Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 19
1.1. Получение гомогенного стабилизированного препарата мембранных белков, в частности рецепторов класса GPCR, для исследования рентгеноструктурным анализом.
1.1.1. Экспрессионные системы для интегральных мембранных белков человека. 21
1.1.1.1. Экспрессия в E. coli 23
1.1.1.2. Экспрессия в других бактериальных штаммах 24
1.1.1.3. Экспрессия в дрожжевых системах 25
1.1.1.4. Экспрессия в бакуловирусной системе экспрессии в клетках насекомых 25
1.1.1.5. Экспрессия в бесклеточной системе 27
1.1.1.6. Экспрессия в клетках млекопитающих 28
1.1.1.7. Другие перспективные системы экспрессии 30
1.1.2. Стратегии стабилизации интегральных мембранных белков и подготовки их для рентгеноструктурного анализа 31
1.1.2.1. Описание использования химерных белков для стабилизации и получения структуры представителей класса GPCR з
1.1.2.2. Оптимизация детергента и стабилизирующее влияние липидной кубической фазы. Солюбилизация и выбор оптимального носителя для белка. 36
1.1.2.3. Другие методы стабилизации интегральных мембранных белков.
1.1.2.3.1. Стабилизирующее влияние лигандов 42
1.1.2.3.2. Антитела и нанотела 42
1.1.2.3.3. Кристаллизационные шапероны 43
1.1.2.3.4 Точечные мутации 43
1.2. Разработка современных биофизических технологий как ключевой фактор развития исследований ИМБ: автоматизация и миниатюризация 44
1.2.1. Создание методики кристаллизации нанолитрового масштаба в липидной кубической фазе LCP 45
1.2.2. Технологии исследования микрокристаллов ИМБ 50
1.3. Обзор по физиологии и фармакологии эндотелиновой системы. 53
1.3.1. Эндотелиновые рецепторы и их физиологическая роль 55
1.3.2. Физиологическая роль эндотелиновой системы человека 57
1.3.3. Современное состояние области разработки лекарственных средств, направленных на эндотелиновые рецепторы 59
ГЛАВА 2. Материалы и методы 63
2.1. Материалы 63
2.1.1. Реактивы 63
2.1.2. Штаммы E.coli, использованные для генетической работы 63
2.1.3. Ферменты: 64
2.1.4. Плазмидные векторы 64
2.1.5. Питательные среды для роста бактериальных культур 64
2.1.6. Используемые клеточные культуры 65
2.1.7. Питательные среды для роста клеточных линий насекомых штамма sf9 65
2.1.8. Реагенты для трансфекции клеток насекомых 65
2.1.9.Реагенты для проточной цитофлюориметрии 65
2.1.10. Липиды и Детергенты: 65
2.1.11. Ингибиторы протеаз 66
2.1.12. Лиганды GPCR рецепторов 66
2.1.13. Хроматографические смолы и колонки 68
2.1.14. Антитела, мембрана и субстрат для иммуноблоттинга 68
2.1.15. Флуоресцентные красители 69
2.1.16. Концентрационные фильтры 69
2.1.17. Плашки и наборы для подбора кристаллизационных условий 69
2.1.18. Инструменты для извлечения кристаллов, петли 69
2.2. Методы 70
2.2.1. Получение генетических конструкций 70
2.2.1.1. Стандартные методики 70
2.2.1.2. Постановка ПЦР 70
2.2.1.3. Клонирование генетической конструкции в вектор pFastBac 71
2.2.1.4. Получение рекомбинантной бакмиды. 72
2.2.1.5. Трансфекция клеток насекомых бакмидной ДНК
2.2.2. Экспрессия GPCR рецепторов при помощи бакуловирусной системы экспресии в клетках насекомых 74
2.2.3. Измерение заражающего титра бакуловируса 74
2.2.4. Измерение уровня полной и поверхностной экспрессии 75
2.2.5. Получение изображения клеток при помощи конфокальной микроскопии 76
2.2.6. Измерение уровня жизнеспособности клеток 76
2.2.7. Получение клеточных мембран 77
2.2.8. Солюбилизация 77
2.2.9. Препаративная хроматографическая очистка GPCR рецепторов
2.2.10. Ферментативное дегликозилирование 79
2.2.11. Белковый гель-электрофорез и Вестерн-Блоттинг 79
2.2.12. Аналитическая гель-фильтрационная хроматография 80
2.2.13. Анализ термостабильности белка 80
2.2.14. Анализ подвижности молекул белка в липидной кубической фазе. 81
2.2.15. Кристаллизационные тесты 83
2.2.16. Методика визуализации кристаллов 84
2.2.17. Методика извлечения кристаллов из кристаллизационной пробы 84
2.2.18. Тестирование дифракционных свойств кристаллов на синхротроне 85
2.2.19. Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа. 85
2.2.20. Исследование кристаллизационных фаз методом малоугловой рентгеновской диффракцией (SAXD) 86
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 88
3.1. Отработка методологии исследования GPCR рецепторов на примере 2-адренергического рецептора 88
3.2. Эндотелиновый рецептор В.
3.2.1. Описание объекта исследования 92
3.2.2. Создание генно-инженерных конструкций 95
3.2.3. Исследования поверхностной экспрессии рецептора 106
3.2.4. Визуализация экспрессии методом конфокальной микроскопии 115
3.2.5. Стратегия солюбилизации и очистки рецептора 116
3.2.6. Использование лигандов 117
3.2.7. Масс-спектрометрический контроль 120
3.2.8. Анализ на термостабильность 122
3.2.9. Исследование подвижности рецептора в липидной кубической фазе при помощи методики FRAP
3.2.10. Тестирование формируемых липидных фаз методом малоуглового рентгеновского рассеяния. 133
3.2.11. Кристаллизационные испытания. 135
Заключение 137
Основные выводы работы 137
Опубликованные работы по теме диссертации 138
Благодарности 140
- Экспрессия в бакуловирусной системе экспрессии в клетках насекомых
- Штаммы E.coli, использованные для генетической работы
- Препаративная хроматографическая очистка GPCR рецепторов
- Визуализация экспрессии методом конфокальной микроскопии
Введение к работе
Актуальность работы
Актуальность исследования рецепторов класса GPCR
Исследование GPCR, в том числе биофизическими и спектроскопическими методами, и, в первую очередь, определение структуры методом рентгеноструктурного анализа имеет принципиальное значение, как для фундаментальной науки, детального понимания функционирования рецепторов, так и для медицины и фармацевтики. Эта работа вносит весомый вклад в определение механизмов распознавания лигандов и передачи сигналов внутрь клетки, что в итоге должно привести к более эффективной разработке лекарственных препаратов, имеющих своими мишенями данный класс мембранных белков. Разработка лекарств, имеющих своими мишенями суперсемейство GPCR, имеет огромное значение. Исследования и разработки, связанные с GPCR, составляют ядро современной медицины [13].
Информация о структуре высокого разрешения данных рецепторов также
является основой для компьютерных разработок лекарственных веществ (Structure-
based drug design, ),
радикальным образом сокращая временные и финансовые затраты на пути получения
новых эффективных лекарственных препаратов [14,15].
Однако рецепторы класса GPCR, как известно, чрезвычайно трудно кристаллизуются, в первую очередь из-за своей высокой конформационной динамики. В настоящее время известны структуры высокого разрешения только 32 из более 800 различных GPCR рецепторов и, как правило, только в одном из функциональных состояний.
Прорыв в направлении структурных исследований был осуществлен в 2007 году командой из Исследовательского Института Скриппса, США, в сотрудничестве со Стэндфордским Университетом, США [11], и отмечен Нобелевской премией 2012 года по химии. Такие исследования и разработки являются чрезвычайно наукоемкими и, кроме того, требуют мультидисциплинарного подхода и высочайшего уровня научных кадров для решения фундаментальных проблем, стоящих на пути к успеху.
Помимо Института Скриппса и его партнеров, данной тематикой активно занимаются такие ведущие мировые центры, как Стэндфордский Университет, США, Лаборатория Молекулярной Биологии в Кембридже, Великобритания, Институт Пола Шеррера в Швейцарии, а также такие фармацевтические компании как Heptares, Receptos, Eli Lilly, Takeda, Novartis, Amgen, Pfizer и другие. Разработка новых лекарственных препаратов на основе структурных исследований GPCR рецепторов начинает приносить первые успешные результаты: в 2012 году Receptos запустил
клинические испытания лекарственного препарата, направленного на лечение рассеянного склероза, в 2013 году Heptares приступил к клиническим испытаниям лекарства против заболевания Альцгеймера.
Актуальность исследования эндотелиновых рецепторов
Эндотелиновые рецепторы ETA и ETB активируются тремя эндогенными 21-аминокислотными циклическими пептидами, ET-1, ET-2, and ET-3 и управляют различными физиологическими процессами, включая сокращение стенок сосудов, их расслабление и стимуляцию клеточной пролиферации [16].
Таким образом, они играют роль в патогенезе гипертензии, атеросклероза, инфарктов, болезней почек и различных форм рака. Хотя эндотелиновые рецепторы исследовали на протяжении 25 лет и к ним было подобрано более 1,000 низкомолекулярных лигандов-антагонистов, только два из созданных на основе этой библиотеки лекарства прошли клинические испытания. Проблема заключается в том, что точный механизм активации и работы рецептора до сих пор остаётся неясен, в том числе и в аспекте последующего преимущественного запуска того или иного сигнального пути [17, 18].
Кристаллографические структуры эндотелиновых рецепторов с высоким разрешением, определенные в различных функциональных состояниях, в особенности в комплексе с антагонистами, дадут возможность прояснить механизмы передачи сигнала через них, молекулярного базиса их функционирования и будут служить в качестве основы для рационального поиска нового поколения лекарственных препаратов.
Основные задачи исследования
При решении задачи определения структурно-функциональных свойств трансмембранных белков вообще и GPCR рецепторов в частности, в первую очередь возникает проблема получения гомогенного, стабильного препарата объекта исследования в достаточных количествах (десятки миллиграмм). Прямая экстракция из организма человека, как правило, невозможна, поэтому приходится прибегать к той или иной системе гетерологической экспрессии.
Данная работа является начальным этапом большого технологического процесса по исследованию этих рецепторов, который заключается в том, что необходимо получить гомогенный препарат целевых рецепторов, провести их функциональное тестирование, получить кристаллы с хорошими дифракционными свойствами и определить пространственную структуру высокого разрешения для определения механизмов, лежащих в основе ассоциированных с ними дисфункций. Эта задача
является сложной из-за амфифильной природы рецепторов (они являются интегральными трансмембранными белками) и их низкой стабильности [19]. Установление пространственной структуры, наряду с различными биофизическими и спектроскопическими исследованиями, позволит лучше понять физиологические процессы, обуславливаемые работой этих рецепторов и приступить к рациональному дизайну лигандов с заданными свойствами, являющихся потенциальными лекарственными средствами.
В ходе данной работы была перенесена и протестирована технологическая платформа для исследований GPCR рецепторов на примере человеческого 2 адренергического рецептора.
В дальнейшем это позволило решить основную задачу работы - получение стабильного эндотелинового рецептора в мономерном состоянии с большим выходом, что включало в себя:
-
Создание оптимальной конструкции человеческого эндотелинового рецептора B с точки зрения уровня экспрессии, гомогенности и стабильности.
-
Экспрессию данной конструкции при помощи бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых штамма Sf9.
-
Проведение очистки и стабилизации рекомбинантного рецептора в мономерном состоянии.
-
Исследование физико-химических свойств полученного рецептора.
Научная новизна
Впервые в данной работе проведено комплексное исследование эндотелиновых рецепторов - новых, ещё не изученных мишеней из семейства GPCR. Впервые получены и экспрессированы генетические конструкции эндотелиновых рецепторов, содержащих модификации, стабилизирующие белок и способствующие образованию необходимых кристаллизационных контактов, и проведена наработка таких рекомбинантных белков в миллиграммовом масштабе.
Впервые получен стабилизированный препарат человеческого эндотелинового рецептора В, подходящий для дальнейших структурных исследований. Исследованы его физико-химические характеристики, выбран оптимальный лиганд-партнёр для кристаллизации с антагонистом.
Проведены исследования мобильности полученного белка в липидной кубической фазе при помощи методики микроскопии восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP). Подобраны стабилизирующие условия для кристаллизации, включая выбор преципитанта, и
произведены кристаллизационные испытания.
Практическая значимость
Был отработан технологический процесс исследований GPCR рецепторов на примере тестового объекта - 2 адренергического рецептора.
Полученные результаты по экспрессии, очистке и стабилизации эндотелинового рецептора ЕТв являются основой для последующего получения и оптимизации кристаллов (включая кристаллы других представителей семейства GPCR и других трансмембранных белков), определения их пространственной структуры, и в конечном итоге, разработки потенциальных лекарственных средств, нацеленных на эти рецепторы.
Методы исследования
В работе были использованы следующие методы и технологии:
Генетическая инженерия для создания плазмидных конструкций
Получение белков при помощи бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых
Конфокальная микроскопия
Проточная цитофлуориметрия
Методы очистки мембранных белков: получение очищенных мембран, их солюбилизация, аффинная хроматография
Методы анализа белка: гель-электрофорез, иммуноблоттинг, анализ термостабильности, аналитическая гель-фильтрационная хроматография
Масс-спектрометрия
Анализ подвижности молекул белка в липидной кубической фазе
Кристаллизация мембранных белков методом in meso, визуализация кристаллов
Исследование кристаллизационных фаз методом малоугловой рентгеновской дифракции
Рентгеноструктурный анализ
Положения, выносимые на защиту
Генетическая конструкция, кодирующая рекомбинантный человеческий эндотелиновый рецептор В EТв-BRIL, включающий последовательности ETB(S65-S407) и апоцитохрома BRIL в третьей внутриклеточной петле EТВ между положениями К304 и К316, позволяет получить достаточное количество и качество белка для структурных исследований.
Экспериментальный подход, включающий в себя экспрессию конструкции EТВ-BRIL при помощи бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых,
процедуру получения и стабилизации белка, позволяет получить препарат гомогенного и стабилизированного рекомбинантного человеческого эндотелинового рецептора B, подходящего для кристаллизации и структурных исследований.
Показано, что лиганд-партнёр IRL2500 является оптимальным для кристаллизации рецептора ETB – BRIL.
Показано, что предложенный в работе состав преципитанта позволяет стабилизировать рецептор и обеспечить его диффузию в липидной кубической фазе
Апробация результатов работы
Основные результаты работы докладывались на следующих научных конференциях и семинарах:
-
Конгресс федерации европейских биохимических сообществ (FEBS, Париж, 2014),
-
Конгресс федерации европейских биохимических сообществ (FEBS, Санкт-Петербург, 2013),
-
1-я Международная конференция «Модели инновационного развития фармацевтической и медицинской промышленности на базе интеграции университетской науки и индустрии» (Долгопрудный, 2011),
-
Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2014» (Москва, 2014),
-
Международная научная конференция SANS-YuMO User Meeting 2011 (Дубна, 2011),
-
IV Международная конференция ФизтехБио (Долгопрудный, 2014),
-
Международная конференция «Структура и функции биомембран 2014» (Долгопрудный, 2014),
-
Международная научная конференция Научного парка СПбГУ «Трансляционная биомедицина: современные методы междисциплинарных исследований в аспекте внедрения в практическую медицину», (Санкт-Петербург, 10 - 12 Ноября 2015),
-
Международная конференция «Биомедицинские инновации для здорового долголетия» (25-28 апреля 2016, Санкт-Петербург, Россия).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 статей в рецензируемых журналах, входящих в список, утверждённый Высшей аттестационной комиссией.
Структура и объём работы
По своей структуре диссертационная работа состоит из введения, трёх глав, списка литературы. Объём диссертации составляют 157 страниц текста, включая 35 рисунков и 1 таблицу. Список использованных источников содержит 204 наименования.
Экспрессия в бакуловирусной системе экспрессии в клетках насекомых
Интегральные мембранные белки играют важнейшую роль в осуществлении многих физиологических процессов, таких как внутриклеточный транспорт, передача биохимического сигнала, создания межклеточных контактов, контроль клеточного гомеостаза, осуществление скоординированной активности клеток в организме. Дисфункции биохимических путей, связанных с этими белками приводят к различным серьезным системным патологиям - сердечно-сосудистым, нейродегенеративным, аутоиммунным, онкологическим, что делает трансмембранные ионные каналы, транспортеры и рецепторы важнейшими мишенями для создания направленных лекарственных средств [ 18 ]. Для установления механизмов их функционирования необходимо получение трехмерной структуры высокого разрешения и исследование различными биофизическими методами. Наиболее успешным методом определения трехмерных структур белков с высоким разрешением является рентгеноструктурный анализ [19].
Наряду с рентгенноструктурным анализом широко используются другие методы, такие как спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР, как жидкостная, так и твердотельная), а также электронная микроскопия и дифракция.
Несмотря на то, что трехмерная структура известна для десятков тысяч водорастворимых белков (более 42000 в PDB по состоянию на середину 2016 года), в случае ИМБ известна структура 642 уникальных белков, из них около 10-15% - это структуры ИМБ человека, обладающих низкой стабильностью (базы данных blanco.biomol.uci.edu/mpstruc, sbkb.org, pdb.org). В работе с ИМБ человека имеется ряд принципиальных трудностей, что делает их особыми объектами для исследований. Первая из них – это, как правило, низкий уровень экспрессии как in vivo, так и в гетерологических системах экспрессии. Первые закристаллизованные ИМБ млекопитающих -родопсин, АТФ-синтаза, Са-атфаза - имеют достаточно высокий уровень in vivo экспрессии. Но в остальных случаях, касающихся в том числе фармакологически важных мишеней, прямая экстракция ИМБ из организма человека практически невозможна (исключение составляют некоторые белки возобновляемых клеток крови). Поэтому далее наука пошла по пути поиска и оптимизации гетерологических систем экспрессии, что подробнее описано в главе 1 обзора литературы.
Вторая трудность заключается в низкой стабильности ИМБ человека. Для кристаллизации и характеризации ИМБ различными биофизическими методами необходимо экстрагировать белок из привычного для него окружения липидного бислоя, что приводит к физико-химическому стрессу. В ряде случаев необходимо прибегать к различным стратегиям стабилизации ИМБ. К примеру, используется ряд подходов, описанных в разделе 1.2 обзора литературы. В частности, именно успех в разработке методик стабилизации GPCR рецепторов привёл к прорыву в области получения их структур.
Третья трудность связана со сложностью кристаллизации ИМБ, необходимостью развития высокопроизводительного подхода в кристаллизации и биофизическом анализе образцов ИМБ. Четвертая трудность заключается в том, что зачастую кристаллы мембранных белков имеют характерный размер не более нескольких десятков микрон и поэтому возникает необходимость использования высокотехнологичных методов инструментального анализа, таких как измерения на микрофокусных установках синхротронных источников рентгеновского излучения третьего поколения, разработка методик серийной кристаллографии [ 20 ], в том числе с использованием рентгеновских лазеров на свободных электронах (XFEL)[21]. Успехи в этих направлениях описаны в разделе 1.2 обзора литературы).
По вопросу о выборе оптимальной гетерологической системы экспрессии для интегральных мембранных белков нет единого мнения и выбор, как правило зависит от свойств того или иного класса белков. При рассмотрении этого обычно учитывается ряд молекулярно-биологических, эргономических и экономических факторов:
Возможность высокого выхода белка (для структурных исследований необходимо получить не менее 1 мг очищенного белка на каждое выделение). Обеспечение правильной системы фолдинга, в том числе наличие ЭПР, аппарата Гольджи, подходящих шаперонов (см. пример серотонинового транспортёра, экспрессирующегося только в присутствии шаперона калнексина [ 22 ]), и встраивания в цитоплазматическую мембрану (или мембрану более подходящей органеллы) [23] или возможность обеспечения рефолдинга [ 24 , 25 ]. Также желательно наличие системы отщепления сигнальных последовательностей.
Штаммы E.coli, использованные для генетической работы
Все используемые в работе реактивы были категории не ниже о.с.ч. Для приготовления всех водных растворов и сред использовалась деионизованная вода, очищенная на двухступечатой установке Milli-Q (MilliPore, США) с модулем Elix (MilliPore, США). Электрическое сопротивление воды было не ниже 19 МОм. Реактивы растворов: трис основание, трис-HCl, HEPES основание, HEPES кислота, соляная кислота, гидроксид натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид магния, глицерин, глицин, АТФ, имидазол, ацетат натрия, 2-меркаптоэтанол, ДТТ, имидазол (Sigma, США) метанол ( Merk, Германия).
Реактивы для генной инженерии: агароза для ДНК-работ, бромистый этидий (Helicon, Россия), уксусная кислота, маркер молекулярных весов 1 kB+ , буфер для нанесения на гель-электрофорез, смесь dNTP (Thermo, США),
Наборы реактивов для выделения и очистки ДНК: «QIAprep Spin Miniprep Kit», «GelElute Plasmid Miniprep Kit», (QIAGEN, Германия).
E.coli TOP10 (Invitrogene, США) Генотип: F- mcrA ( mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZM15 lacX74 recA1 araD139 ( araleu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG E.coli DH10 (BAC) (Invitrogene, США) Генотип: F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZM15 lacX74 recA1 endA1 araD139 (ara, leu)7697 galU galK -rpsL nupG/pMON14272/pMON7124 2.1.3. Ферменты
Phusion High Fidelity II- ДНК полимераза, Taq- ДНК полимераза, специфические эндонуклеазы рестрикции KpnI и Hind III, ДНК- лигаза фага Т4 (Thermo, США); пептид N- глюкозидаза PngaseF (Sigma, США).
В работе использовался плазмидный вектор pFastBac1-833100, предоставленный лабораторией Проф. В.Черезова из Университета Южной Калифорнии, США. Этот вектор представляет собой модифицированный вектор pFastBac1 (Invitrogen, США) с экспрессионной кассетой, содержащей на N конце перед началом гена целевого белка гемагглютининовую сигнальную последовательность, последовательности пептида FLAG, десять гестидинов и сайт щепления эндопротеазой TEV ( источник - вирус тобачной мозаики, tobacco etch virus). Ген ETB (ENDRB) был куплен в компании cdna.org (правильность сиквенса была независимо подтверждена). Также использовались последовательности апоцитохрома bRIL и T4L.
Для приготовления сред использовались бактериальный триптон, бактериальный агар, дрожжевой экстракт (Amresco, США). Среда LB (модификация Миллера) pH 7.5 ( 10 г/л бактериальный триптон, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl). LB -Agar ( LB с добавлением 20 г/л бактериального агара). LBakt (LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина, 100 мкг/мл канамицина, 10 мкг/мл тетрациклина (Sigma, США)). LB-Agarakt (LBakt с добавлением 20 г/л бактериального агара и 1мМ изопропил-в-D-1- тиогалактопиранозида (ИПТГ)). Среда для трансформации SOC ( 0.5% (w/v) дрожжевой экстракт, 2% (w/v) бактериальный триптон, 10 мM NaCl, 2.5 мM KCl, 10 мM MgCl2, 10 мM MgSO4, 20 мM глюкоза). 2.1.6. Используемые клеточные культуры Sf9 низкодифференцированная клеточная линия насекомого Spodoptera frugiperda (совка травяная) яичникового происхождения, Novagen, США.
Среда ESF 921 (Expression Systems, США) - основная ростовая среда. Среда для трансфекции (Expression Systems, США). Питательная добавка PBA (Expression Systems, США).
Концентраты рабочих жидкостей цитофлюориметра (Bacteriostatic Concentrate Solution, BD, Германия). Антитела, конъюгированные с флуоресцентными красителями: Моноклональное мышиное антитело против последовательности «FLAG» (DYKDDDDK) ANTI-FLAG M2-FITC (Sigma, США), конъюгированное с красителем FITC (поглощение 495 нм, эмиссия 519 нм) . Антитело против белка оболочки бакуловируса GP-64, конъюгированное с R-фикоэритрином (поглощение 496 нм, эмиссия 578 нм, Expression systems , США).
Препаративная хроматографическая очистка GPCR рецепторов
В качестве отработки методики исследований GPCR рецепторов проводились эксперименты по экспрессии, очистке, кристаллизации 2 адренергического рецептора и тестирование его кристаллов на рентгеновской установке ID23-1 синхротрона ESRF.
Конструкция 2 адренергического рецептора, соответствующая структуре под номером 3D4S из PDB ( http://www.rcsb.org/pdb/explore/remediatedSequence.do?structureId=3D4S&bionumbe r=1) была экспрессирована при помощи бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых, как описано во второй главе. Белок был экстрагирован, очищен и стабилизирован детергентной смесью ДДМ/ХГС и лигандом каразололом. В процессе очистки также проводилось дегликозилирование рецептора, т.к. известно, что в случае этого рецептора сахарные остатки затрудняют формирование его кристаллизационнных контактов.
Очистка белка проводилась по протоколу, описанному во второй главе. Выход очищенного и стабильного белка составил 0,8 мг из 1 литра культуры, чистота более 95%. Чистота белка оценивалась электрофоретически, концентрация измерялась при помощи аналитической гель-фильтрационной хроматографии с использованием колонки nanofilm SEC-250 (4.6x250 mm) (Sepax Technologies, США), используя калибровку колонки по известным концентрациям БСА (рис.3.1.).
Характеристика препарата человеческого 2 адренергического рецептора. Результаты (а) –денатурирующего гель-электрофореза в 12% ПААГ, стрелкой показана полоска, соответствующая целевому белку(б) –аналитической гель-фильтрации препарата на колонке Sepax nanofilm SEC-250 (4.6x250 mm) (Sepax Technologies, США). Стрелками указаны положения остаточных агрегатов, пик мономера и положение свободного лиганда. Были получены криссталлы 2 адренергического рецептора (рис.3.2) размером до 40 мкм и толщиной до 10 мкм методом кристаллизации in meso, описанным во второй главе. Рис. 3.2. Микроскопическое изображение кристаллов 2 адренергического рецептора. Состав преципитанта: Буфер 100 мМ бис-трис пропан pH 6.8, преципитирующий агент: 32% ПЭГ 400, Соль: 0,1 М натрий сульфат, добавка: 5% v/v 1,4 бутандиол Кристаллы были протестированы на станции ID 23-1 синхротрона ESRF. Максимальное разрешение дифракционной картины от неоптимизированных кристаллов составило 6,4 (рис.5). Рис.3.3. Дифракционная картина при характеризации кристаллов 2 адренергического рецептора 3.2. Эндотелиновый рецептор В.
Эндотелиновые рецепторы- представители суперсемейства родопсиноподобных (класс А) GPCR. ETB является предметом широких научных исследований уже на протяжении более 25 лет. В течение этого времени были определены его аминокислотная последовательность и топология, открыты эндогенные лиганды, активирующие этот рецептор, изучены экспрессия и локализация в организме человека, а также исследована его физиологическая роль. Имеются данные, полученные путем последовательного мутагенеза, о некоторых функционально важных аминокислотных остатках, активирующих внутриклеточные каскады [194 ]. Тем не менее, структура представителей эндотелиновых рецепторов в комплексе с антагонистом неизвестна. Стабильный, солюбилизированный и очищенный рецептор в монодисперсном состоянии необходим как начальный этап для перехода к кристаллизации и определения его пространственной структуры. В работе описываются первые шаги в этом направлении, нацеленные в дальнейшем на фармацевтические разработки лекарственных средств, регулирующих работу эндотелиновых рецепторов. GPCR рецепторы обладают низкой стабильностью, особенно после их выделения из нативной мембраны и солюбилизации в детергентных мицеллах. По этой причине до настоящего времени только один GPCR рецептор, родопсин, был закристаллизован в нативной форме (PDB ID 1F88), тогда как все другие подвергались тем или иным изменениям. Посттрансляционные модификации рецептора включают в себя пальмитоилирование цистеинов, находящихся в восьмой внутриклеточной спирали, фосфорилирование и, гликозилирование (в случае В рецептора на N конце). Эти модификации могут менять уровень функциональной активности рецептора и определять его направление в определённые компартменты после синтеза. Топологическая схема ETB («snake plot») представлена на рисунке 3.4.
Схематическое изображение ETВ [173]. Красными стрелочками показаны аминокислоты, изменение которых на подписанные замены приводят к существенным вариациям функции рецептора. Жёлтыми кружками выделены аминокислоты, про которых известно либо функциональное значение, либо конкретная пострансляционная модификация, либо они являются консервативными для GPCR. Стратегия белковой инженерии Для получения пригодных для кристаллизации лиганд-белковых комплексов мы применили стратегию белковой инженерии, которая зарекомендовала себя в структурных исследованиях более 30 различных рецепторов. Данная стратегия заключается в делеции неструктурированых участков и пришивании небольших стабильных водорастворимых белков, служащих драйверами для кристаллизации. Обычно необходимо произвести и протестировать несколько десятков конструкций для отбора лучших вариантов для последующей кристаллизации. У ETВ существуют различные варианты, являющиеся результатом альтернативного сплайсинга, слегка меняющие активность сигнала рецептора при сохранении силы связывания с лигандом и имеющие различную локализацию экспрессии. Для работы была выбрана каноническая последовательность эндотелинового рецептора, взятая из человеческой почечной и планетарной библиотеки кДНК
Визуализация экспрессии методом конфокальной микроскопии
Диаграммы из серии Б показывают, что PEG4000 не является эффективным преципитантом для ETB- BRIL, с точки зрения обеспечения мобльности в ЛКФ.
В ряде случаев проводилась запись полной кривой восстановления для исключения возможности появления артефактов и определения коэффициента диффузии. Для контроля правильности полученных оптимальных условий проводился анализ по методике FRAP full recovery - считывание полной кривой восстановления флуоресценции, типичные кривые восстановления показаны на рисунке 3.18.
Пример результатов контрольных экспериментов по записи полных кривых восстановления в режиме FRAP full recovery.
Восстановление сигнала флуоресценции происходит за счёт диффузии меченых молекул белка в липидной кубической фазе. Получение полной кривой восстановления флуоресценции позволяет узнать процент подвижных белков в липидной кубической фазе, их коэффициент диффузии при массиве различных условий, в то время как анализ FRAP-High Throughput позволяет определить только процент подвижных белков. Недостатком методики FRAP full recovery является то, что на прописывание кривой уходит минимум 30 минут времени на одну лунку. Однако, только на основании формы этих кривых (кривая насыщения) можно сделать окончательный вывод, что восстановление флуоресценции происходит за счет диффузии белка. Также можно использовать эту методику для проверки правильности режима считывания данных об уровне флуоресценции. Помимо этого, проводился визуальный контроль наличия восстановления флуоресценции.
Также проводился анализ уровня восстановления флуоресцентного сигнала после обесцвечивания с использованием коммерческих наборов Cubic Phase 132 (Qiagen, Германия) и MemGold (Molecular Dimensions, США) в качестве приципитанта (рис. 3.19 а-б). Эти наборы содержат широкий спектр химических условий, показавших свою эффективность для различных белков. Набор Cubic Phase 1 (Qiagen, Германия) отличается высокой концентрацией солей и, что характерно, при его использовании количество благоприятных условий относительно мало.
Относительный уровень восстановления флуоресценции при использовании кристаллизационных наборов Cubic Phase 1 (Qiagen, Германия). На диаграмме в клетках указана относительная доля восстановления сиганала флуоресценции. Красный цвет указывает на долю восстановления больше 20%, зелёный 10-20%, синий - менее 10%.
Относительный уровень восстановления флуоресценции при использовании кристаллизационных наборов MemGold (Molecular Dimensions, США). На диаграмме в клетках указана относительная доля восстановления сиганала флуоресценции. Красный цвет указывает на долю восстановления больше 20%, зелёный 10-20%, синий - менее 10%.
Анализ влияния средней длины цепи ПЭГ на подвижность эндотелинового рецептора В в липидной кубической фазе. Для этого анализа использовался комерческий набор преципитантов Cubic Phase 2 (Qiagen, Германия), в котором по вертикали варьируется тип ПЭГ, а по горизонтали различные типы солей. Как видно из рис 3.20, снижение уровня восстановления сигнала флуоресценции по мере увеличения средней длиной цепочки используемого в преципитанте ПЭГа приводит к затруднению диффузии эндотелинового рецептора В в липидной кубической фазе:
Рис.3.20. Относительный уровень восстановления флуоресценции при использовании кристаллизационных наборов Cubic Phase 2 (Qiagen, Германия). На диаграмме в клетках указана относительная доля восстановления сиганала флуоресценции. Красный цвет указывает на долю восстановления больше 20%, зелёный 10-20%, синий - менее 10%.
Кубическая фаза, уравновешенная преципитантами из наборов из Серии А п. 3.2.9 с pH 6, 7 была протестирована при помощи методики малоугловой дифракции рентгеновских лучей.
Для контроля образования липидных фаз в ряде случаев были определены параметры ячеек формируемых в равновесии фаз и тип симметрии фаз. Тип фаз и параметр решётки определялся определялся по позиции и соотношению пиков малоугловой дифракции, как описано в [204].
Для кристаллизации эндотелинового рецептора был применён метод кристаллизации в липидной кубической фазе [127]. Эксперимент проводился по протоколу, описанному во второй главе (раздел 2.2.1.19).
В качестве преципитантов тестировался широкий набор условий, базирующися на кристаллизационных наборах из п. 3.2.6. с добавлением различных добавок из Additive Screen (Hampton, США), состав которых описан в инструкции производителя.
В результате серии экспериментов из около тысячи различных преципитантов (Cubic Phase 1&2 (Qiagen, Германия), MemStart/MemSys, MemGold (Molecular Dimensions, США), Crystal Screen 1&2 (Hampton, США)) были получены возможные микрокристаллы в следующих случаях (представлены изображения во флуоресцентном микроскопе: длина волны возбуждения 550 нм, детекция эмиссии - 570 нм). Белок предварительно покрашен флуоресцентной краской Cy3 NHS Ester (Invitrogen, США), аналогично экспериментам по FRAP. Ниже приведены изображения этих микрокристаллов в флуоресцентом микроскопе (рис.3.21):