Содержание к диссертации
Введение
Список сокращений 4
Введение 5
Обзор литературы 13
Плюрипотентные клетки в предимплантационном развитии
Стадии предимплантационного развития 15
Специализация слоя трофоэктодермы (ТЭ) 17
Молекулярные факторы гетерогенности клеток 17
Разделение ТЭ и ВКМ в бластоцисте 17
Разделение эпибласта и примитивной энтодермы в составе внутренней клеточной массы Формирование полости бластоцисты.. 19
Хетчинг и имплантация зародышей 16
Линии плюрипотентных клеток 25
Характеристики эмбриональных стволовых клеток 25
Молекулярные механизмы плюрипотентности 29
Сигнальные пути ЭСК 31
Роль Wnt сигнального пути в поддержании плюрипотентности и самообновления ЭСК Е-кадгерин и клеточная адгезия в поддержании 34
Дифференцировка ЭСК 35
Начальные этапы дифференцировки, образование эмбриоидных тел (ЭТ) Эпителиально-меземхимный переход 36
Нейроэктодермальная дифференцировка ЭСК 37
Материалы и методы 41
Объекты исследования 41
Выделение зародышей 41
Расчет объема зародышей 42
Микроинъекция в полость бластоцисты 42
Осмотический шок з
Культивирование зародышей 43
Оценка жизнеспособности зародышей 44
Культивирование ЭСК мыши 44
Анализ роста ЭСК in vitro 45
Морфофункциональная оценка ЭСК 45
Определение активности ЭЩФ 45
Дифференцировка ЭСК in vitro 45
Выявление тканеспецифических маркеров 46
Анализ изображений и построение графиков 47
Микроинъекция ЭСК в полость бластоцисты 47
Статистическая обработка результатов 47
Результаты и обсуждение 49
Травматическое действие микроинъекции (МИ) 49
Морфология и выживаемость бластоцист после МИ 50
Изменение объема бластоцисты после МИ 55
Ответная реакция эмбрионов на осмотический шок 59
Эмбриональные стволовые клетки мышей линии R1 64
Характеристика клеток R1NGF in vitro 65
Дифференцировка клональных потомков R1NGF 69
Гетерогенность клеточных популяций R1NGF 71
Микроинъекция (МИ) клеток R1NGF в бластоцисту. 75
Распределение инъецированных клеток в бластоцисте 76
Влияние NGF на дифференцировку ЭСК в составе бластоцисты
Заключение 85
Выводы 90
Список литературы
- Специализация слоя трофоэктодермы (ТЭ)
- Роль Wnt сигнального пути в поддержании плюрипотентности и самообновления ЭСК Е-кадгерин и клеточная адгезия в поддержании
- Морфофункциональная оценка ЭСК
- Эмбриональные стволовые клетки мышей линии R1
Введение к работе
Актуальность проблемы. Возможность эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) к дифференцировке во все типы клеток и тканей организма является привлекательной перспективой для их медицинского применения. В ряде случаев ЭСК могут использоваться для лечения тяжелых повреждений мозга и наследственных патологий нервной системы (Vazin & Freed, 2010). К настоящему времени разработаны протоколы терминальной дифференцировки ЭСК человека в дофаминовые нейроны без совместного культивирования со стромальными клетками (Кожухарова и др., 2010). Однако проблема дифференцировки ЭСК в нейральном направлении не решена в деталях. Рост и размножение ЭСК регулируются множеством ростовых факторов и цитокинов, межклеточными взаимодействиями, компонентами внеклеточного матрикса и микроокружением.
Среди экзогенных активаторов ЭСК в нейральном направлении, важную роль играет фактор роста нервов - NGF, относящийся к семейству нейротрофинов (Schuldiner et al., 2001; Inan et al., 2008). Он участвует в процессах дифференцировки ганглионарных нейронов и пролиферации нейральных стволовых клеток (Li, et al., 2009; Lin et al., 2012). Однако действие NGF на нейральную дифференцировку ЭСК не однозначно. В частности, NGF индуцирует нейральную дифференцировку ЭСК человека только в сочетании с ретиноевой кислотой (Schuldiner et al., 2001).
На данный момент перспективным направлением в изучении дифференцировки стволовых клеток является создание генетически модифицированных ЭСК с экспрессией нейротрофических факторов, в частности, NGF (NGF-ЭСК). Предполагается, что генетически модифицированные ЭСК, экспрессирующие NGF, будут дифференцироваться преимущественно в нейроэктодерму. Следует подчеркнуть, что дифференцировка в условиях in vitro может принципиально отличаться от ситуации in vivo. В условиях встраивания в ткани, активность NGF-ЭСК будет зависеть от сформировавшихся межклеточных взаимодействий и от внеклеточного гомеостаза. Поэтому для понимания закономерностей перехода ЭСК к дифференцировке в составе ткани следует обратиться к экспериментальной модели многоклеточной системы. Наиболее адекватной для таких исследований является бластоциста мыши, как простейшая модель, которая по своим свойствам в большей степени соответствует ЭСК.
Цель и задачи исследования
Сравнительный анализ морфофункциональных характеристик NGF-модифицированных ЭСК мыши в системе in vitro и после микроинъекции в бластоцисту.
Задачи:
-
Изучить влияние осмотического и механического стресса на способность бластоцист после микроинъекции к восстановлению морфологии, хетчингу и образованию колоний в культуре in vitro
-
Оценить влияние эндогенной продукции NGF на ростовые характеристики клеток-продуцентов (пролиферативная активность, скорость роста, способность к нейральной дифференцировке, время удвоения популяции)
-
Оценить дифференцировочный потенциал NGF-модифицированных клеток in vitro
-
Исследовать характер распределения и взаимодействия NGF-ЭСК с клетками с клетками зародыша на стадии бластоцисты и в первичной колонии
Научная новизна. Впервые установлено, что NGF-ЭСК в стандартных условиях культивирования в присутствии цитокина LIF растут в виде суспензии ЭТ, при этом, продукция
NGF нивелирует эффекты LIF. Разработана экспериментальная модель для оценки изменения морфофункционального состояния NGF-ЭСК в различных системах культивирования. Нейральная дифференцировка NGF-ЭСК мыши in vitro сопровождается усилением продукции белка NGF на фоне выявления ранних (Nestin) и более поздних (Vimentin) маркеров нейральных предшественников, а также BMP2/4, характерного для мезодермы. Обнаружены различия в нейральной дифференцировке NGF-ЭСК in vitro и после микроинъекции в бластоцисту.
Впервые показано, что NGF-ЭСК мыши под влиянием клеток внутренней клеточной массы (ВКМ) бластоцисты сохраняют свой плюрипотентный потенциал, но они теряют способность продуцировать NGF и уходить в нейральную дифференцировку в составе химерной бластоцисты.
Получены данные о том, что на стадиях средней и поздней бластоцисты зародыши мыши устойчивы к механическому и осмотическому стрессу, вызванному процедурой микроинъекции (МИ) в полость бластоцисты ЭСК и/или больших объемов растворов осмолитиков. Впервые разработан математический метод прогнозирования имплантационного потенциала бластоцисты по активности клеток трофобласта (ТБ). Метод МИ предложен в качестве вспомогательного приема для усиления хетчинга и повышения эффективности культивирования бластоцист в системе in vitro.
Научно-практическое значение работы. Экспериментальные модели NGF-ЭСК мыши и первичные колонии химерных бластоцист перспективны для изучения механизмов действия сигнальных молекул, особенностей нейральной дифференцировки в раннем эмбриогенезе, а также скрининга новых нейротропных фармакологических препаратов. Метод математического расчета восстановительный способности бластоцист после МИ растворов осмолитиков может быть использован для прогнозирования способности зародышей к имплантации, что важно для решения проблем репродуктивной медицины и сельского хозяйства. В первую очередь это касается работ с эмбрионами in vitro и после их криоконсервации. Экспериментальные данные диссертационной работы дают новые сведения для понимания механизмов действия фактора NGF в раннем эмбриогенезе. Полученные данные о влияния продукции NGF в ЭСК на способность этих клеток к нейральной дифференцировке целесообразно учитывать при разработке ЭСК-технологий для регенеративной медицины. Основные положения, выносимые на защиту
-
Изменения и скорость восстановления объема зародышей на стадии бластоцисты после МИ в полость сравнительно больших объемов осмолитиков зависит от функциональной активности клеток трофобласта.
-
NGF-модифицированные ЭСК мыши с экспрессией зеленого флуоресцирующего белка GFP в культуре in vitro растут в суспензии с образованием ЭТ в присутствии цитокина LIF мыши. Колонии формируются на 3-5 сутки культивирования из ЭТ.
-
Эндогенная продукция NGF усиливает пролиферативную активность, сокращает время удвоения популяции ЭСК.
-
В культуральной среде идет селекция NGF-модифицированных клеток по степени их дифференцированности (ранние и поздние предшественники, мезодермальные производные).
-
После МИ NGF-ЭСК встраиваются преимущественно в область локализации ВКМ, теряют способность экспрессировать NGF и GFP. Под влиянием ВКМ активируются плюрипотентные свойства, повышается экспрессия транскрипционного фактора Nanog. Показано индукционное влияние ВКМ на NGF-ЭСК.
Конкурсная поддержка работы. Работа выполнена по теме НИОКР «Роль цитокинов и ростовых факторов в регуляции роста и дифференцировки эмбриональных стволовых клеток и ранних зародышей», гранты РФФИ 04-04-48904 и 05-04-49521, гранты Президента РФ ведущих научных школ НШ – 2741. 2008.4, НШ – 3202. 20010.4, НШ – 1853. 2012.4 «Рецепция сигналов химической и физической природы».
Личный вклад автора. Основные результаты работы получены лично автором или при его непосредственном участии. Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментов с культурами клеток, микроинъекции, в обсуждении и написании публикаций. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на российских и международных симпозиумах: II съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН, Санкт-Петербург, 2007; XVI международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2009»;Москва, 2009; VII Международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток», Звенигород, 2009; Международная научная конференция «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем», Минск, Беларусь, 2010; Stem cell and cancer – 6th International Heinrich F.C. Berh Symposium. 2010, Heidelberg, Germany; IV Всероссийская научная конференция «Стволовые клетки и регенеративная медицина», Москва, 2011; Съезд биофизиков, Нижний Новгород, 2012; 17-я школа-конфернеция молодых ученых “Биология – наука 21 века», Пущино, 2013.
По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, из них 2 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для защиты кандидатских диссертации, и 1 статьи– в журнале, не вошедшего в список ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок и 5 таблиц. Работа включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы. Список литературы содержит 198 ссылок.
Специализация слоя трофоэктодермы (ТЭ)
В раннем развитии млекопитающих все ткани зародыша формируются из плюрипотентных клеток эпибласта (Эпи), существующих непродолжительный промежуток времени и закладывающихся на стадии бластоцисты в составе внутренней клеточной массы (ВКМ). Стадия бластоцисты завершает предимплантационное развитие, и представляет шарообразную структуру с полостью, заполненной жидкостью, которая разделяет слой клеток трофобласта (ТБ) и ВКМ.
К моменту имплантации бластоциста состоит из трех типов коммитированных клеток, которые различаются местоположением, экспрессией молекулярных маркеров и, следовательно, дальнейшей судьбой в эмбриогенезе (Рис. 1). Первыми обособляются клетки ТБ, которые формируют внешний слой трофэктодермы (ТЭ) и идут на построение зародышевой части плаценты. Затем в составе ВКМ происходит разделение примитивной энтодермы (ПЭ) и плюрипотентных клеток Эпи. Клетки ПЭ образуют эпителиальный слой на границе с полостью бластоцисты. Они идут на построение висцеральной и париетальной энтодерм зародышевого мешка и первичной кишечной трубки (Kwon et al., 2008; Artus & Chazaud, 2014). Клетки Эпи после имплантации собственно и формируют весь зародыш, включая зачаточные гаметы. Таким образом, ключевым событием в предимплантационном периоде является закладка плюрипотентных клеток и обособление их от предшественников внезародышевых тканей, что играет важную роль в подготовке зародыша к имплантации в матку и последующему морфогенезу.
После оплодотворения яйцеклетка подвергается серии последовательных дроблений с образованием бластомеров. До 8-клеточной стадии бластомеры зародыша равнозначны, морфологически неразличимы. Они с одинаковой вероятностью встраиваются в ТБ или ВКМ химерных бластоцист (Suwiska et al, 2008). Разделение внезародышевых и эмбриональных предшественников связано с ограничением потенциала развития бластомеров. Достигается это в результате двух судьбоносных «решений», приводящих сначала к разделению ВКМ и ТБ, а затем – ПЭ и Эпи в составе ВКМ.
Первый судьбоносный выбор клеток определяется их позицией в зародыше (Tarkowski & Wroblewska, 1967). При переходе от 8-ми к 16-ти и от 16-ти к 32-клеточному зародышу в ходе двух последовательных дроблений клетки занимают либо внешнюю, либо внутреннюю позиции внутри зародыша. Внешний слой клеток, контактирующий с окружающей средой, приобретает эпителиальный фенотип и играет важную роль в переносе питательных веществ к зародышу. В последующем эти клетки специализируется в слой ТЭ (Arnold & Robertson, 2009; Nowotschin & Hadjantonakis, 2010; Rossant & Tam, 2009; Zernicka-Goetz et al., 2009). Группа внутренних клеток, лишенных полярности, обособляется в виде ВКМ.
Второй судьбоносный выбор для разделения клеток в составе ВКМ определяется как их позицией, так и взаимодействием посредством сигнальных молекул и тканеспецифических факторов. Предшественники ПЭ и Эпи закладываются мозаично, но ближе к имплантации ПЭ формирует слой клеток, граничащих с полостью бластоцисты. Клетки Эпи занимают промежуточное положение между ПЭ и ТБ. Данное расположение определяется такими процессами, как перемещение клеток, усиление позиционной индукции, а также выборочной гибелью части клеток, занявших неправильную позицию (Plusa et al., 2008; Meilhac et al., 2009; Artus et al., 2010; Morris et al., 2010; Artus et al., 2012; Frankenberg et al., 2011).
На стадии 8-клеточного зародыша бластомеры подвергаются компактизации за счет усиления межклеточных взаимодействий. Молекулы Е-кадгерина обеспечивают Ca2+-зависимую адгезию соседних клеток. При этом происходит реорганизация цитоскелета, в результате чего бластомеры приобретают полярность с выделением апикального и базального участков мембраны. На апикальной поверхности клеток формируются микроворсинки и локализуются атипичная протеникина C (aPKC), PAR белки и актин-связанный белок - эзрин, которые ассоциированы с приобретением клетками полярного фенотипа (Plusa et al., 2005; Vinot et al., 2005). В ходе двух последующих раундов деления (при переходе от 8-ми к 16-ти и от 16-ти к 32-клеточному зародышу) клетки делятся в двух разных направлениях.
Симметричное деление (консервативное), когда плоскость деления проходит перпендикулярно поверхности зародыша, дает начало двум полярным дочерним клеткам, которые занимают внешнюю позицию и наследуют апикальную часть мембраны. В ходе ассиметричного (дифференциального) деления, плоскость проходит параллельно поверхности зародыша и одна дочерняя клетка занимает внешнюю позицию, а вторая – внутреннюю с потерей полярности.
В результате последующих делений внешние клетки все больше выявляют свойства зрелого эпителия. Сборка межклеточных контактов, завершается к моменту начала кавитации (образованию внутренней полости бластоцисты), когда зародыш состоит примерно из 28-33 клеток (Smith & McLaren, 1977). Хотя разделение клеток ВКМ и ТЭ происходит еще до кавитации, их спецификация в составе зародыша не отражает реального потенциала к развитию, поскольку только небольшая часть клеток ВКМ способна формировать бластоциста-подобные структуры
Роль Wnt сигнального пути в поддержании плюрипотентности и самообновления ЭСК Е-кадгерин и клеточная адгезия в поддержании
Использовали растворы NaCl в концентрациях: 154 и 307 мМ, что соответствует следующим измеренным значениям осмолярности – 310 и 614 мОсМ. Отдельно готовили 5% глюкозу на основе физиологического раствора, что соответствовало значению осмолярности 560 мОсМ. Осмотическое давление растворов измеряли с помощью осмометра VAPRO 5520 (Wescor, США). Различия в расчетных и измеренных значениях осмолярности не превышали 20 мОсМ. Дробящиеся зародыши на стадии морулы (рис. 8, А) помещали на 30 и 60 мин в физиологические условия (310 мОсМ), компактные морулы и бластоцисты (рис. 9) помещали на 30 мин в условия 560 (5%-глюкозы в физрастворе) и 614 мОсМ. Каждые 10 мин измеряли объем зародышей, после чего их переносили в среды для культивирования (260 мОсМ). Выживаемость морул–бластоцист после осмотического шока оценивали по способности восстанавливать объем после переноса в культуральные среды и развиваться in vitro. В развившихся бластоцистах считали количество клеток ТБ.
Зародыши мыши культивировали в небольшом объеме (100 мкл) модифицированной среды Виттена (Березовская и др., 1986), морулы - в оптимизированной по ионам калия среде KSOM (Biggers, 2000) в 4-х луночных эмбриологических чашках (Nunc). С целью обеспечения оптимальных условий для развития бластоцист в среду Виттена дополнительно вносили 15 % инактивированной (560С, 30 мин) эмбриональной сыворотки коров (Gibco, HayClone, Sigma) и 10 нг/мл рекомбинантного цитокина LIF (Pepro Tech.inc, USA). Длительность культивирования зародышей составляла 96-120 ч. На каждом этапе культивирования оценивали морфологию и жизнеспособность зародышей, количество бластомеров, способность развиваться и формировать бластоцисту, а также выход зародышей из z.pellucida и адгезивные свойства.
Жизнеспособность зародышей мыши оценивали путем прямых микроскопических наблюдений за процессом развития через каждые 24 ч культивирования in vitro. Подсчитывали число дробившихся зародышей, стадию развития, число полноценных бластоцист, а также наличие фрагментированных и дегенеративных зародышей. На каждом этапе регистрировали зародыши с остановкой развития и нарушениями барьерных свойств плазматических мембран. Для этого использовали витальные красители: 0.5% трипановый синий (Fluka, Швейцария). Принцип действия трипанового синего основан на проникновении красителя через плазматические мембраны поврежденных (нежизнеспособных) клеток. Жизнеспособность бластоцист и динамику их морфофункционального состояния оценивали по способности выхода из z. pellucida, прикрепления к субстрату, а также по способности бластоцист развиваться в виде колоний ЭК в условиях пролонгированного культивирования. Принадлежность колоний ЭК к плюрипотентным стволовым клеткам определяли цитохимическим методом по активности эндогенной щелочной фосфатазы (ЭЩФ).
Для культивирования ЭСК использовали среду ДМЕМ с высоким содержанием глюкозы 4.5 г/л (Биолот, Россия). В эту среду дополнительно вносили 2 мM L-глютамина (Helicon); 1мМ Na-пирувата, 0.1мМ 2-меркаптоэтанола (Gibco); 1 мМ заменимых аминокислот (ПанЭко) и 10 % фетальной бычьей сыворотки (HyClone), стрептомицин и пенициллин по 50 мкг/мл. Для поддержания плюрипотентности ЭСК в среду культивирования добавляли 10 нг/мл рекомбинантного белка LIF мыши (Sigma). Культивирование проводили в СО2-инкубаторе (Sanyo, Япония) при 370С и 5% СО2 в увлажненной атмосфере воздуха. 2.3.1.Анализ роста ЭСК in vitro
Для построения кривых роста in vitro клетки R1 и R1NGF высаживали в концентрации 105кл/мл на 35 мм чашках Петри (Costar, Nunc), покрытых 0.1% раствором желатины (Sigma). Длительность культивирования составляла 72 ч. Каждые 24 ч подсчитывали количество клеток, для этого клетки R1, растущие в колониях, промывали раствором PBS (Gibco) и снимали с поверхности чашки Петри раствором трипсин-ЭДТА (Биолот, Россия), а клеточные конгломераты из клеток R1NGF ресуспендировали механически. Клетки подсчитывали в камере Горяева. Время удвоения клеточной популяции рассчитывали через 48 и 72 ч in vitro по формуле: T=t log(x/x0)2, где х0 - начальная концентрация клеток, х - конечная концентрация клеток, t - время культивирования. 2.3.2. Морфофункциональная оценка ЭСК
Плюрипотентность стволовых клеток оценивали по их способности к росту и размножению колониями на 0.1% желатиновом покрытии, активности эндогенной щелочной фосфатазы (ЭЩФ), способности образовывать ЭТ при удалении LIF из среды культивирования и выявлению фактора плюрипотентности Nanog. 2.3.3. Определение активности эндогенной щелочной фосфатазы (ЭЩФ)
Колонии и осажденные ЭТ фиксировали охлажденным ацетоном в течение нескольких секунд, подсушивали на воздухе, после чего инкубировали в течение 1 ч при 37С в растворе с а-нафтол-AS-BI-фосфатом (ICN, Calbiochem) и красителем BB синим (ICN). Появление в колониях и ЭТ окрашенных клеток свидетельствовало о положительной реакции на ЭЩФ.
Морфофункциональная оценка ЭСК
ЭСК мышей линии R1 были использованы нами в качестве контроля развития in vitro. Линия характеризуется высокой пролиферативной и теломеразной активностью, способна расти и возобновляться в течение длительного периода культивирования. Относится к числу LIF-зависимых линий ЭСК мыши, производных клеток ВКМ на стадии бластоцисты (Nagy et al., 2003; Hanna et al., 2010). Часто используется для переноса чужеродной генетической информации, сайт-направленной модификации генов, получения химерных и трансгенных животных. После МИ в полость бластоцисты ЭСК линии R1 встраиваются преимущественно в эпибласт и дают начало всем клеточным типам, включая гаметы. Эти клетки обладают высоким плюрипотентным потенциалом и стабильностью ростовых характеристик in vitro и in vivo после инъекции в бластоцисту. Они охарактеризованы как нормальные диплоидные клетки с модельным числом хромосом 2n=40 (Robertson et al., 1987; Brown et al., 1992; Hu, Shang, 1996).
Было установлено, что при низкой плотности посева (105 кл/мл) ЭСК линии R1 через 24 ч культивирования в с 10 нг/мл LIF и 15% фетальной сыворотки, адгезируют на поверхности чашки Петри, предварительно обработанной 0.1% раствором желатины (рис. 13, А). В присутствии LIF и фетальной сыворотки клетки R1 сохраняют свои адгезивные свойства и способность размножаться колониями без образования ЭТ. Было установлено, что время образования изолированных друг от друга колоний не должно превышать 48 ч, после чего требуется пассирование. В противном случае, колонии сливаются и начинаются процессы спонтанной дифференцировки на периферии колонии через 72 ч непрерывного культивирования R1 (рис. 13, А). Их деление и последующий рост осуществляются в виде колоний, представленных потомками одной клетки. Такой характер роста ЭСК, на наш взгляд, не может свидетельствовать о спонтанной дифференцировке, поскольку в культуре in vitro не выявлялось образование ЭТ, но говорит о высоком плюрипотентном потенциале ЭСК мыши (Robertson et al., 1986). Для мышиных LIF-зависимых линий клеток, в том числе и для линии R1, образование ЭТ достигается путем изъятия цитокина LIF из среды культивирования.
Рис. 13 Морфология эмбриональных стволовых клеток мыши линии R1 (А) и их NGF-трансфицированных потомков (Б, В) через 24 и 48 и 72 ч культивирования в стандартной среде для стволовых клеток (ДМЕМ-ЭСК). В – GFP флуоресценция. К – монослойная колония, ЭТ – эмбриоидное тело. Трансфицированные клоны R1NGF при такой же плотности посева и в тех же условиях культивирования, что и клетки линии R1, приобретают суспензионный характер роста. В течение первых суток культивирования клональные потомки R1NGF агрегируют между собой, образуя клеточные конгломераты наподобие ЭТ (рис. 13, Б и В). При увеличении длительности культивирования до 72 ч такие ЭТ значительно увеличиваются в своих размерах за счет деления клеток. Однако при этом ЭТ сохраняют суспензионный характер роста (рис. 13, Б и В).
В трансфицированных клонах ЭСК со встроенными генами ngf+/+ и gfp+/+, как мы полагаем, основная роль отводится продукции фактора роста нервов NGF. Продукция этого фактора способствует: 1) изменению характера роста ЭСК в виде ЭТ, 2) снижению адгезивных свойств и, возможно, дифференцировке ЭСК в нейральном направлении.
В настоящее время хорошо известно, что NGF индуцирует нейральную дифференцировку ЭСК мыши и человека (Schuldiner et al., 2001; Pyle et al., 2006), способствует выживанию нейральных типов клеток в условиях in vitro, обладая при этом еще и нейропротективным эффектом (Morcuende et al., 2013). Известно, что NGF действует на пролиферацию нейральных стволовых клеток (НСК) и их дифференцировку в соматические нейроны (Pyle et al., 2006). В наших экспериментах показано, что секреция этого фактора в плюрипотентных ЭСК влияет на их морфофункциональное состояние в культуре in vitro (рис. 14, Б). При этом следует отметить, что NGF нивелирует эффекты LIF, направленные на подавление образование ЭТ.
Эмбриональные стволовые клетки мышей линии R1
В этих экспериментах мы установили, что по мере восстановления полости бластоцисты светящиеся GFP-клетки обнаруживаются как в ТБ, так и области локализации ВКМ (Рис. 19, Б). Судя по нашим наблюдениям и расчетам, их количество поле 24 ч инкубирования в составе бластоцисты не увеличивается. В среднем на одну химерную бластоцисту приходилось около 10 GFP-клеток, которые выявлялись в виде светящихся точек, по своим размерам соответствующим ЭСК мыши (10-12 мкм).
После адгезии экспандированной бластоцисты и начала формирования первичной колонии (72 ч in vitro) инъецированные GFP-клетки компактизовались преимущественно в области расположения ВКМ и только небольшая их часть обнаруживалась на периферии колонии, образованной более крупными клетками ТБ (рис. 19, В). С увеличением длительности культивирования химерных бластоцист до 120 ч наблюдалось, с одной стороны, снижение интенсивности флуоресценции ЭСК, с другой, -увеличение их численности в центре колонии (рис. 19, Г).
Флуоресцентный анализ показал, что встраивание NGF-стволовых клеток линии R1, инъецированных в полость бластоцисты, носит случайный характер на доимплантационных стадиях развития. Однако после хетчинга и адгезии химерной бластоцисты к поверхности культуральной чашки (что соответствует стадии имплантации in vivo) инъецированные клетки перемещаются и сосредотачиваются в центре первичной колонии, где располагаются в основном клетки ВКМ (рис. 19, В).
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют: (1) о пролиферативной активности NGF-модифицированных клеток в составе бластоцисты, (2) о способности к миграции после выхода бластоцисты из оболочки и (3) о преимущественном встраивании в компактный слой ВКМ и (4) о снижении интенсивности флуоресценции белка GFP с увеличением длительности культивирования химерных бластоцист в виде первичных колоний. Мы полагаем, что под влиянием паракринной регуляции со стороны клеток ВКМ возможно как перепрограммирование ЭСК со сменой паттернов экспрессии генов, так и активация процессов пролиферации и дифференцировки.
Клетки ВКМ играют важную роль в поддержании стабильности свойств ТБ, формирующих стенку полости бластоцисты, а также клеток внезародышевой энтодермы, обособляющейся на свободной поверхности ВКМ, обращенной в полость бластоцисты (Nagy et al., 2003). ТБ, лишенные связи с ВКМ, теряют способность к пролиферации в результате эндорепликации ДНК, приводящей к полиплоидии и трансформации в первичные гигантские клетки ТБ. Можно также предположить, что пролиферативная активность инъецированных ЭСК контролируется клетками ВКМ. Индукционная активность ВКМ может быть направлена как на клетки ТБ, растущие по периферии колонии, так и ЭСК, локализованные в непосредственной близости от ВКМ.
Наблюдаемое незначительное снижение числа GFP-флуоресцирующих клеток в составе бластоцисты можно объяснить несколькими факторами. Наиболее вероятным из них является потеря части инъецированных клеток за счет быстрого вытекания потока жидкости через место прокола в слое ТБ, образующего полость бластоцисты, в перивителлиновое пространство, а затем во внешнюю среду через отверстие в z. pellucida. Нельзя также исключить вероятность, того, что часть инъецированных GFP-клеток может погибать в результате нарушений взаимодействий с клетками ТБ и ВКМ, а также миграционной способности. В источниках литературы есть данные о том, что интенсивность GFP-флуоресценции в эмбриональных клетках и эмбрионах трансгенных мышей на ранних стадиях развития in vitro зависит от морфофункционального состояния. В частности, плюрипотентные недифференцированные клетки ВКМ в составе бластоцисты и первичных колоний обладают более ярким свечением по сравнению со специализированными клетками ТБ (Сахарова и др., 2014). Это означает, что с запуском процессов начальной эмбриональной дифференцировки и изменением экспрессии генов в клетках-продуцентах происходит подавление продукции флуоресцентного белка GFP. Сам по себе этот белок обладает устойчивостью свечения, не токсичен для эмбриональных клеток и зародышей (Смирнов и др., 2008; Сахарова и др., 2014).
На модели первичных колоний, сформированных после выхода бластоцист из оболочек и их последующей адгезии к поверхности культуральной чашки, показано, что расположенные в центре колонии клетки ВКМ экспрессируют основной маркер плюрипотентности – транскрипционный фактор Nanog (Рис.20, а, б). При этом они не обнаруживают экспрессию нейротрофического фактора NGF через 120 ч культивирования in vitro (рис.20, в, г).
Из литературы известно, что белок NGF начинается продуцироваться в эмбриональных клетках только на стадии закладки нервной трубка (Wyatt et al., 2011), но рецепторы к нейротрофинам могут экспрессироваться в предимплантационных зародышах, начиная с яйцеклетки (Kawamura et al., 2005; Pei, 2010). Это предполагает участие NGF в регуляции предимплантационного развития. Конечно, в большей степени такое предположение касается экзогенной регуляции NGF посредством его действия через микроокружение.
Прямые исследования регуляторной способности NGF на ранних стадиях in vivo достаточно проблематичны и трудоемки с силу того, что в этот период на эмбрионы действует достаточно большое количество паракринных регуляторов со стороны материнского организма.