Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы Гибридные биомолекулярные фотолюминесцентные на нокомплексы 16
1.1 Введение 16
1.2 Флуоресцентные наноалмазы
1.2.1 Электронная структура и свойств излучения азотно-вакансионного (NV) центра 22
1.2.2 Интерконверсия NV центра 23
1.2.3 Недавний прогресс в производстве и изучении сверхмалых (ультрадисперсных) NV наноалмазов 24
1.2.4 Оптический имиджинг наноалмазов в биологических системах 26
1.3 Нанорубины 28
1.3.1 Методы синтеза нанорубинов 28
1.3.2 Квантовый выход 30
1.4 Антистоксовые нанофосфоры 31
1.4.1 Фотофизика антистоксовых нанофосфоров 31
1.4.2 Синтез антистоксовых нанофосфоров 34
1.4.3 Преимущества антистоксовых нанофосфоров 37
1.4.4 Ограничения антистоксовых нанофосфоров 38
1.4.5 Получение оптических изображений биоструктур, маркированных антистоксовыми нанофосфорами 40
1.5 Процедуры поверхностной модификации наночастиц. Коллоидная стабильность 44
1.5.1 Поверхностная модификация наноалмаза 44
1.5.2 Коллоидные свойства нанорубинов 47
1.5.3 Методы поверхностной модификации гидрофобных антистоксовых нанофосфоров 1.6 Биоконъюгация наночастиц 49
1.7 Заключение главы 52
2 Обзор литературы: Нанотоксикология и трансдермальная кинетика оксида цинка 53
2.1 Введение 53
2.2 Солнцезащитные свойства наночастиц ZnO 55
2.2.1 Общие аспекты защиты от УФ-излучения 55
2.3 Пути проникновения наночастиц 57
2.3.1 Структура кожи - слои и функции 58
2.3.2 Пути проникновения веществ через кожу 59
2.3.3 Физиологические факторы, влияющие на проникновение молекул и частиц в кожу 60
2.3.4 Факторы, повышающие проницаемость
2.4 Методы оценки проницаемости кожи для наночастиц 61
2.4.1 Экспериментальные модели проницаемости кожи 62
2.4.2 Оценка проницаемости и методы анализа 63
2.4.3 Нелинейная оптическая микроскопия 64
2.5 Биотоксичность наночастиц ZnO 66
2.5.1 Оценка токсичности 66
2.5.2 Механизмы токсичности 68
2.6 Заключение главы 69
Результаты и обсуждения Флуоресцентные наноалмазы 70
3.1 Введение 70
3.2 Оптический контраст светорассеяния наноалмазов
3.2.1 Использование светорассеяния для определения размеров наноалмазов 70
3.2.2 Светорассеивающие наноалмазы в клетках 71
3.3 Флуоресцентные наноалмазы 72
3.3.1 Обнаружение активных азотно-вакансионных центров в сверхмалых НА 73
3.3.2 Регистрация и исследование одиночных NV центров в одиночных НА 76
3.3.3 "Мерцание" одиночных NV центров в одиночных НА 78
3.3.4 Влияние среды на свойства флуоресценции и мерцание одиночных NV центров в одиночных наноалмазах 81
3.4 Биоконъюгация флуоресцентных наноалмазов 82
3.4.1 Модульная биоконъюгация НА 83
3.4.2 Визуализация ФНА комплексов в клетках 84
3.5 Заключение главы 85
Нанорубины 88
4.1 Введение 88
4.2 Производство и характеризация нанорубинов
4.2.1 Производство нанорубинов методом фемтосекундной лазерной абляции 89
4.2.2 Производство нанорубинов и нанокорундов в шаровой мельнице 90
4.2.3 Коллоидная стабильность нанорубинов и нанокорундов 94
4.2.4 Поверхностная модификация нанокорундов 95
4.2.5 Тестирование цитотоксичности нанокорундов
4.3 Фотолюминесцентные свойства нанорубинов 98
4.4 Демонстрация применений нанорубинов в биологии
4.4.1 Бесфоновая визуализация нанорубинов 100
4.4.2 Динамический имиджинг нанорубинов в клетке. Трекинг 104
4.5 Заключение главы 106
Антистоксовые нанофосфоры 108
5.1 Введение 108
5.2 Синтез и измерения характеристик антистоксовых нанофосфоров
5.2.1 Синтез антистоксовых нанофосфоров 109
5.2.2 Измерение коэффициента конверсии НАФ ПО
5.3 Получение гибридных комплексов на основе антистоксовых нанофосфоров 113
5.3.1 Модификация поверхности антистоксовых нанофосфоров 113
5.3.2 Цитотоксичность поверхностно-модифицированных антистоксовых нанофосфоров 116
5.3.3 Биоконъюгация антистоксовых нанофосфоров 120
5.4 Изучение границ применений антистоксовых нанофосфоров в биологическом зондировании и имиджинге 122
5.4.1 Визуализация одиночного антистоксового нанофосфора в крови 122
5.4.2 Чувствительность зондирования опухоли, маркированной НАФ 124
5.4.3 Применение НАФ для изучения трансдермальной диффузии наночастиц 126 5.5 Заключение главы 129
6 Трансдермальный транспорт наночастиц оксида цинка 131
6.1 Введение 131
6.2 Прижизненная нелинейная оптическая микроскопия наноразмерного оксида цинка 1 6.2.1 Флуоресцентная микроскопия времени жизни, как метод контрастирования НЧ ZnO 134
6.2.2 Количественная оценка распределения НЧ ZnO в коже 137
6.2.3 Флуоресцентная микроскопия других НЧ в коже in vitro: квантовые точки 137
6.2.4 Метод восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания для оценки локальной диффузии в коже 1 6.3 Возможные токсикологические последствия растворения наночастиц ZnO на поверхности кожи 144
6.4 Заключение главы 146
7 Маркирование и оптический имиджинг клеточных структур и процессов с использованием фотолюминесцентных наночастиц 148
7.1 Введение 148
7.2 Разработка подходов для сборки гибридных биомолекулярных фотолюминесцентных нанокомплексов 149
7.3 Неспецифическое накопление наночастиц (квантовых точек) в клетках 149
7.4 Специфическая интернализация в клетках на примере активации лигандом со-матостатином 152
7.5 Специфическая иммобилизация на клетках гибридных сборок антистоксовых нанофосфоров-мини-антител 156
7.6 Специфическая интернализация на клетках гибридных сборок нанорубин-DARPin-miniSOG 157
7.7 Предварительные результаты применения фотолюминесцентных наносборок для оптического имиджинга в животных моделях 158
7.7.1 Модель куриного эмбриона 158
7.7.2 Визуализация накопления БиоНАФ в опухоли мыши 161
Заключение 162
Благодарности 167
Литература
- Оптический имиджинг наноалмазов в биологических системах
- Физиологические факторы, влияющие на проникновение молекул и частиц в кожу
- Использование светорассеяния для определения размеров наноалмазов
- Коллоидная стабильность нанорубинов и нанокорундов
Оптический имиджинг наноалмазов в биологических системах
Таким образом, чувствительность метода оптического имиджинга с использованием флуоресцентных контрастных агентов ограничена фоновыми засветками исследуемой (живой или in vivo) биологической ткани. Создание многофункциональных комплексов, включающих в себя направляющие и терапевтические модули, а также средства защиты от ферментной деградации, представляют серьёзную проблему, решение которой возможно с использованием ФЛНЧ.
Наиболее перспективной платформой для создания соединений для диагностики представляются наночастицы различной природы, обладающие уникальным набором свойств, привлекательным для получения биогибридных ФЛ нанокомплексов с желаемой избирательностью действия. К таким свойствам НЧ относятся: 1. программируемое физических и химических характеристик в зависимости от размеров, состава и способов получения; 2. наличие химически активных функциональных групп на поверхности, позволяющие легко модифицировать частицы, оптимизируя их для конкретной задачи; 3. большая эффективная площадь поверхности, представляющая собой стыковочную платформу для прочного крепления значительного количества биологических молекул различной функциональности, в том числе направляющих/нацеливающих, терапевтических, визуализирующих; 4. оптимальный размер, определяющий преимущественное накопление наночастиц в опухолевой ткани за счёт её морфологических особенностей - так называемый эффект увеличенной проницаемости и удержания, enhanced permeation and retention (EPR). [101].
На сегодняшний день описан ряд мультифункциональных комплексов, предназначенных для тераностики, сконструированных на основе наночастиц из неорганических (оксид железа [76], золото [92, 66], углерод [72, 77], кремний [11]), так и из органических (дендримеры [187], липосомы [128], полимерные мицеллы [85]) материалов, большая часть которых не является фотолюминесцентными, а, значит, не позволяет получать контрастные оптические изображения.
Разработка методов получения НЧ на основе ФЛ наноматериалов (например, полупроводниковых нанокристаллов (квантовых точек, КТ [34], хелатированных нанокомплексов [210]) открыла возможность создания ФЛ наноразмерных сборок с принципиально новыми оптическими свойствами, что дало толчок к развитию методов молекулярного имиджинга - неин-вазивного исследования процессов в живых клетках и тканях, в том числе, на уровне целого организма [197]. Эти НЧ характеризуются высокой стабильностью, низким уровнем токсичности и особыми свойствами поверхности, позволяющими легко конъюгировать их с другими функциональными модулями. Ключевой особенностью рассматриваемых ФЛ НЧ являются их фотофизические свойства, обеспечивающие яркую визуализацию маркированных ими структур на фоне сильного светорассеяния и собственной аутофлуоресценции биологической материи.
Несмотря на преимущества молекулярных зондов на основе неорганических ФЛ НЧ, все существующие ныне ФЛ наноматериалы неидеальны. Например, хелаторы европия требуют возбуждения на коротких длинах волн в видимом и УФ диапазонах (\ех 405 нм), при которых также возбуждается аутофлуоресценция клеток/ткани, что существенно ухудшает контраст оптических изображений. Цитотоксичность некоторых видов НЧ, включая углеродные нанотрубки, оксиды металлов и полупроводниковые КТ [131] вызывает серьёзные опасения, и, несмотря на прогресс в технологии поверхностной модификации с целью уменьшения токсичности, до сих пор обсуждается в биомедицинском сообществе. Излучение одного из наиболее эффективных оптических излучателей, квантовой точки, особенно восприимчиво к окружающей среде, которое, кроме того, хорошо известна нежелательная прерывистость излучения (эффект "мерцания"), несмотря на достигнутый прогресс по подавлению этого нежелательного эффекта [200].
Центральными характеристиками гибридных биомолекулярных ФЛ нанокомплексов являются стабильная ФЛ яркость (определяемая как произведение квантового выхода г\ на сечение поглощения возбуждающего излучения аа), уникальные спектральные свойства, и не встречающаяся в живых системах фотодинамика [продолжительное время жизни ФЛ (трь), предпочтительно, измеряемое в миллисекундах]. Все эти характеристики необходимы для реализации прижизненной визуализации биогибридных сборок в клетках-мишенях вплоть до одиночных НЧ, что труднодостижимо на современном уровне развития нанотехнологии и биофотоники. Поверхностно-модифицированные ФЛ НЧ также должны быть слабоцито-токсичны, стабильны, устойчивы в водных и физиологических (буферных) растворах, а к их поверхности должны быть пришиты функциональные группы, обеспечивающие надёжную ковалентную привязку биомолекулярных модулей. В приложениях, требующих адресной доставки НЧ сборок, токсичность, как правило, является важным фактором, и многие на-номатериалы, включая наноалмазы, как было показано, удовлетворяют этому требованию, демонстрируя незначительную цитотоксичность [156].
Здесь мы рассмотрим несколько типов ФЛ наночастиц в контексте оптического имиджинга клеток/ткани: полупроводниковые квантовые точки (КТ), коммерчески доступный ФЛ нано-технологический материал, который может служить эталоном для сравнения фотофизических свойств с другими представляемыми НЧ; флуоресцентные наноалмазы (ФНА); нанорубины; и наноразмерные антистоксовыми фосфоры (НАФ). Обоснованием выбора этих ФЛ НЧ нового поколения является разнообразие свойств свечения этих важных классов нано-излучателей. КТ представляет собой полупроводниковый излучатель с запрещённой зоной, ФЛ свойства которого задаются как шириной запрещённой зоны, так и эффектом квантового ограничения. ФНА является нанокристаллом алмаза, содержащим один или несколько изолированных излучающих дефектов - центров окраски. Нанорубин является нанокристаллическим оксидом алюминия (А120з), легированным большим количеством атомов хрома, каждый из которых представляет собой квантовую систему, характеризующуюся дискретными энергетическими уровнями. НАФ представляет собой неорганический нанокристалл, легированный двумя типами редкоземельных ионов. ФЛ НАФ обусловлена нелинейными процессами передачи возбуждения между взаимосвязанными ионными светопоглощателями и светоизлучателями, переводящими квантовую систему на более высокий энергетический уровень в сравнении с энергией поглощённых фотонов.
В части 1 будут изложены основы и ключевые результаты по вышеперечисленным ФЛ НЧ, а также описаны существующие методики поверхностной модификации, биоконъюгации, относящиеся к рассматриваемым типам НЧ. Также будут описаны модальности оптических имиджинговых систем, позволяющих получать контрастные изображения ФНА, нанорубинов, НАФ и КТ.
Флуоресцентный наноалмаз представляет собой наноалмаз (НА), содержащий центр(ы) окраски. Алмаз является наиболее твёрдым материалом на Земле, состоящим из атомов углерода с энергией связи 7.4эВ на каждый атом. Ядро алмаза химически инертно, а кристаллические дефекты, некоторые из которых являются центрами окраски, хорошо защищены от внешних возмущений кристаллической матрицей. Даже высокоэнергетическое космическое излучение наносит незначительный ущерб этому кристаллическому материалу. В то же время поверхность алмаза химически активна, особенно когда поверхность хорошо развита, как в случае поверхности функционализированных наноалмазов. Например, наиболее популярная обработка поверхности кислотой или высокотемпературный отжиг в воздухе приводит к образованию кислородосодержащих групп на поверхности алмаза, которые облегчают связывание с фотонными устройствами и макромолекулами. Значительная запрещённая зона алмазов (5,5 эВ) обеспечивает достаточное энергетическое пространство для формирования большого количества ( 500) описанных центров окраски, среди которых азотно-вакансионный центр (nitrogen vacancy, NV) - один из самых ярких. NV центр была впервые обнаружен дю През в 1965 году (1), а перспективные оптические характеристки центра были описаны Дэвисом и Хамером в 1976 году [37]. Результаты наблюдения одиночного центра были опубликованы в 1997 году [53]. Сечение поглощения NV центра аа = 3 х Ю-17 см2 и квантовый выход T]NV 0, 8 достигают высоких значений в сравнении с другими известными центрами окраски. Замечательная фотостабильность NV центра, проявляющаяся как непрерывное испускание при непрерывном возбуждении, является ещё одной важной особенностью центра.
Депопуляция спин-зависимого (nis = ±1) основного состояния при комнатной температуре в nis = 0 состояние посредством оптического возбуждения представляет уникальное и ценное свойство NV центра. Оптически-приготовленное спиновое состояние также считыва-ется оптическими средствами. Время когерентности этого состояния спина при комнатной температуре обычно ограничивается временем в диапазоне микросекунд, но его увеличение до 1 мс было недавно продемонстрировано с использованием сверхчистого алмаза типа Па. Это обеспечивает практическую реализуемость создания и считывания перепутанных (entangled) спиновых состояний. Именно это сочетание физических и оптических свойств NV центра обеспечивает широкий спектр его применений, охватывающих квантовую информацию и технологию шифрования, сверхчувствительную магнитометрию и биомедицинский имиджинг/зондирование. Применения в квантовой информации базируются на возможности создания спинового состояния NV центра, называемого "кубит", с последующим его связыванием с другими спиновыми состояниями примесных дефектов, таких как соседний NV центр, замещающий атом азота Ns, или ядерный спин изотопа углерода 13С. Это связывание образует перепутанные состояния. Приложения в магнитометрии полагаются на высокую чувствительность поляризованного состояния спина NV центра к (локальным) магнитным полям. Предельная чувствительность может быть на уровне одного спина и на размерной шкале в нанометрах.
Для реализации этих важных практических применений NV центров зачастую требуется, чтобы центр окраски был в нанометровой близости к поверхности алмаза. В частности, сенсорные применения, например, с использованием эффекта Фёрстеровской резонансной передачи энергии (FRET) [26] и сверхчувствительная спин-магнитометрия требуют уменьшения слоя наноалмаза до нанометров, чтобы задействовать сильную зависимость взаимодействия от расстояния г (соответственно, 1/г6 и 1/г3). В биологическом имиджинге особо маленькие наноалмазы имеют решающее значение для сведения к минимуму препятствий в изучаемой молекулярной динамике и взаимодействии биомолекул [24]. Желательно уменьшить размер НА до размера, по крайней мере, сопоставимого со средним размером белка, то есть, 5 нм, что достижимо благодаря прогрессу в производстве ультра-малых наноалмазов, также именуемых ультра-дисперсными наноалмазами. В то же время конфигурационная стабильность NV центра ставит предел для конечного размера кристаллической матрицы - нанокристалл алмаза размером 2,5 нм может быть не способен поддерживать целостность NV центра, как было предсказано теоретически [9]. О зависимости излучательных характеристик NV центра в маленьких кристаллах или приповерхностных слоях от внешнего окружения сообщалось в литературе [147].
Физиологические факторы, влияющие на проникновение молекул и частиц в кожу
Наночастицы оксидов металлов, такие, как ZnO и ТіОг, широко используются в косметике в качестве наиболее эффективных фильтров УФ излучения. Вместе с этим, неисследованная токсичность наноматериалов и их долговременное нахождение на коже вызывают беспокойство очень широкого слоя пользователей кремов и других косметических средств. В подразделе 2.2.1 описываются общие аспекты солнцезащитных кремов, в том числе, основные типы УФ-фильтров - органические (химические) и неорганические (наночастицы оксидов металлов) компоненты и их преимущества и недостатки, прежде всего, уникальные фотозащитные свойства НЧ, что делает их подходящими для защиты от солнца. В то же время, фотозащитное действие часто сопровождается фото каталитический активностью этих НЧ. Основные аспекты фотокаталитических свойств ZnO будут рассмотрены в Разделе 2.5.
Ультрафиолетовая компонента солнечного спектра содержит около 95-98% УФ-А (400-320 нм) и 2-5% УФ-В (320-290 нм). УФ-В отвечает за загар и представляет серьёзную опасность, в том числе связанную с повреждением ДНК и денатурацией белков. При этом следует отметить, что УФ-В компонент в значительной степени поглощается роговым слоем. В отличие от УФ-В, УФ-А не полностью поглощается роговым слоем, проникает глубже в эпидермис, что вызывает фотостарение кожи, фотокарценогенез и сильное подавление иммунной системы. Частота случаев регистрации рака кожи увеличивается во многих странах мира, а в период между 1971 и 1996 годами зарегистрировано увеличение смертности от злокачественной меланомы на 40-100% [190], поэтому рак кожи и связанные с ним заболеваемость и смертность представляет серьезную опасность для здоровья людей и экономики.
Идеальный солнцезащитный крем должен эффективно блокировать УФ-А/УФ-В излучение, особенно, частично проникающее в эпидермис УФ-А излучение, быть эстетически привлекательным, и при этом не быть токсичным. За последние несколько десятилетий появилось большое количество синтетических химических веществ для эффективного блокирования УФ-излучения, но об их эффективности для защиты от рака кожи и токсичности, по-прежнему, ведутся споры. Авобензон - единственный солнцезащитный агент, который имеет пик поглощения в УФ-А области спектра (357 нм), не захватывая УФ-В область. К недостаткам этого фильтра относится склонность к фотообесцвечиванию, присущая всем орга ническим красителям и пигментам, ограничивая срок действия одним часом. Кроме того, его распад сопровождается образованием свободных радикалов, которые легко поглощаются эпидермисом и способны вызвать токсикологический стресс.
ZnO и ТіОг поглощают УФ-А и УФ-В излучение, а также преобразуют его в более длинноволновое, мягкое УФ или видимое излучение в результате процесса фотолюминесценции, что сводит к минимуму повреждение кожи из-за УФ излучения. В настоящее время кремы с наноразмерным диоксидом титана или оксидом цинка в качестве активного ингредиента считаются лучшими благодаря своим эффективным фотозащитным свойствам, а также за счёт сниженного риска раздражения кожи в сравнении с другими ингредиентами солнцезащитных кремов органической природы. НЧ ZnO демонстрируют лучшую защиту в сравнении с НЧ ТіОг в особо опасном спектральном диапазоне 340-380 нм, благодаря своему спектру поглощения [134]. Эстетическое преимущество кремов на основе ZnO заключается в их "бледности" в сравнении с составами на основе ТіОг, что объясняется разницей в показателях преломления нанокристаллов (nzno = 2.0 — 2.3 птю2 = 2.65/2.961). Улучшение прозрачности кремов на основе ZnO также возможно путём уменьшения размеров частиц. При среднем размере частиц ZnO менее 30 нм состав на основе пальмового масла становится прозрачным, как это показано на Рисунке 2.2. Это объясняется значительным уменьшением эффективности рассеяния НЧ с уменьшением диаметра (d) НЧ. Сечение светорассеяния (asc) НЧ в предельном случае рассеивания Рэлея, т.е. в случае d « А (А - длина волны света), зависит от d как asc ос d6. Таким образом, при одинаковом объёме вещества в составе препарата эффективность рассеивания падает как d 2. Легко понять стремление коммерческих производителей уменьшить размер гранул неорганических УФ-фильтров, как это, например, удалось австралийской компании "Antaria", выпустив продукт ZinClear.
Фотоактивность НЧ ZnO и ТіОг в коже находится в стадии научной проверки, несмотря на то, что солнцезащитные кремы на основе НЧ хорошо разработаны, фармацевтически проверены и рассматривается как фотостабильные. Некоторые авторы обнаружили, что НЧ ZnO не фотоактивны в составе крема при нанесении на кожу [134]. Современные средства ухода за кожей обычно делаются на эмульсионной основе - заряженные органические остатки находятся в водной среде, а активные неорганические компоненты - в масляной среде. Было обнаружено, что ионы цинка из частиц оксида цинка переходят из масляной фазы в водную фазу. Проблемы возникают от соприкосновения частиц оксида цинка и титана с заряженны 1 разница заключается в соответственных кристаллических фазах 1 анатаз и рутил ми органическими остатками, такими как полимеры на основе акрилатов, а- и /3- гидрок-сильные кислоты, и т. д. Токсичность ионов цинка также является неоднозначной. С одной стороны, цинк бивалентен, и при физиологическом значении рН не проявляет окислительно-восстановительную активность, что могло бы привести к генерации групп радикалов [12]. С другой стороны, установлено, что цинк негативно взаимодействует с заряженными органическими остатками и либо разрушает акрилат-полимеры, либо вызывает образование органических солей с одновременным распадом неорганических частиц. Для того, чтобы уменьшить потенциальную токсичность солнцезащитных НЧ ZnO и ТіОг, они пассивируется покрытием из оксида кремния (БЮг), алюминия (АІ2О3) или полимера, позволяя использовать НЧ в композициях, содержащих заряженные органические остатки. Одним из примеров такого полимера является силоксановый сополимер, содержащий петлевые структуры.
Исследования токсичности НЧ для дыхательных путей при ингаляции, интенсивно проводившиеся на животных, показывают, что НЧ ZnO могут вызвать переходную воспалительную реакцию [153]. Было также подтверждено, что повторное вдыхание в течение 6 дней (по 3 ч в день) при дозе 5 мг/м3 50-нм ZnO вызывали поражения лёгких у морских свинок. Недостаток научных доказательств такого действия НЧ на организм человека связан с этическими причинами. Нет доказательств переноса НЧ ZnO в организме человека, хотя сообщалось, что другие типы НЧ, такие как углерод, оксид марганца и серебро могут перемещаться относительно быстро из лёгких во внелёгочные органы, центральную нервную систему и лимфатические узлы, связанные с лёгкими. Также было показано в экспериментах in vitro, что НЧ ТіОг и НЧ золота проникают в красные кровяные клетки, с последующим распределения наночастиц золота в органах после внутривенного введения в соответствии с размером.
Использование светорассеяния для определения размеров наноалмазов
Фотолюминесцентные свойства нанорубинов изучались с помощью гибридного атомно-силового (ACM) и флуоресцентного лазерно-сканирующего (ФЛСМ) микроскопов, схематическая диаграмма которого представлена на Рисунке 3.6. Использовался лазер на длине волны 532 нм, излучение которого фокусировалось с помощью масло-иммерсионного объектива (увеличение 100х, числовая апертура NA=1,4) на образец, создавая интенсивность в фокусе Iex = 1,5 х 105 Вт/см2. Основные результаты оптического имиджинга образца представлены на Рисунке 4.6.
Характеризация частиц нанорубинов, приготовленных на покровном стекле микроскопа, (а) Изображение, полученное с помощью флуоресцентного лазерно-сканирующего микроскопа с возбуждением от лазера на 532 нм (1ех = 1,5x105 Вт/см2) и (Ь) соответствующее изображение, полученное с помощью атомно-силового микроскопа, где кружками обозначены общие черты изображений. На (с) области АСМ изображения увеличены, чтобы позволить измерение размера НЧ. Фотолюминесцентные спектры частиц 1 и 2 показаны на (d), их кривые насыщения представлены на вставке. График ФЛ от времени представлен на (е), который интерполирован одиночной экспонентой для частицы 1 и двойной экспонентой для частицы 2. Яркость ФЛ частиц в продолжении времени наблюдения при непрерывном возбуждении Iex = 1,5x105 Вт/см2 представлена на (f). Воспроизведено по ссылке [41].
На ФЛСМ изображении хорошо видны яркие эмиттеры, которым соответствуют изображения одиночных частиц на АСМ изображении. Спектр ФЛ при комнатной температуре частицы 1 (высота 24 нм) на Рисунке 4.6(c) выявляет две характерные спектральные линии рубина, R1 and R2, как это видно на Рисунке 4.6(d). В то же время частица 2 (высота18нм) излучает в широком спектральном диапазоне 686 - 900 нм. Данные по насыщению ФЛ, показанные на вставке Рисунка 4.6(d), интерполированы выражением
Время жизни ФЛ (тгиьу) изучалось с помощью импульсного лазера на 532 нм, и результаты представлены в Рисунке 4.6(e). тгиЬу = 3,7±0,1 мс для частицы 1, в то время ФЛ частицы 2 интерполировалась биэкспоненциальной кривой с коротко- и долго-живущими компонентами, соответственно, 0,32±0,01 мс и 3,9±0,1 мс, с фактором 3 разницы между первым и вторым компонентом. Заметим, все типы нанорубинов были исключительно фотостабильными, не показывая никаких признаков фотодеградации при облучении в течение 30 мин непрерывным лазером \ех = 1,5 х 105 Вт/см2, как это показано на Рисунке 4.6(f). С другой стороны, флуорес центный органический краситель Родамин 6Ж совершенно обесцветился в течение 5 мин при той же интенсивности облучения.
Соискатель и соавторы также оценили квантовый выход (г]сг) НЧ рубина, используя метод, основанный на анализе среднего значения тгиьу в синтезированных коллоидных НЧ в сравнении с объёмным рубином. Здесь представлен расчёт нижней границы г]гиьу для на-ночастиц рубина с обнаруженными бесфононными линиями Ri и R2. Анализ, приведённый в разделах 1.3.2 и 8.6 этого труда, даёт значение темпа испускания в наночастице рубина kcr = 65,6 s_1. Это значение используется, чтобы определить квантовый выход нанорубина, зная тгиьу = 3,7 мс определённого ранее на основе анализа данных Рисунка 4.6(e). Среднее значение тег для нанорубинов определено как 3,8 мс. Подставляя значения ксг и то в Выражение 1.1, получается r/cv = (25±2)%.
Широкий спектр, наблюдаемый в частице 2, был аналогичен спектру, наблюдаемому Ку-линкиным и др., где он был идентифицирован с излучением Сг в 7 кристаллической фазе А120з [88]. Это значит, что большая часть НЧ, произведённых методом лазерной абляции, существует в 7- кристаллической фазе. Однако, следует заметить, что то превышает 1 мс, делая оба типа НЧ пригодными для оптического имиджинга с использованием метода отложенной регистрации, как это описано в Разделе 4.4.
Для демонстрации ключевых преимуществ нанорубинов в оптическом имиджинге в схему экспериментальной установки (Рисунок 4.6) был встроен модуль отложенной регистрации. Лазер непрерывного действия был заменён пикосекундным диодным лазером (Pico-Quant LDH-P-FA-530), генерирующим импульсы длительностью 44 пс с энергией 37 пДж в импульсе. Параметры импульсов контролировались TTL-импульсами одного канала электронного блока (SpinCore Pulse Blaster Plus). Второй канал использовался для запуска/выключения лавинного фотодиода, реализуя программируемую временную задержку между импульсом возбуждения и началом фотодетектирования - основная концепция метода отложенной регистрации. Добавление делителя частоты (FAST ComTech MCS6) позволяло также измерение времени ФЛ ТгиЬу.
Метод отложенной регистрации тестировался на образце, представляющим собой дискретные нанорубины, распределённые на стеклянной подложке, покрытые слоем Родамина 6Ж. Время жизни флуоресценции Родамина 6Ж примерно 4 нс на длине волны 551 нм, что тгиъу. Было получено изображение образца без и с применением метода отложенной регистрации. Анализ изображений демонстрирует значительное увеличение контраста изображения нанорубинов, количественно оцененное как 75 раз (20 dB). Было зарегистрировано полное подавление оптического фона, и контраст нанорубинов определялся в данном предельном случае как Е х Iex/NAPD, где Е обозначает эффективность конверсии (rjaa), a NAPD - собственные шумы лавинного фотодиода (и/или дробовые шумы ФЛ сигнала).
Для экспериментов по обнаружению нанорубинов в клетках использовалась генномоди-фицированная культура клеток яичника китайского хомяка (СНО-К1, см. более подробное описание в Работе [176]), приобретённая у компании Perkin Elmer. Культура выращивалась с использованием стандартного протокола. Коллоидный раствор нанорубинов, приготовленный в соляном фосфатном буфере (PBS) с 4 % сыворотки, добавлялся в клеточную культуру, а по истечению 2 дней клетки отмывались. Для маркирования клеточной мембраны использовались квантовые точки (Qdot605 ITK, Invitrogen) с карбоксилированной поверхностью. КТ были приготовлены в PBS (с добавкой 0,1 % BSA, 20 мМ D-Глюкозы, 0.9 мМ СаСЬ и 0,5 мМ MgCl2). Маркирование производилось при температуре 4 С, а затем клетки отмывались и фиксировались.
На предварительном этапе были проведены наблюдения нанорубинов в клетках, необработанных КТ. Даже с выключенным модулем отложенной регистрации нанорубины достаточно заметны на фоне аутофлуоресценция клеток, как яркие пятна микронного диаметра, что приблизительно соответствует дифракционному пятну. При включении модуля отложенной регистрации сигнал аутофлуоресценции клетки был полностью подавлен. Скорее всего, зарегистрированные сигналы исходили от одиночных нанорубинов. В силу этого предположения говорят следующие соображения. Во-первых, интенсивность зарегистрированного сигнала примерно соответствовала интенсивности сигналов НЧ, которые идентифицированы ранее как одиночные с помощью АСМ. Например, интенсивность одиночного сигнала составляла 2х104 счётов фотонов в секунду при /еж=500 Вт/см2. Это примерно соответствует сигналу частицы 2 (24 нм) на Рисунке 4.6, составляющему 1х105 счётов в секунду. Во-вторых, в каждом отдельном случае дифракционного пятна две характерные узкие линии Ri и R2 рубина были спектрально разрешимы. Отметим, что в случае агрегатов или поликристаллов рубина эти линии неразрешимы или уширены.
На следующем этапе записывались изображения клеток, маркированных КТ. Спектр эмиссии КТ находится на длине волны 605 нм с шириной 40 нм и TQD= 60 не. Рисунок 4.7 представляет результаты сравнений изображений, полученных (а) без оптимизированной спектральной фильтрации, т.е. с использованием дихроичного зеркала; (Ь) со спектральной фильтрацией, оптимизированной для регистрации ФЛ рубина; (с) со включённым модулем отложенной регистрации. Как и ожидалось, спектральная фильтрация существенно подавляет сигналы аутофлуоресценции клеток и КТ, в то время как отложенная регистрация подавляет их полностью. Значительное подавление фона и улучшение качества изображения наглядно демонстрируется на ЗД псеводцветных изображениях на нижних панелях на Рисунке 4.7.
Коллоидная стабильность нанорубинов и нанокорундов
Проникновение наноматериалов в кожу помимо, собственно, свойств наноматериалов также зависит от свойств кожи и путей проникновения НЧ. В случае гидрофобных НЧ наиболее вероятным транспортным каналом является липофильный межклеточный путь, в случае гидрофильных НЧ - гидрофильный внутриклеточный путь. Очевидно, что даже в случае, например, миграции гидрофобной НЧ в межклеточном пространстве SC, неоднородность ли-пофильной среды будет играть существенную роль, создавая барьеры, затрудняющие проникновение НЧ. SC является комплексной многофазовой мембраной, состоящей из слоев корне-оцитов, сцементированных плотно упакованными липидными слоями. В связи с этим, измерение локальных свойств гетерогенного SC, таких как вязкость среды, приобретает важное значение для изучения транспорта НЧ в коже. Диффузия низкомолекулярных флуорофоров представляет собой удобную модель для картирования диффузионных свойств кожи. Недавно был разработан метод, называемый восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания (Fluorescence recovery after photobleaching, FRAP) для оценки локальной диффузии в коже [8].
В представляемой работе мы воспользовались измерительными возможностями методики FRAP, которые были реализованы посредством нелинейного оптического микроскопа [5]. Был измерен коэффициент диффузии (T RhB) органического флуоресцентного красителя Родамина В (молекулярный вес Mw = 479 атомных единиц, а.и.) в ЛИПИДНОЙ фазе SC. Разработанная в соавторстве с проф. Анисимовым методика измерения локальных значений D/y в SC позволяет картировать диффузионные свойства кожи с разрешением от нескольких микрон до долей миллиметра.
Методика FRAP основана на фотообесцвечивании красителя в локальном объёме с помощью лазера высокой интенсивностью возбуждения. Например, в случае описываемого эксперимента площадь размером, приблизительно, 12мкм2 фотообесцвечивалась фемтосекунд-ным лазером. Длина волны лазера была настроенного на возбуждение Родамина В, которым был окрашен образец рогового слоя кожи человека. Сфокусированное пятно лазер многократно сканировалось по заданной площади образца, а мощность лазера устанавливалась существенно превышающей обычные значения, используемые для оптического имиджинга, т.е. Рех 100 Вт при обычных мощностях Рех 10 Вт. Изображение фронтального оптического сечения, полученного с помощью той же системы НЛОМ, только при существенно меньшей возбуждающей мощности фемтосекундного возбуждающего излучения, показано на Рисунке 6.6(a). Хорошо заметно тёмное пятно на фоне флуоресцентного сигнала, которым был окрашен весь образец кожи. Также было продемонстировано, что размер фотообесцве-ченного пятна ограничен, примерно, 4 мкм в осевом измерении (не показано на Рисунке), что определялось осевой функцией размытия точки системы НЛОМ, предварительно измеренной в эксперименте. Продолжение эксперимента заключалось в наблюдении за эволюцией фото-обесцвеченного тёмного пятна, которое начинало восстанавливаться сразу по прекращению процесса фотообесцвечивания. НЛОМ изображения исследуемого фрагмента кожи захватывались, а флуоресцентный сигнал с фотообесцвеченного участка анализировался. Результаты эксперимента представлены на графике на Рисунке 6.6(b), где экспериментальная кривая обозначена квадратиками. Хорошо видно, что интенсивность флуоресценции, просуммированная по всем пикселям фотообесцвеченного участка, резко падает при воздействии лазера большой мощности с последующим медленным восстановлением.
Была разработана упрощённая теоретическая модель FRAP, в которой предполагается однородное распределение красителя в моделируемом объёме VPB- Объём упрощённо моделировался цилиндром с диаметром d = 5 мкм и высотой h = 4 мкм. Степень фотообесцвечивания оценивалась безразмерным параметром а от 0 (полное фотообесцвечивание, сигнал
Изображение SC, полученное с помощью НЛОМ, на котором в виде тёмного круга показано пятно фотообесцвеченного флуоресцентного красителя Родамина В (отмечено белой стрелкой). Масштабный отрезок, 20мкм. (Ь) График экспериментально полученного сигнала возбуждённой флуоресценции от времени для SC (квадраты), а также интерполяция этих данных методом регрессии (сплошная линия) с использованием аналитической функции разработанной теоретической модели. Воспроизведено со ссылки [5]. флуоресценции падает до 0) до 1 (сигнал флуоресценции остаётся неизменным). Таким образом, концентрация красителя C(r,t = 0) сразу после фотообесцвечивания, т.е. в момент времени t = 0, была постоянна вне и внутри объёма VPB, равняясь, соответственно, Со и аСо- Концентрация красителя в объёме менялась в соответствии с известным уравнением диффузии:
Интегральная флуоресценции красителя F(t) в VPB резонно предполагается пропорциональной С(г,), и находится интегрированием C(r,t) по всему фотообесцвеченному объёму. Уравнение 6.2 решалось методом Фурье-анализа, в результате чего было получено следующее аналитическое выражение:
В этом выражении функции І0, Д - гиперболические функции Бесселя первого рода, соответственно, 0-го и 1-го порядков, erf - функция ошибки. Полученное аналитическое выражение 6.3 было использовано для интерполяции экспериментальных данных на графике Рисунка 6.6(b) посредством варьирования параметров а и DRhB- В результате получена хорошая теоретическая интерполяция данных эксперимента. Прежде проведения экспериментов на коже измерительная методика была откалибрована посредством измерения коэффициента диффузии в глицерине [Dg = (3, 2 ± 0, 5) х Ю-9 см2с-1], и сравнения его с табулированными значениями (Dg = 5, 6 х Ю-9 см2с-1). Отличное согласие измеренного значения с табулированным значением подтвердило применимость разработанной методики к более сложным средам, таким как гетерогенная биологическая ткань SC.
Как хорошо видно на Рисунке 6.6(b) теоретическая модель отлично описывает экспериментальные данные FRAP, полученные в эксперименте на SC человеческой кожи. В результате было определено значение коэффициента диффузии Родамина В в SC: DRhB = (3,5 ±1,0) х 10_9см2с-1. Это значение оказалось существенно меньше значения коэффициента диффузии, измеренного методом FRAP в искусственном липидном бислое DfthB = (19,2 ±1,7) х 10 9см2с-1 [74]. Разницу можно объяснить, во-первых, более высокой температурой 21 С, при которой проводили измерения Джонсон и др.; во-вторых, существенно меньшая подвижность молекул в роговом слое кожи резонно объясняется компартментализа-цией этого гетерогенного слоя, что задерживает транспорт молекул.
Разработанная методика оказалась очень полезной для измерения локальной диффузии в биоткани, причём, очевидна возможность применения методики для in vivo измерений. Для конкретного исследования по картированию коэффициентов диффузии в коже метод FRAP имеет дальнейшее развитие посредством выбора подходящего для изучения гидрофильного или липофильного флуорофора, области и размера области исследования, что позволит систематическое изучения транспорта через корнеоциты и их кластеры.