рецепторных и сигнальных системах МСК весьма ограничены. Между тем естественно полагать, что межклеточные и внутриклеточные коммуникации, паракринные и аутокринные регуляции, вовлекающие различные сигнальные молекулы и рецепторные системы, должны играть ключевую роль в физиологических процессах, детерминирующих жизнедеятельность МСК. Исследования Ca2+ сигнализации в МСК представлены единичными работами и касаются изучения спонтанных кальциевых осцилляций и участия внешнего кальция в развитии МСК (Ye, 2010). Тогда как более актуальным представляется изучение индуцированной Ca2+ сигнализации, в том числе, агонистами различных рецепторов, т.к. среди них могут оказаться агенты, контролирующие пролиферацию МСК и запускающие их дифференцировку (Doze, Perez, 2012), что представляет несомненный практический интерес. В данной работе исследовалась Ca2+ сигнализация, инициируемая пуринергическими и адренергическими агонистами в цитоплазме МСК, выделенных из жировой ткани человека.
Пуринергическая сигнальная система была выбрана нами в связи с тем, что повреждение тканей ассоциируется с выбросом большого количества ATP во внеклеточную среду, который может стимулировать МСК, мигрирующие в зону повреждения. Поэтому можно ожидать, что пуринергическая сигнальная система является естественной частью системы регуляции клеточных функций МСК. Адренергическая система привлекла наше внимание, поскольку
продемонстрировано, что МСК костного мозга пространственно
ассоциированы с адренергическими нервными волокнами (Mendez-Ferrer et al, 2010), а физиологические процессы во многих периферических тканях, в клетки которых могут дифференцироваться МСК, модулируются адреналином и норадреналином. Немаловажным обстоятельством было также то, что пуринергические и адренергические агонисты стимулируют Ca2+ сигнализацию ( 2015), и поэтому их трансдукцию можно анализировать с использованием эффективного метода микрофотометрии (Ca2+-imaging).
Цели и задачи исследования
Целью данной работы было изучение пуринергической и
адренергической сигнальных систем МСК в части, касающейся идентификации типов пурино- и адренорецепторов, функционирующих в МСК, а также анализа механизмов сопряжения этих рецепторов с мобилизацией внутриклеточного Са2+.
В рамках сформулированной цели были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать пуринергическую сигнальную систему МСК. Выяснить, какие типы пуринорецепторов обеспечивают чувствительность МСК к экстраклеточным нуклеотидам, и исследовать механизм сопряжения этих рецепторов с клеточными ответами.
-
Исследовать адренергическую сигнальную систему МСК. Выяснить, какие типы адренорецепторов функционируют в МСК, и проанализировать механизмы, обеспечивающие генерацию Са2+ ответов при стимуляции МСК адренергическими агонистами.
Научная новизна
В настоящей работе проведены пионерские исследования
пуринергической и адренергической сигнальных систем на уровне одиночных
МСК, выделенных из жировой ткани человека. Впервые показано, что Са2+
ответы на адренергические и пуринергические агонисты генерируются МСК по
принципу «все или ничего». Этот феномен объясняется тем, что
адренергическая и пуринергическая трансдукции протекают в две стадии. На
первом этапе происходит генерация Са2+ сигнала агонист-зависимым образом,
который затем усиливается по механизму Са2+-индуцированного Са2+ выброса
до максимальной амплитуды, где роль Са2+ триггера выполняют IP3 рецепторы.
Впервые показано, что P2Y1, P2Y2 и P2Y4 являются основными типами
пуринорецепторов МСК, вовлеченными в мониторинг экстраклеточных
нуклеотидов. Установлено, что среди 1B-, 2A-, и 2-адренорецепторов,
экспрессирующихся в МСК, преимущественно 2A-адренорецептор
ответственен за генерацию Са2+ ответов клеток на норадреналин.
Научно-практическая значимость работы
Проведенные исследования значительно расширяют существующие
представления о рецепторных и сигнальных системах МСК и детализируют
механизмы внутриклеточной Са2+ сигнализации, инициируемой
пуринергическими и адренергическими агонистами в цитоплазме этих клеток. Учитывая высокий терапевтический потенциал МСК, полученные в работе результаты могут быть использованы для отбора и/или потенциации МСК для целей регенеративной медицины.
Апробация работы
Основные результаты диссертации были представлены на
международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2012, 2013, 2014, 2015), на международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2013, 2015), на IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012), на V всероссийской научно-практической конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2013), на IV съезде физиологов СНГ (Сочи – Дагомыс, 2014).
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 91 страницах, содержит 28 рисунков и 4 таблицы. Список литературы включает 234 источников отечественной и зарубежной литературы.
Идентификация и культивирование МСК
Клетки способны передавать сигнал о присутствии во внешней среде первичных посредников (гормоны, нейромедиаторы, фотоны света, обонятельный или вкусовой стимул, механическое воздействие и д.р.) посредством вторичных посредников - физиологически активных регуляторных молекул, образующихся, входящих или высвобождаемых в цитоплазму клеток, в ответ на взаимодействие клетки с первичным стимулом. Среди молекул самыми распространенными вторичными посредниками являются cAMP, cGMP, инозитол-1,4,5-трифосфат (IP3), диацилглицерин и др., кальций же является единственным ионом среди универсальных вторичных посредников. Передача внутриклеточного сигнала с помощью Ca2+ в роли вторичного посредника и называется кальциевой сигнализацией.
Ca2+ обладает всеми свойствами, необходимыми для выполнения функций посредника во внутриклеточной сигнализации. По своим физико-химическим свойствам Ca2+ больше всех остальных ионов подходит на роль вторичного посредника. В отличие от анионов, обладающих большими размерами, и ионов K+ и Na+, обладающих единичным зарядом, ионы Ca2+, имеют небольшой размер, легче формируют прочные связи с молекулами белка. Также Ca2+ способен образовывать до девяти координатных связей с лигандами, тогда как Mg2+, схожий с Ca2+ по вышеописанным характеристикам, образует максимум шесть, причем часть из них идет на взаимодействие с молекулами воды, что еще сильнее уменьшает сродство Mg2+ к белкам. (Левицкий, 1990) Также связи, образуемые Ca2+, более вариабельны по длине, например длина связи Са-О варьируется от 0,23 до 0,26 нм, тогда как длина связи Mg-О всегда составляет 0,21 нм, что позволяет Ca2+ «подстраиваться» под предоставляемый молекулой белка участок связывания и замещаться в нем в сотни раз быстрее Mg2+.
Биологические свойства Ca2+ делают его еще более незаменимым для роли вторичного посредника. Ca2+ широко распространен как в клетке, так и во внеклеточной среде. В клетке существует отлаженная система транспорта Ca2+. Также известно, что на поддержание неравновесного распределения между клеткой и средой для большинства ионов тратится 20-30% энергии клетки, тогда как на поддержание Ca2+-гомеостаза затрачивается 1%.
В состоянии покоя в цитоплазме клеток концентрация Ca2+ низка и поддерживается на уровне приблизительно 200 нМ, тогда как в межклеточной среде она составляет приблизительно 2 мМ. Для генерации Ca2+ сигналов клетки используют как наружный Ca2+, так и Ca2+, запасенный во внутриклеточных депо. Внутриклеточный кальций условно можно разбить на три пула: свободный (свободные ионы кальция в цитоплазме), связанный (цитоплазматический кальций, связанный различными хелаторами) и кальций, аккумулированный внутри клеточных органелл (Berridge, 1995). В роли цитоплазматических хелаторов, связывающих Са2+, выступают фосфаты, ряд органических кислот, нуклеотиды, многочисленные Са2+-связывающие белки (например, кальмодулин) и фосфолипиды, что позволяет говорить о существовании Са2+ буфера в цитоплазме, хотя его буферная емкость относительно невелика (Костюк, 1986; Левицкий, 1990). Основным внутриклеточным кальциевым депо является эндо-/саркоплазматический ретикулум, хотя другие органеллы, такие как митохондрии, цистерны комплекса Гольджи и др., также вовлечены в поддержание кальциевого гомеостаза в цитоплазме (Крутецкая, Лебедев, 1992).
Ионы кальция являются одними из самых распространенных вторичных посредников, регулирующих огромное количество различных процессов, Са2+ опосредует действие более 100 нейротрансмиттеров и гормонов и регулирует самые различные клеточные функции, такие как метаболизм, секреция, возбудимость, сократимость, развитие и апоптоз (Berridge, 1995; Berridge et al., 2000). При такой невероятной универсальности Са2+-сигналов существует проблема разделения большого количества процессов, опосредуемых Са2+. Пространственное разделение осуществляется за счет многокомпонентной системы мембранного транспорта Са2+, обеспечивающей эффективные и тонкие механизмы регуляции уровня Са2+ в клетке, однако Са2+ сигналы способны также принимать глобальный характер, в этом случае возбуждение в виде Са2+ волн охватывает всю цитоплазму клетки (Berridge et al., 2000). Проблема временного разрешения решается способностью Са2+-системы функционировать в широком динамическом диапазоне. Так, Са2+ способен активировать экзоцитоз в синаптических окончаниях за микросекунды, а мышечное сокращение за миллисекунды, тогда как для таких процессов как транскрипция генов и пролиферация клеток Са2+ способен действовать на протяжении минут и часов. Эта многообразность механизмов зависит от того какие из инструментов Са2+-сигнализации будут использованы, и разные типы клеток обладают различными наборами этих инструментов (Berridge, 2012). Спектр существующих инструментов Са2+-сигнализации крайне широк и включает в себя: Са2+-каналы плазматической мембраны, ответственные за вход Са2+ в клетку извне Са2+-каналы мембран эндо- и саркоплазматических ретикулумов, ответственные за выход Са2+ из внутриклеточных Са2+-депо Са2+-насосы внешней и внутренних мембран клетки, ответственные за поддержание низкой концентрации Са2+ в цитоплазме клетки в состоянии покоя Са2+-связывающие белки, служащие буфером Са2+ как в цитоплазме, так и в люмене Са2+-депо II.2. Кальциевые каналы плазматической мембраны Ca2+-каналы плазматической мембраны подразделяются на три группы, основываясь на механизмах, контролирующих их активность: потенциал-зависимые, рецептор-управляемые и каналы, активирующиеся опустошением ретикулулярных кальциевых депо.
Потенциал-зависимые Ca2+-каналы В электоровозбудимых клетках потенциал-зависимые Ca2+-каналы (VOCC - voltage operated Ca2+ chennels) играют основную роль в обеспечении входящего в цитоплазму потока Ca2+, однако Ca2+-каналы других типов также могут принимать участие в переносе Ca2+. Активация потенциал-зависимых Ca2+-каналов происходит при деполяризации мембраны, тогда как при потенциале покоя (-60-70 мВ) эти каналы остаются неактивными. Идентифицировано несколько типов потенциал-зависимых Ca2+-каналов (L-,T-, N-, P-, Q-, R типа), отличающихся друг от друга фармакологическими и электрофизиологическими свойствами. Активность потенциал-зависимых Ca2+-каналов плазмалеммы может регулироваться непосредственно G-белками (Dolphin, 2003), вторичными посредниками (cAMP, cGMP) (Kraus-Friedmann, 2000), протеинкиназами A, G, C, возможна также регуляция арахидоновой кислотой и ее метаболитами.
Кальциевая сигнализация в мезенхимных стромальных клетках
Выделение МСК проводили сотрудники кафедры биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова по стандартной методике (Zuk et al., 2001). МСК человека выделяли из подкожной жировой клетчатки здоровых доноров (возраст от 31 до 50 лет, n = 38). Жировую ткань измельчали и смешивали с растворами ферментов коллагеназы I типа (200 ед/мл) (Worthington, США) и диспазы (40 ед/мл) (Sigma, США) в соотношении объема ткани к объему ферментативного раствора 1 : 2. Суспензию инкубировали при 37С в течение 30–60 мин, периодически встряхивали. Затем к полученной суспензии для инактивации ферментов добавляли равный объем среды Advance Stem (HyClone, США), содержащей 10% Advance Stem Supplement (HyClone), и центрифугировали при 200 g 10 мин. Супернатант и верхнюю фракцию адипоцитов удаляли. Осадок ресуспендировали и лизировали эритроциты. Полученную суспензию фильтровали через нейлоновые фильтры с размером пор 100 мкм (BD Bioscience, США). Клетки ресуспендировали в среде роста (см. ниже), высаживали в чашки Петри в количестве 100 тыс. клеток/мл и инкубировали при 37С, 5% СО2. На следующий день меняли среду для удаления неприкрепленных клеток. Выделенные МСК культивировали на пластиковых чашках Петри (Corning, США) и/или в 12-луночном планшете в среде роста: Advance Stem (HyClone) с 10% Advance Stem Supplement (HyClone), 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина. При достижении 80% монослоя клетки пассировали. Клетки обрабатывали раствором Версена (Sigma-Aldrich, США) и HyQTase Cell Detachment Solution (HyClone), а затем рассаживали в соотношении 1 : 3. Клетки 1 – 2 пассажей транспортировали в нашу лабораторию, где их продолжали культивировать для проведения экспериментов. В экспериментах использовали МСК 2 – 4 пассажей.
Перед экспериментом клетки культивировали в 12-луночный планшет в среде роста (см. выше) без антибиотика в течение 12 ч. Затем клетки двукратно промывали раствором Версена (Sigma-Aldrich). Для отделения от субстрата клетки инкубировали 2 – 3 мин в 150 мкл фермента HyQTase (HyClone) при 37 С. Фермент ингибировали добавлением 800 мкл полной ростовой среды, клетки ресуспендировали и помещали в пробирку для центрифугирования. Клетки осаждали центрифугированием при 50 g в течение 45 с. Клетки прикрепляли с помощью Cell Tak (BD Biosciences, США) на дно фотометрической камеры, представляющей собой покровное стекло (Menzel-Glaser, Германия) с пластиковыми бортиками, и затем загружали флуоресцентным Ca2+-зондом Fluo-4. Для этого клетки инкубировали при комнатной температуре (23–25 С) в присутствии проникающего аналога Fluo-4AM (4 мкМ) и детергента Pluronic (0.02%) (оба Molecular Probes, США) 20 мин, в течение которых гидролиз внутриклеточными эстеразами ацетоксиметиловой группы Fluo-4AM продуцировал остаточное количество Fluo-4. Затем клетки при 4 С в течение 40 мин отмывали внеклеточным раствором.
Состав внеклеточного раствора (мМ): 110 NaCl, 5.5 KCl, 2 CaCl2, 0.8 MgSO4, 10 HEPES, 10 глюкоза (все Sigma-Aldrich).
Эксперименты проводили с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 135 (Zeiss, Германия), оборудованного объективом Plan NeoFluar 20x/0.75 и цифровой ECCD камерой LucaR (Andor Technology, США). Помимо осветителя проходящего света микроскоп был оборудован оптоволоконным осветителем для освещения через объектив. Один из входов бифуркационного оптического волокна соединяли с осветителем на сверхъярких диодах (340–535 нм) (Хохлов, 2007) для возбуждения флуоресценции. Флуоресценцию клеток, нагруженных Fluo-4, возбуждали на длине волны 480 ± 5 нм, а эмиссию регистрировали в области 535 ± 20 нм. Каждые 0.5 секунды регистрировали последовательные флуоресцентные изображения. Изменение концентрации цитозольного кальция в индивидуальных клетках оценивали по относительному изменению интенсивности флуоресценции целой клетки (F/F0). Количественный фотометрический анализ изображений осуществляли с использованием программы Imaging Workbench 6 (INDEC, США).
Экспериментальная камера была оборудована системой перфузии, позволяющей производить быструю смену содержащегося в ней раствора. Агонисты, ингибиторы и антагонисты разводили до необходимой концентрации внеклеточным раствором. Стумуляцию клеток различными агонистами проводили по следующей схеме: в течение 300 секунд с начала эксперимента регистрировали базовый уровень флуоресценции клеток, находящихся во внеклеточном растворе, на 300 секунде проводили аппликацию агониста, заменяя внеклеточный раствор на раствор агониста, через 100 – 200 секунд агонист отмывали путем трехкратной замены раствора агониста на внеклеточный. Повторная стимуляция агонистом проводилась через 300 секунд, чувствительными к агонисту считали клетки, генерирующие специфический Ca2+-ответы на него как минимум два раза подряд. В экспериментах, где требовалось снизить содержание свободного Ca2+ во внешнем растворе с 2 мМ до 260 нМ, 2 мМ CaCl2 заменяли на 0.5 мМ EGTA + 0.4 мМ CaCl2. Исследование влияния различных ингибиторов и антагонистов на генерацию клетками Ca2+-ответов на агонист проводилось по следующей схеме: за 200 секунд до подачи агониста внеклеточный раствор заменяли раствор, содержащий ингибитор/антагонист, об эффективности ингибитора/антагониста судили по способности клеток в его присутвии генерировать ответ на агонист
Подготовка клеток к эксперименту
Представленные данные свидетельствуют о том, что именно IP3 рецепторы ответственны за генерацию Ca2+-индуцированного выброса Ca2+. Это подкрепляется данными Kawano (Kawano et al., 2002), который в своих работах не выявил экспрессию рианодиновых рецепторов в МСК, выделенных из костного мозга человека, однако обнаружил в них транскрипты всех трех известных изоформ IP3 рецепторов. На первый взгляд, имеется некоторое противоречие в том, что IP3-рецепторы являются ключевыми элементами обеих стадий генерации ответа на норадреналин, то есть генерации градуального Ca2+ сигнала и его усиления путем CICR. Отметим, что существует три типа IP3 рецепторов (Foskett et al., 2007), характеризующихся различной чувствительностью к IP3 и Ca2+. Вполне возможно, что первая и вторая стадии генерации ответа разделены пространственно, что позволяет вовлекать различные типы IP3 рецепторов на различных стадиях генерации сигнала. Разделение функций IP3 рецептора в едином сигнальном процессе может также обеспечиваться тем, что все три его изоформы могут Ca2+ зависимым образом стимулироваться Ca2+ связывающим белком CIB1 даже в отсутствие IP3 (Kiselyov et al., 2003; White et al., 2006). Это означает, что Ca2+ индуцированный выброс Ca2+ через IP3 рецептор в определенных случаях может не требовать генерации IP3.
Помимо изучения механизмов генерации ответов, необходимо было выяснить, какие именно типы адренорецепторов обеспечивают чувствительность МСК к норадреналину. Для этого мы провели анализ экспрессии генов адренорецепторов с помощью обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) и ген-специфических праймеров. Все исследованные образцы РНК содержали транскрипты 1B-, 2A- и 2-адренорецепторов, а так же CD73, CD90 и CD105 (Рисунок 15A), которые на данный момент считаются маркерами МСК.
Экспрессия в МСК 1- и 2-адренорецепторов также была подтверждена методом иммуногистохимии с использованием специфических антител. Все проанализированные образцы МСК (n=7) содержали небольшую (2 - 4%) субпопуляцию клеток, демонстрирующих 1- и 2- иммунореактивность (Рисунок 15B, C). На рисунке 15B, C видно, что из всех клеток, ядра которых окрашены DAPI, только единичные клетки в поле зрения обладают зеленой иммунофлуоресценцией: две клетки содержат 1-адренорецепторы (Рисунок 15B) и три клетки содержат 2-адренорецепторы (Рисунок 15C). Рисунок 15. Специфическая экспрессия адренорецепторов в МСК.
Известно, что 1-адренорецепторы повсеместно вовлечены в Ca2+-сигнализацию (Cotecchia, 2010), также к настоящему времени показано, что и 2-адренорецепторы способны активировать фосфолипазу С и, соответственно, вызывать Ca2+-сигнал (Cottingham et al., 2011). Таким образом, инициировать Ca2+-сигнал в ответ на норадреналин могут как 1-, так и 2-адренорецепторы. -адренорецепторы, напротив, обычно сцеплены с G-белками, активирующими аденилатциклазу (Lynch, Ryall, 2008), и не должны участвовать в генерации Ca2+-ответа на норадреналин. Оставалось неясным, экспрессируются ли все эти типы адренорецепторов в одной клетке, или же отдельные субпопуляции МСК специфически экспрессируют какой-то из этих рецепторов. Для ответа на этот вопрос мы провели ряд физиологических экспериментов с использованием специфических агонистов и антагонистов 1-, 2- и -адренорецепторов. 35 норадреналин-чувствительных клеток было исследовано на чувствительность к агонистам 1-адренорецепторов (Phenylephrin и/или Cirazoline) и антагонисту 1-адренорецепторов (Prazosin), а также к агонистам 2-адренорецепторов (Guanabebz и/или B-HT 933) и антагонисту 2-адренорецепторов (Yohimbine). Все норадреналин-чувствительные клетки генерировали Ca2+-ответы на агонисты 2-адренорецепторов, антагонист же 2-адренорецепторов полностью подавлял ответы на норадреналин. 17% клеток были чувствительны и к агонистам 1-адренорецепторов, антагонист же 1-адренорецепторов не блокировал ответы на норадреналин (Рисунок 16).
Репрезентативные регистрации ответов одиночных МСК, демонстрирующие чувствительность МСК к различным специфическим агонистам и антагонистам адренорецепторов. A, B – типичная МСК с функционирующими 2-адренорецепторами. C – типичная МСК с функционирующими 1-адренорецепторами и 2-адренорецепторами. Совокупность физиологических и молекулярнобиологических данных (Рисунок 15, 16) указывает на то, что 2A-адренорецепторы играют доминантную роль в генерации МСК Ca2+-ответов на норадреналин, хотя в небольшой популяции МСК в трансдукцию адренергического сигнала вовлечены и 2A-, и 1B-адренорецепторы.
Оставалось выяснить, играют ли какую-либо роль в генерации МСК Ca2+-ответов на норадреналин 2-адренорецепторы, обычно несопряженные с Ca2+-сигнализацией. Роль 2-адренорецепторов исследовали с помощью агониста и антагониста -адренорецепторов (Isoproterenol и Alprenolol соответственно). Агонист -адренорецепторов почти не влиял на уровень Ca2+ в покое и незначительно модулировал ответы МСК на норадреналин (n=9) (Рисунок 17). Однако действие антагониста 2-адренорецепторов было весьма неожиданным: в присутствии альпренолола адренергические МСК теряли способность генерировать ответы на норадреналин, которая восстанавливалась в его отсутствии (n=16) (Рисунок 17). В настоящее время мы не имеем убедительного объяснения этому феномену, но предполагаем, что он свидетельствует о том, что механизм генерации МСК Са2+-ответов на норадреналин значительно более сложный, чем представлялся нам до этого. Например, теоретически ингибирующий эффект альпренолола может быть объяснен концепцией направленного агонизма (biased agonism) (Shenoy et al, 2006; Patel et al, 2010; Rajagopal et al, 2010). На данный момент описано, что альпренолол стимулирует сопряжение 1- и 2-адренорецепторов с ERK1/2 киназой через -аррестин (Kim et al, 2008; Coffa et al., 2011). Следовательно возможно, что альпренолол влияет на ответы МСК на норадреналин, стимулируя 2-адренорецепторы как агонист, способный инициировать сигнализацию, связанную с -аррестином, однако на данный момент существование такой сигнализации в МСК не описано. Этот аррестин-зависимый путь может пересекаться с механизмом трансдукции адренергического сигнала и препятствовать ему, делая МСК неспособными генерировать ответы на норадреналин.
Репрезентативная регистрация ответов одиночной МСК на норадреналин в присутствии агониста и антагониста -адренорецепторов. В присутствии агониста -адренорецепторов (Isoproterenol) ответ на норадреналин меняется незначительно, тогда как антагонист 2-адренорецепторов (Alprenolol), напротив, обратимо и полностью ингибирует ответы на норадреналин. Так или иначе, описанные эффекты специфических агонистов и антагонистов (Рисунок 16, 17) позволяют нам заключить, что все типы рецепторов, выявленные с помощью ПЦР анализа, функционируют в МСК. Более того, физиологические эксперименты показали, что все они могут быть экспрессированы в одной клетке.
Совокупность представленных экспериментальных данных, описанных выше, позволяет предположить следующие основные этапы механизма генерации Ca2+ ответа на норадреналин МСК, выделенными из жировой ткани: активированный при связывании норадреналина 2-адренорецептор (а в некоторых случаях и 1-адренорецептор) посредством G-белка активирует PLC, которая гидролизует PIP2 до IP3 и DAG, в свою очередь, IP3 стимулирует IP3-рецепторы, что приводит к первоначальному выбросу депонированного Ca2+, скорее всего, зависимому от концентрации агониста. Этот первоначальный Ca2+ сигнал стимулирует масштабный выброс Ca2+ из внутриклеточных депо, что и продуцирует вторичный Ca2+ ответ, независящий от концентрации агониста (Рисунок 18).
Роль IP3- и рианодиновых рецепторов в генерации ответов МСК на норадреналин
Мезенхимные стромальные клетки (МСК) обладают рядом специфических особенностей, включая способность стимулировать регенерацию тканей, регулировать процессы обновления тканей, способность к миграции в зону повреждения ткани и секреции широкого спектра биологически активных молекул (Caplan, 2007; Dominici et al., 2009; Kalinina et al., 2011). В силу этого уникального сочетания свойств, МСК обладают высоким терапевтическим потенциалом, и исследование различных аспектов их жизнедеятельности представляет несомненный академический и практический интерес. Мало сомнений в том, что МСК должны обладать способностью детектировать специализированные внеклеточные сигналы, которые обеспечивают, например, поддержание популяции МСК на постоянном уровне, запускают их дифференцировку в требуемый клеточный фенотип, или направляют их миграцию в отдел ткани, требующей регенерации. Ясно, что решение таких разнородных физиологических задач в рамках одной клеточной популяции требует существования разнообразных поверхностных рецепторов, сопряженных с разветвленной системой внутриклеточной сигнализации. Между тем, существующие представления о рецепторных и сигнальных системах МСК весьма ограничены. Поскольку гептаспиральные (G-protein coupled receptor, GPCR) рецепторы составляют наиболее представительный (до 5% генома млекопитающих) класс рецепторных белков и вовлечены в регуляцию самых разнообразных физиологических процессов, естественно предположить, что этот тип рецепторов широко представлен в МСК и играет ключевую роль в их жизнедеятельности.
Настоящая работа была посвящена исследованию механизмов Ca2+ сигнализации, инициируемой агонистами GPCR рецепторов в цитоплазме МСК, выделенных из жировой ткани человека, на примере пуринергической и адренергической сигнальных систем. На данный момент Са2+ сигнализация и механизмы Са2+ гомеостаза в МСК в целом изучены недостаточно. В этой области были выполнены лишь единичные работы, которые преимущественно посвящены анализу спонтанных Ca2+ осцилляций в цитоплазме МСК или роли внешнего Ca2+ и агонистов некоторых GPCR рецепторов в развитии и дифференцировке МСК (Ye, 2010; Zippel et al.,2012).
Выбор пуринергической и адренергической сигнальных систем в качестве объектов исследования не был случаен. Во-первых, повреждение тканей ассоциируется с выбросом большого количества ATP во внеклеточную среду, который может стимулировать МСК, мигрирующие в зону повреждения. Поэтому можно было ожидать, что пуринергическая сигнальная система является естественной частью системы регуляции клеточных функций МСК. Адренергическая система вызывала интерес, поскольку продемонстрировано, что МСК костного мозга пространственно ассоциированы с адренергическими нервными волокнами, а физиологические процессы во многих периферических тканях, в клетки которых могут дифференцироваться МСК, модулируются адреналином и норадреналином. Немаловажным обстоятельством было также то, что пуринергические и адренергические агонисты стимулируют Са2+ сигнализацию в самых разнообразных клетках (Burntock, 2014; Scanzano, Cosentino, 2015). В силу этого, для исследования сигнальных процессов в МСК можно было использовать неинвазивный и весьма эффективный метод микрофотометрии (Ca2+-imaging) в сочетании с достаточным набором агонистов и антагонистов пурино- и адренорецепторов и ингибиторов/модуляторов других сигнальных белков.
Проведенное исследование Са2+ сигнализации, инициируемой агонистами GPCR рецепторов в цитоплазме МСК позволило получить ряд интересных результатов, некоторые из которых являются пионерскими, судя по имеющимся литературным данным. В ряде работ, выполненных другими авторами, указывалось, что популяция МСК в культуре не является однородной. В подтверждение этого в настоящей работе нами было продемонстрировано, что популяция МСК функционально гетерогенна, что в ней сосуществуют субпопуляции клеток, способных генерировать специфические Са2+ ответы лишь на 1-2 агониста, такие, как аденозин, адреналин, АТР, ацетилхолин, глутамат, серотонин, ГАМК. Биологическая значимость этого пока не ясна. Возможно, выявленная функциональная гетерогенность является косвенным отражением того, что имеются МСК с детерминированной способностью дифференцироваться в клетки определенного фенотипа.
Основным достижением представленной работы является выяснение ключевых этапов генерации Ca2+ сигналов при стимуляции МСК агонистами пурино- и адренорецепторов. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что пуринергическая и адренергическая трансдукция протекают по сходному сценарию. Ее интересной особенностью является то, что Ca2+ ответы МСК на АТР и норадреналин генерируются по принципу «все или ничего», т.е. их амплитуда не зависит от концентрации агониста (Рисунок 8, 24), как это часто имеет место для кривых доза-ответ. Полученные нами данные позволяют думать, что в основе этого феномена лежит двухстадийная генерация клеточных ответов. На первом этапе происходит генерация Са2+ сигнала агонист-зависимым образом (судя по задержке ответа МСК от концентрации агониста (Рисунок 10)), который затем усиливается по механизму Са2+-индуцированного Са2+ выброса (Ca2+-induced Ca2+ release, CICR) до максимальной амплитуды. Существование явления CICR однозначно продемонстрировано в экспериментах с фотолизом NP-EGTA, когда импульсы внутриклеточного Са2+ инициировали Са2+ сигналы, идентичные вызванным агонистами (Рисунок 12, 25). Из двух возможных мишеней внутриклеточного Са2+, обеспечивающих запуск этого регенеративного процесса - рианодинового рецептора и IP3 рецептора - именно последний выполняет роль Са2+ триггера (Рисунок 14B, 27). И наконец, фармакологический анализ в сочетании с данными ОТ-ПЦР позволил выявить ключевые типы пурино- и адренорецепторов, обеспечивающих чувствительность МСК к соответствующим агонистам. Так, чувствительность МСК к экстраклеточным нуклеотидам преимущественно обеспечивается P2Y1, P2Y2 и P2Y4 пуринорецепторами (Рисунок 20, 21, 22), в то время как в детекции норадреналина, в основном, участвует 2A-адренорецептор (Рисунок 16).
Разумеется, не все детали пуринергической и адренергической сигнализации в МСК окончательно ясны. В частности, роль 2-адренорецептора в физиологии МСК, который непосредственно не вовлечен в Са2+ сигнализацию, еще предстоит установить. Неясно, каким образом IP3 рецепторы могут одновременно обеспечивать первый фосфолипаза С-зависимый этап трансдукции и одновременно участвовать в Са2+-индуцированном выбросе Са2+, непосредственно не требующем активной фосфолипазы С (Рисунок 13, 26). Эти и многие другие вопросы требуют своего разрешения в будущих экспериментах.
В заключении автор хотел бы выразить признательность своему научному руководителю Колесникову Станиславу Сергеевичу за идею представленной работы, организацию рабочего процесса, неоценимую помощь в постановке экспериментов и советы при написании настоящей диссертации. Трудно переоценить помощь коллектива лаборатории молекулярной физиологии клетки ИБК РАН, в особенности Хохлова Александра Анатольевича, который обеспечил всеобъемлющую техническую поддержку решавшихся задач. Также автор искренне благодарен сотрудникам кафедры биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, в особенности Сысоевой Веронике Юрьевне и Ткачуку Всеволоду Арсеньевичу, за плодотворное сотрудничество, которое в немалой степени обеспечило эффективность работ, выполнявшихся в рамках темы диссертации.