Полимерные мультислойные капсулы для обеспечения оптимального биоэффекта лекарственных препаратов и активных веществ Антипина Мария Николаевна

Содержание к диссертации

Введение

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Получение и общие свойства полимерных мультислойных капсул для контролируемой доставки активных веществ 19

Введение к Главе 1 19

1.1 Полимеры и межмолекулярные взаимодействия 20

1.1.1 Электростатические взаимодействия 20

1.1.2 Ковалентные реакции 21

1.1.3 Водородные связи 23

1.1.4 Молекулярное узнавание 24

1.1.5 Темплаты и размер

1.1.5.1 Полимерные сферы 24

1.1.5.2 Гидрогели 25

1.1.5.3 Микро- и наносферы мезопористого оксида кремния 26

1.1.5.4 Частицы фатерита 26

1.2 Общие способы контроля проницаемости капсулы 26

1.2.1 рН 26

1.2.2 Ионная сила 29

1.2.3 Окислительно-восстановительный потенциал 31

1.2.4 Химические стимулы

1.2.4.1 Растворитель 32

1.2.4.2 Глюкоза 33

1.2.4.3 СОг 33

1.2.4.4 Энзимы 34

1.2.5 Физические стимулы 35

1.2.5.1 Температура 36

1.2.5.2 Дистанционные воздействия: световое, магнитное, ультразвуковое 38

1.3 Способы инкапсулирования 42

1.3.1 Инкапсулирование водорастворимых соединений 42

1.3.2 Инкапсулирование водонерастворимых соединений 46

Выводы к Главе 1 47

2 Обзор литературы. Инкапсулирование некоторых классов биологически активных веществ 48

Введение к Главе 2 48

2.1 Инкапсулирование белков 48

2.2 Инкапсулирование нуклеиновых кислот 50

2.3 Инкапсулирование противораковых лекарственных средств 53

Выводы к Главе 2 з

3 Обзор литературы. Особенности получения фатерита методом смешивания растворов солей 55

Введение к Главе 3 55

3.1 Рост кристаллов карбоната кальция 56

3.2 Факторы, способствующие стабилизации фатерита

3.2.1 Азотсодержащие соединения 65

3.2.2 Белки 65

3.2.3 Полимеры 66

3.2.4 Двойные гидрофильные блоксополимеры 69

3.2.5 Дендримеры 69

3.2.6 Спирты 70

3.2.7 Микроогранизмы 71

Выводы к Главе 3 71

4 Результаты и обсуждения. инкапсулирование активных веществ, чувствительных к условиям окружающей среды 73

Введение к Главе 4 Защита активных веществ в процессе инкапсулирования - метод «молекулярных коктейлей» 74

Введение к разделу 4.1 74

4.1.1 Инкапсулирование матричной рибонуклеиновой кислоты 75

Введение к подразделу 4.1.1 75

4.1.1.1 Получение капсул, ингибирующих действие рибонуклеаз 76

4.1.1.2 Эффективностьзагрузки 79

4.1.1.3 Взаимодействие капсул с клетками 80

Выводы к подразделу 4.1.1 84

Материалы и методы 84

4.1.2 Инкапсулирование основного фактора роста фибробластов 88

Введение к подразделу 4.1.2 88

4.1.2.1 Адаптация метода «молекулярных коктейлей» для FGF2 89

4.1.2.2 Оптимальная концентрация FGF2 для клеток линии L929 фибробластов мыши 91

4.1.2.3 Цитотоксичность капсул ДекС/п-L-Ap 92

4.1.2.4 Скорость высвобождения FGF2 из капсул ДекС/п-L-Ap in vitro 93

4.1.2.5 Эффективность капсул in vitro 94

Выводы к подразделу 4.1.2 99

Материалы и методы 100

4.2 Предотвращение пероксидации полиненасыщенных жирных кислот с помощью капсул, обладающих антиоксидантными свойствами 103

Введение к разделу 4.2 103

4.2.1 Основной фактор пероксидации in vitro. Таниновая кислота для для создания защитного барьера 104

4.2.1.1 Получение и исследование стабильности капсул, содержащих слой Т9.ниновои кислохы. х ансіпсулииовсінис льняного МЗ.СЛЗ. 1 UT"

4.2.1.2 Предотвращение пероксидации инкапсулированного масла 108

4.2.2 Влияние типа и местонахождения антиоксиданта на эффективность антиоксидантной защиты 110

Выводы к разделу 4.2 112

Материалы и методы 113

Выводы к Главе 4 116

5 Результаты и обсуждения. Механизм спонтанного высвобождения заряженных биополимеров из капсул, стабилизированных электростатическими взаимодействиями 118

Введение к Главе 5 118

5.1 Оценка количества загружаемого белка 119

5.2 Влияние различных факторов на скорость высвобождения белка

5.2.1 Полимерная композиция и толщина капсулы 121

5.2.2 Градиент концентрации 123

5.2.3 Способ инкапсулирования 126

5.3 Механизм включения/высвобождения белка 128

Выводы к Главе 5 130

Материалы и методы 131

6 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ. Разработка капсул, подверженных дергадации посредством протеолитических ферментов 134

Введение к Главе 6 134

6.1 Инкапсулирование бычьего сывороточного альбумина в капсулы типа белок/полифенол и его последовательное высвобождение 137

6.2 Цитотоксичность капсул типа белок/полифенол 143

6.3 Включение и последовательное высвобождение водонерастворимого флуоресцентного красителя в капсулы типа белок/полифенол 144

6.4 Физические свойства мультислойной плёнки типа белок/полифенол 147

6.5 Условия хранения капсул типа белок/полифенол 149

Выводы к Главе 6 152

Материалы и методы 154

7 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ. Разработка капсул для применения в наномедицине 158

Введение к Главе 7 158

7.1 Получение наночастиц фатерита посредством смешивания растворов солей; влияние различных факторов на размер частиц 160

7.1.1 Синтез в чистой воде 160

7.1.1.1 Влияние концентрации солей 160

7.1.1.2 Влияние температуры среды 161

7.1.2 Синтез в присутствии полиолов 163

7.1.2.1 Влияние концентрации солей 163

7.1.2.2 Влияние температуры 164

7.1.2.3 Влияние количества полиолов 165

7.1.2.4 Влияние вязкости 166

7.1.2.5 Выход реакции образования СаС03 в присутствии полиолов 169

7.1.3 Особенности пористой структуры частиц, синтезированных в присутствии 170 полиолов, и адсорбции БАВ

7.2 Получение биосовместимых наноразмерных капсул для применения в

наномедицине 172

Выводы к Главе 7 175

Материалы и методы 177

Заключение 180

Литература

• Общие способы контроля проницаемости капсулы
• Инкапсулирование нуклеиновых кислот
• Факторы, способствующие стабилизации фатерита
• Скорость высвобождения FGF2 из капсул ДекС/п-L-Ap in vitro

Введение к работе

Актуальность темы. Лекарственные средства, проявляющие специфическую
направленную активность в поврежденных органах и тканях, смогут существенно
увеличить эффективность медикаментозного лечения многих заболеваний, снизить
вероятность побочных эффектов и облегчить лекарственную нагрузку на организм
пациента. Задача создания подобных препаратов связана с разработкой
микроскопических наноструктурированных «транспортных средств» – капсульных
систем, позволяющих изолировать биологически активные вещества (БАВ) от
окружающей среды и доставлять их строго к месту назначения. «Идеальная»
капсула должна быть изготовлена из биосовместимого материала, не вызывающего
воспалений или аллергических реакций, и содержать БАВ в количестве,
достаточном для того, чтобы помимо терапевтического эффекта обеспечить
оптимальные условия введения лекарства в организм. Проницаемость капсулы,
стабильность её структуры и средства контроля её попадания в клетки-мишени
должны учитывать широкий ряд факторов, включающих способ введения
препарата, условия, необходимые для достижения его оптимального

терапевтического эффекта, строение и биологические свойства мишени в
совокупности с её физико-химическим окружением. Таким образом,

инкапсулирование с целью доставки БАВ к месту назначения in vivo является комплексной задачей, требующей значительных фундаментальных и прикладных исследований на стыке биологии, физики, химии и клинической медицины.

В качестве первых транспортных средств для доставки БАВ были использованы вирусы, не способные к репликации, например ретровирус, аденовирус, адено-ассоциированный вирус и вирусы простого герпеса. Вирусы послужили эффективными переносчиками целевых ДНК в ядра клеток-мишеней, и до сих пор используются в биотехнологии; однако такие недостатки, как малая ёмкость, большие трудозатраты в сочетании с риском возникновения цитопатических эффектов и мутагенеза существенно ограничивают их применимость in vivo.

С появлением и развитием нанотехнологий и тераностики особый интерес
вызвало использование наночастиц, одновременно выполняющих роль

контрастного агента и транспортного средства для БАВ. Некоторые виды наночастиц уже находятся на стадии доклинических исследований, однако опасения вызывают их токсичность, тенденция к накоплению в тканях вместе с узким диапазоном размеров, разрешенных к использованию государственными исполнительными органами.

Самоорганизация макромолекул в живых системах – феномен, который в настоящее время является ключевым предметом исследования молекулярной

биофизики,¹ – побудила ученых на создание липосом и липидных и блоксополимерных везикул для инкапсулирования и доставки БАВ. Основные сложности при использовании липидных и блоксополимерных транспортных систем связаны с отсутствием универсальности загружаемых молекул: различия в их физико-химических свойствах требуют трудоемкой и длительной оптимизации состава и структуры капсулы для каждого индивидуального инкапсулируемого соединения, а зачастую – и разработки новых материалов, что влечет за собой длительный и дорогостоящий процесс тестирования безопасности их применения в пациентах.

С помощью послойной самоорганизации макромолекул на поверхности
субстрата² была разработана универсальная платформа для получения капсульных
систем, способных транспортировать все известные классы БАВ. Для получения
капсул не требуется специального дорогостоящего оборудования, при этом их
размер, состав и проницаемость могут легко варьироваться в широком диапазоне.
Метод дает возможность варьировать тип материалов для сборки капсулы,
встраивать в неё структурные элементы для контроля доставки и высвобождения
ингредиентов, а также получать капсулы, состоящие из нескольких

микрокомпартментов, которые в определенной степени могут рассматриваться как
функциональная модель биологических клеток. Поверхность капсулы может быть
пассивирована для предотвращения нежелательной активации иммунной системы
и/или декорирована специфическими лигандами для контролируемой доставки БАВ
к месту действия. Установленный факт интернализации полимерных

мультислойных капсул соматическими клетками в процессе эндоцитоза³ предопределил насущность активной разработки этой системы для применения в наномедицине, а также в генной и иммунной терапии. Более того, возможность наполнять капсулы БАВ разнообразной направленности делает актуальной задачу адаптации капсул для последующего использования в функциональных пищевых продуктах и косметических средствах.

Степень разработанности проблемы. Различные аспекты доставки БАВ с помощью капсул, получаемых послойной самоорганизацией макромолекул, активно исследуются научными группами Г. Сухорукова, Ю. Львова, Ц. Гао, А. Скиртача, С. Сухишвили, М. Рабнера, Д. МакКлементса, Х. Боймлера, и др. К настоящему времени уже разработаны способы наполнять мультислойные

¹Waigh T.A. Applied Biophysics. Chichester, UK: John Wiley & Sons, Ltd, 2007.

²Sukhorukov G.B. et al. Stepwise polyelectrolyte assembly on particle surfaces: a novel approach to

colloid design // Polym. Adv. Technol. 1998. Vol. 9, № 10-11. P. 759–767.

³De Geest B.G. et al. Intracellularly degradable polyelectrolyte microcapsules // Adv. Mater. 2006. Vol.

18, № 8. P. 1005–1009.

полимерные капсулы БАВ, имеющими различные физические и химические свойства. Так, в литературе описаны методы получения капсул, содержащих белки, энзимы, полисахариды, нуклеиновые кислоты, лекарственные препараты разной направленности, дисперсную фазу эмульсий, а также бактериальные и соматические клетки. Для многих БАВ была достигнута высокая степень загрузки, и разработаны способы их контролируемого высвобождения в ответ на изменение условий окружающей среды: рН, температуры, окислительно-восстановительного потенциала или на повышенные концентрации специфических химических веществ. Идея встраивания в мультислои металлических наночастиц и их агрегатов реализовалась в таких уникальных свойствах капсул, как резкое высвобождение содержимого в ответ на дистанционно-оказываемые воздействия лазерным излучением, магнитным полем или ультразвуком. Показательно, что воздействие лазером позволяет вскрывать капсулы одну за другой в желаемый момент времени и в желаемом месте, а помещение капсул в магнитное поле не только способно контролировать скорость высвобождения содержимого, но и контролируемо перемещать капсулы в пространстве.⁴

Несмотря на множество данных, показывающих высокую эффективность применения полимерных мультислойных капсул in vitro, вакцины, полученные на их основе в группе Б. де Гееста, остаются пока единственным свидетельством успешной практической реализации их преимуществ in vivo. Проблемы, возникающие при трансляции капсул с микросистемы клеточных культур и тканей на макросистему целого организма, связаны прежде всего с рядом нерешенных экспериментальных задач, приводящих к:

a) потере биологической активности молекул в процессе инкапсулирования. Большинство известных способов заключения БАВ в полимерные мультислои предполагает воздействие на них сред с полярным рН, высокой ионной силы или неблагоприятной температуры. Более того, взаимодействие загружаемых молекул с материалом капсулы может нарушать их пространственную конформацию и тем самым – биологическую активность. Вышеуказанные проблемы стоят особенно остро для таких важных БАВ, как белки и рибонуклеиновые кислоты (РНК). Например, среди всех известных типов молекул РНК успешная доставка полимерными мультислойными капсулами продемонстрирована только для малого интерферирующего типа (миРНК), причём имеются свидетельства того, что наблюдаемое подавление экспрессии

⁴Delcea M., Mhwald H., Skirtach A.G. Stimuli-responsive LbL capsules and nanoshells for drug delivery // Adv. Drug Deliv. Rev. 2011. Vol. 63, № 9. P. 730–747.

целевых генов связано непосредственно с интернализацией капсул, а не с биоэффектом доставляемой миРНК.⁵

b) повреждению БАВ при хранении в капсулах и транспортировке к
биологическим мишеням активными формами кислорода и прооксидантами.

c) воспалениям и аллергическим реакциям, поскольку большинство катионных
полипептидов, применяющихся для сборки капсул за счёт электростатических
взаимодействий, обладают высокой токсичностью из-за способности
адсорбироваться на поверхности противоположно заряженных клеточных
мембран, угнетая жизнедеятельность клеток.

1. ограниченной применимости капсул в косметических средствах и функциональных пищевых продуктах из-за дороговизны исходных материалов.

2. отсутствию надежного контроля высвобождения активных веществ, которое связано с тем, что изменения физико-химических параметров в жидких средах организма зачастую не столь значительны, чтобы вызвать деградацию капсулы, а физические методы управления проницаемостью полимерной мультислойной плёнки нуждаются в доработке, чтобы успешно применяться in vivo. При этом отсутствует систематическое исследование механизма и физических параметров спонтанного высвобождения молекул из капсулы.

3. плохому сочетанию материала капсулы и материала темплата, что особенно затрудняет задачу получения биосовместимых наноразмерных капсул. Большинство коллоидных частиц-темплатов, размер которых легко контролировать при синтезе, оказывается непригодным для сборки капсул из биологических полимеров. Частицы фатерита являются идеальным темплатом для биодеградируемых капсул, однако целенаправленные исследования по контролируемому получению наноразмерных частиц, а также предотвращению перекристаллизации наноразмерных частиц фатерита в более термодинамически стабильные формы карбоната кальция, пока не проводились.

4. низкой эффективности инкапсулирования и неконтролируемому высвобождению водорастворимых низкомолекулярных веществ. Капсула полностью проницаема для ионов и молекул массой менее 1 кДа, тогда как широкий ряд лекарственных препаратов, в особенности противораковых лекарств, попадает именно в эту категорию.

Целью исследования является разработка капсульных систем, получаемых
посредством послойной супрамолекулярной самоорганизации биополимеров, для
последующих применений в биотехнологической и фармацевтической

⁵Becker A.L. et al. Redox-Active Polymer Microcapsules for the Delivery of a Survivin-Specific siRNA in Prostate Cancer Cells // ACS Nano. 2011. Vol. 5, № 2. P. 1335–1344.

промышленности, изготовлении косметических средств и средств персонального пользования.

Для достижения данной цели потребовалось решить следующие научные задачи:

Адаптировать способы инкапсулирования для обеспечения структурной стабильности и необходимого биологического эффекта транспортируемых активных веществ.

Разработать капсулы, обладающие защитной функцией, для эффективного предотвращения перекисного окисления липидов.

S Определить основные факторы пероксидации в эмульсии типа масло-

в-воде. У Сконструировать защитную оболочку, лимитирующую диффузию

прооксидантов сквозь полимерную мультислойную плёнку. S Провести сравнительный анализ эффективности защиты,

обеспечиваемой разработанными капсулами и общеизвестными

антиоксидантами.

Исследовать механизм спонтанного высвобождения белка из капсул, полученных посредством послойной самоорганизации пары комплементарных полиэлектролитов полисахарид/полипептид.

Разработать и получить стабильные капсулы, деградирующие под действием протеолитических энзимов, без использования токсичных и дорогостоящих поликатионов.

Получить биодеградируемые и биосовместимые наноразмерные капсулы, способные удерживать низкомолекулярные вещества.

S Исследовать факторы, стабилизирующие наноразмерные частицы фатерита, которые образуются при смешивании растворов солей.

S Получить наноразмерные частицы фатерита - темплаты для биодеградируемых капсул.

S Получить капсулы, загруженные веществом, представляющим собой модель многих лекарственных средств, включая противораковые препараты, универсальные пищевые добавки и традиционные фитолекарства.

Объект и предмет исследования. Объектом исследования являются полые наноструктурированные капсулы диаметром от нескольких сотен нанометров до нескольких микрон, получаемые с помощью послойной самоорганизации молекул комплементарных биополимеров на поверхности темплата. Предметом исследования является адаптация физических параметров и молекулярного состава капсулы, а также методов инкапсулирования для достижения оптимального

биологического эффекта активного вещества и последующего применения капсул в живых системах.

Методологическая, теоретическая и эмпирическая база исследования. Работа
базируется на теоретическом материале и аналитических данных по
самоорганизации биологических макромолекул – белков, полипептидов,

полисахаридов и нуклеиновых кислот, который, в свою очередь, заложен в основу
метода послойного формирования водонерастворимого комплекса

комплементарных биополимеров на поверхности темплата. В работе также
используются накопленные к настоящему времени знания о способах получения
замкнутых микрокапсул, используя разнообразные межмолекулярные

взаимодействия, и о механизмах контроля их размера, толщины и проницаемости.

Часть работы, касающаяся получения наноразмерных кристаллов фатерита, основывается на положениях классической теории нуклеации и начальных стадий роста кристаллов, а также теории переконденсации.

Научные результаты, выносимые на защиту:

1. Метод инкапсулирования «молекулярных коктейлей» для предотвращения
деградации БАВ в процессе включения в полимерную мультислойную капсулу. В
основе метода лежит адсорбция активного вещества в поры частиц фатерита вместе
с так называемым «веществом-протектором», в роли которого, могут выступать
молекулы, связывающиеся с БАВ и стабилизирующие их структуру, либо
молекулы, ингибирующие действие повреждающих факторов окружающей среды.
Результат применения метода, заключающийся в транспортировке и
высвобождении вещества в активной форме, подтвержденный наблюдаемым
биологическим эффектом.

2. Нивелирование перекисного окисления липидов инкапсулированного масла в течение многодневного хранения при биологически релевантной температуре без доступа света. В качестве фактора антиоксидантной защиты в капсуле выступает слой таниновой кислоты, связывающий ионы переходных металлов. Роль катионов переходных металлов, как основных прооксидантов in vitro, на которую косвенно указывает экспериментально подтвержденная эффективность капсулы. Установленное влияние типа антиоксиданта (превентивный или останавливающий, разрывающий цепную реакцию) на эффективность защитной функции капсулы.

3. Механизм инкапсулирования и высвобождения молекул, несущих заряженные группы, из капсул, стабилизированных электростатическими взаимодействиями, который отражает взаимодействие молекул БАВ с нескомпенсированными электростатическими зарядами в капсуле. Варьирование способа загрузки капсулы,

как метод, позволяющий регулировать эффективность инкапсулирования и показатели релиза.

4. Капсулы типа сывороточный белок/полифенол, обладающие селективной
чувствительностью к действию протеолитических энзимов. Отсутствие вклада
электростатики при сборке капсулы. Мультислойные капсулы не деградируют
после экстракции темплата и способны удерживать гидрофильные
высокомолекулярные вещества. Трёх комплементарных слоёв (сывороточный
белок/полифенол/сывороточный белок) достаточно для стабильного
инкапсулирования гидрофобных БАВ.

5. Роль полиолов как добавок, предотвращающих перекристаллизацию фатерита в
более стабильные полиморфы. Концентрация солей, количество спиртовых групп в
системе и вязкость солевых растворов – основные параметры, влияющие на размер
синтезируемых частиц. Определённые условия получения наноразмерных частиц
фатерита в присутствии полиолов: концентрация солей – 0.1 М, содержание
добавки (глицерина) – 83.3(3)% об., температура – 25 С.

6. Наноразмерные капсулы из противоположно заряженных биополимеров,
загруженные водорастворимым соединением, имеющим молекулярную массу < 1
кДа.

Научная новизна результатов исследования:

1. Предложен метод «молекулярных коктейлей», позволяющий загружать
биодеградируемые мультислойные капсулы БАВ, чувствительными к изменению
физико-химических параметров окружающей среды. Метод создаёт условия, в
которых в системе совместно с БАВ присутствуют «вещества-протекторы», что
обеспечивает стабильность их структуры и биологических свойств как в процессе
инкапсулирования, так и на этапе транспортировки к биологическим мишеням. С
помощью предложенного метода впервые была осуществлена трансфекция клеток
полимерными мультислойными капсулами, содержащими молекулы матричной
РНК.

2. Разработаны функциональные защитные капсулы, чья активная роль состоит в
экстракции повреждающих факторов из дисперсионной среды и предотвращении
их взаимодействия с транспортируемыми БАВ. Практической реализацией
разработки стало впервые продемонстрированное полное подавление процесса
перекисного окисления липидов инкапсулированного льняного масла по крайней
мере в течение двух недель хранения при 37 С в темноте. Для капсульной системы
впервые показано ключевое влияние способа антиоксидантной защиты и
распределения антиоксиданта в капсуле на эффективность защиты.

3. Исследован механизм высвобождения амфотерных молекул белка из мультислойных капсул, собранных посредством самоорганизации противоположно заряженных биосовместимых полиэлектролитов. Показана и раскрыта роль способа инкапсулирования и особенностей взаимодействия молекул содержимого капсулы с полимерной сеткой, как факторов, позволяющих контролировать такие физические параметры, как эффективность загрузки капсулы, скорость высвобождения и общее количество высвобождаемого вещества.

4. Получены стабильные мультислойные капсулы типа сывороточный белок/полифенол без вклада электростатических взаимодействий между комплементарными слоями в их структуре, и показана возможность использовать эти капсулы для доставки как гидрофильных, так и гидрофобных веществ. Впервые для полимерных мультислойных капсул показано, что из протеолитических энзимов, специфически катализирующих гидролиз белков по определенным точкам (трипсин и а-химотрипсин), для деградации капсул подходит только а-химотрипсин, благодаря способности преимущественно расщеплять белки после остатков ароматических и гидрофобных (лейцина и метионина) аминокислот и неспецифической активности.

5. Проведено систематическое исследование влияния присутствия полиолов на
морфологию и размер частиц СаС0₃, синтезируемых при смешивании солей СаС1₂
и Na₂C0₃, на основе которого выработан протокол для стабильного получения
наноразмерных частиц фатерита.

6. Получены наноразмерные капсулы с биодеградируемой полимерной
композицией и произведена их загрузка низкомолекулярным соединением,
служащим моделью многих лекарственных средств, включая противораковые
препараты, универсальные пищевые добавки и традиционные фитолекарства,
причём размер полученных наноразмерных капсул соответствует размеру систем
доставки лекарств, применимых в наномедицине.

Научная и практическая значимость работы. Результаты работы вносят вклад в усовершенствование структуры и методов получения полимерных мультислойных капсул и послужат эмпирической базой для решения целого ряда задач биомедицины, а также технологий, применяемых в косметической и пищевой промышленности. В частности, метод «молекулярных коктейлей», чья эффективность продемонстрирована для основного фактора роста и матричной РНК, может лечь в основу разработки средств для лечения повреждений кожи и генной терапии. Выявление основного фактора пероксидации in vitro и разработанная на этой основе система антиоксидантной защиты эмульгированного масла имеют большой потенциал для сокращения количества используемых

искусственных консервантов в косметике и производстве продуктов питания. Исследование механизма высвобождения макромолекул из биосовместимых капсул окажется ключевым для разработок биофармацевтических препаратов на основе белков, полисахаридов и нуклеиновых кислот.

Продемонстрированная селективная чувствительность плёнок типа белок/полифенол к действию протеолитических энзимов служит мощным отправным пунктом к разработкам капсульных систем для доставки в кишечник БАВ, нуждающихся в дополнительной защите при прохождении агрессивной среды желудка, таких как, например, неспецифические компоненты иммунной системы, пробиотики и пр., и побуждает на исследования по созданию пролекарств. Более того, низкая стоимость молекулярных составляющих для капсул открывает возможность к их широкому применению не только в медицине, но и в качестве ингридиентов функциональных пищевых продуктов и биодобавок. Установленная возможность собирать капсулы из сывороточных альбуминов важна и для разработки средств персональной медицины, т.к. в качестве составных элементов капсулы могут браться белки, выделенные непосредственно из крови пациента, с целью погашения иммунного ответа и аллергических реакций на систему доставки. Нежелательную активацию иммунной системы позволит предотвратить и технологически простая возможность пассивации поверхности капсул, собранных из других материалов, внешним бислоем таниновая кислота/сывороточный альбумин.

Влияние присутствия полиолов на размер частиц фатерита, синтезируемого при смешивании эквимолярных растворов солей, вносит вклад в общую систему знаний о процессах роста поликристаллов. Применение этой информации уже нашло место в данной работе для получения наноразмерных капсул из биодеградируемых полимеров, что имеет огромное значение для реализации потенциала полимерных мультислойных капсул в наномедицине.

Степень достоверности результатов проведенных исследований. Достоверность полученных результатов подтверждается:

использованием сертифицированного оборудования и наборов реагентов для

получения образцов и аналитических данных

воспроизводимостью экспериментальных данных в пределах, установленных погрешностью измерений

опубликованием всех экспериментальных результатов, вошедших в работу, в авторитетных научных изданиях на основании положительных отзывов рецензентов, являющихся признанными экспертами в соответствующих областях науки.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Метод получения капсульных систем базируется на экспериментальных и теоретических исследованиях молекулярной биофизики, характеризующих супрамолекулярную самоорганизацию биополимеров: полисахаридов, полипептидов, белков и нуклеиновых кислот. Основы процесса перекисного окисления липидов относятся к разделу биофизики – биофизика мембранной патологии. Таким образом, отраженные в диссертации научные положения соответствуют областям исследования «молекулярная биофизика» и «биофизика мембран».

Апробация и реализация результатов диссертации. Основные положения диссертационной работы докладывались на следующих научных конференциях: 34^th Micro and Nano Engineering MNE 2008, Conference and Exhibition Announcement Athens – Greece, (2008); XVIII International Conference on Bioencapsulation – Porto, Portugal (2010); Molecular Material Meeting (M3) @ Singapore (2011, 2012, 2014, 2015), International Conference on Materials for Advanced Technologies (ICMAT), Singapore (2011), A*STAR Scientific Conference, Singapore (2012), 7^th Singapore International Chemical Conference, Singapore (2012), American Chemical Society Annual Meeting, New Orleans – USA (2013), Science for Future, St. Petersburg – Russia (2014), International Conference “Nanoparticles, Nanostructured Coatings and Microcontainers: Technology, Рroperties, Applications”, Saratov – Russia (2015). Всего было сделано 14 устных докладов, включая 4 приглашённых доклада.

Результаты работы легли в основу семинаров и образовательных курсов для представителей промышленных предприятий, организуемых под эгидой Агентства по Науке, Технологиям и Исследованиям (АНТИ), г. Сингапур, и послужили базой для совместных научно-прикладных инновационных проектов с компаниями P&G, Symrise, L’Oreal.

Личное участие автора в получении результатов. Соискатель принимала личное участие в получении всех результатов, лежащих в основе диссертационной работы. Экспериментальные данные были получены либо непосредственно соискателем, либо сотрудниками и аспирантами возглавляемой ею научной группы. В последнем случае вклад соискателя состоял в постановке научной задачи, составлении протокола исследования, обсуждения результатов, координации и руководстве экспериментами, а также в подготовке результатов работ к публикациям. С активным участием соискателя были подготовлены и опубликованы 5 обзоров литературы и глава в монографии, посвященные различным аспектам инкапсулирования в самоорганизующиеся полимерные мультислои.

Публикации. Основные результаты по теме диссертации изложены в 20 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, включенных в перечень ВАК, 1

монографии, рецензируемых трудах 3 конференций (ABSTRACTS OF PAPERS OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY Volume: 241, Meeting Abstract: 300-PMSE, рublished: MAR 27 2011; ABSTRACTS OF PAPERS OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY Volume: 243, Meeting Abstract: 237-PMSE, рublished: MAR 25 2012; ABSTRACTS OF PAPERS OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY Volume: 245, Meeting Abstract: 108-COLL, рublished: APR 7 2013), а также в 3 международных патентных заявках.

Гранты. Научные исследования, послужившие основой диссертационной работы, были поддержаны следующими грантами:

^ Грант Правительства Российской Федерации №14.Z50.31.0004 для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования, научных учреждениях государственных академий наук и государственных научных центрах Российской Федерации;

S Грант Бюро Объединённых Исследований, АНТИ, г. Сингапур No 1231AFG022;

S Грант Бюро Объединённых Исследований, АНТИ, г. Сингапур No 14302FG090.

Объём, логика и структура работы обусловлены поставленной целью и решаемыми научными задачами. Диссертация состоит из введения, семи глав, заключения, приложений и библиографии. В тексте работы содержится 6 таблиц, 2 схемы и 80 рисунков. Общий объём работы составляет 210 страниц.

Общие способы контроля проницаемости капсулы

Достоинством этого является возможность аккумулировать внутри капсулы противоположно заряженные активные вещества [30,31], а недостатком -токсичность и неспособность остатков темплата полностью деградировать в биологических системах. Более того, дополнительные сшивки, создаваемые мономерами темплата, меняют механические свойства и проницаемость капсул, делая их непригодными в качестве модели для соответствующих исследований. Наиболее существенной проблемой использования полимерных темплатов для получения капсул, применимых в биологии и медицине, является высокое осмотическое давление, создаваемое при их растворении, что приводит к разрывам капсул, собранных из некоторых энзиматически-деградируемых полимерных пар, в частности, - поли-L-аргинин/декстран сульфат.

Таким образом, капсулы, собранные на полимерных темплатах, могут служить в качестве тестовых систем непосредственно для доставляемых активных веществ, а также для исследования влияния скоростей высвобождения. На основе таких капсул возможно создание разнообразных сенсоров и лабораторий-на-чипе [32], т.е. любых устройств, не требующих помещения капсул внутрь живых организмов.

.Гидрогели. Преимуществом гидрогелей (например, альгинат кальция) при использовании в качестве темплатов для сборки полимерных капсул является их биосовместимость. Помимо этого, частицы гидрогелей способны удерживать в своей структуре активные вещества с различной растворимостью в воде, что значительно расширяет спектр применения получаемых капсул [33-35]. Материал, степень сшивки, и размер частиц гидрогелей позволяют также регулировать скорость высвобождения инкапсулированных активных веществ [36]. Существенным недостатком этих темплатов является неоднородность частиц по размеру и сложности в получении частиц микронного и субмикронного размера. Микрогидродинамические устройства позволяют решить эту проблему до определенной степени [37], но их разработка и производство требуют специфических знаний, навыков и сложного оборудования. Кроме того, микрогидродинамические устройства обычно не отличаются большим производственным выходом, что потенциально может создать проблемы в производстве капсул в промышленных масштабах.

.Микро- и наносферы мезопористого оксида кремния. Частицы мезопористого оксида кремния являются удобными темплатами для сборки капсул, предназначенных решать широкий ряд задач, связанных с биологией и медициной [38]. Их преимущества - большая площадь поверхности, позволяющая адсорбировать активные вещества, возможность полного удаления темплата из капсулы и коммерческая доступность частиц разного размера. Стоит, однако, отметить высокую токсичность фтористоводородной кислоты, требующейся для растворения частиц мезопористого оксида кремния, что требует специфических знаний и практических навыков в обращении, а также создает возможность интоксикации конечного продукта фтористым водородом.

.Частицы фатерита. Пористые сферические частицы карбоната кальция наиболее предпочтительны для сборки полимерных мультислойных капсул, применимых в живых системах. Так же, как и частицы мезопористого кремния, частицы фатерита могут адсорбировать и удерживать в порах активные вещества, и полностью удаляются из капсул при помещении в 0.2 М раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Обработка ЭДТА обычно не приводит к деградации БАВ при условии контоля кислотности дисперсионной среды. В случае поверхностно-активных веществ (ПАВ) применение пористых частиц карбоната кальция позволяет достичь большей эффективности загрузки по сравнению с другими темплатами (см. Гл. 5). Частицы СаСОз биосовместимы и считаются биодеградируемыми, т.к. растворяются при рН от 3 и ниже, что соответствует условиям рН желудка и эндосомальному рН некоторых типов клеток. Капсулы из энзиматически деградируемых пар полимеров были успешно получены с помощью частиц фатерита [3]. Кроме того, необходимо отметить простоту получения частиц карбоната кальция, образующихся при смешивании эквимолярных растворов СаСЬ и Na2CCb [39], и соответственно их дешевизну и доступность. Единственным, но важным недостатком фатерита является отсутствие способов контроля размера синтезируемых частиц, и поэтому развитие соответствующих методов получения частиц фатерита в узком диапазоне размеров представляет самостоятельную и весьма актуальную задачу.

В случаях, когда капсулы собраны из полиэлектролитных мультислоёв, рН-отклик систем связан с влиянием слабых полиэлектролитов, используемых как компоненты плёнки. Поскольку ионизационные свойства слабых электролитов изменяемы, сдвиг в рН окружающей среды может вызвать накопление некомпенсированных положительных или отрицательных зарядов внутри мультислоя при рН, близком к рКа полимера из-за протонирования или депротонирования полярных групп. Накопление нескомпенсированных зарядов ведёт к более сильному отталкиванию полимерных цепей. Таким образом, капсулы подвергаются обратимому набуханию [40], что в свою очередь выражается в увеличении проницаемости макромолекулярной сети [41] и изменениях в толщине стенок капсул [42]. Дальнейшее увеличение основности, в случае слабых полиоснований, или увеличение кислотности, в случае слабых поликислот, приводит к распаду капсулы.

Локальные состояния проницаемости/непроницаемости капсул на основе мультислоёв полиэлектролитов, которые зависят от рКа, различны для каждой полимерной пары, что открывает возможность подбирать материал капсулы таким образом, чтобы обеспечить скорость релиза, удовлетворяющую требованиям конкретной практической задачи. Однако для большинства полимерных пар, применямых в настоящее время для получения стабильных капсул, рН-регулируемые области наивысшей проницаемости находятся в экстремальных диапазонах рН (либо в очень кислых, либо в очень основных).

Это происходит потому, что реальные значения рКа полимеров в мультислоях могут существенно отличаться от таковых в растворах. К примеру, ПАА, один из наиболее часто используемых слабых полиэлектролитов для получения капсул, имеет рКа = 8,7 в бессолевом растворе. Когда в мультислоях ПАА используется в чередовании с ПСС, его относительный рКа изменяется до 10.7 [43]. По всей видимости, ослабленное диэлектрическое окружение внутри мультислоёв приводит к подавлению ионизации полиэлектролита [44]. Капсулы на основе ПСС/ПАА начинают набухать, когда рН достигает 11, и разрушаются при рН 12 и выше. Для области наивысшей проницаемости характерна низкая плотность капсул и даже появление пор, визуализируемых с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) [45], что обеспечивает загрузку капсул с наибольшей эффективностью [46]. Используя этот принцип, полиэлектролитные капсулы ПСС/ПАА были наполнены различными макромолекулами в кислом диапазоне рН, в котором молекулы ПАА сильно ионизированы [40]. Такие капсулы не набухают при низких значениях рН, вероятно из-за высокой ионизации ПСС. В другом случае, ПМА/ПАА капсулы, сформированные из пары слабых полиэлектролитов, были исследованы на предмет рН-зависимого набухания как при низких, так и при высоких значениях рН [47]. Набухание капсул с их последующим растворением наблюдались при значениях рН до 2.5 и свыше 11.5. Очевидной причиной этого послужило отсутствие электрических зарядов на молекулах поликислоты или полиоснования при соответствующих условиях, что приводило к исчезновению электростатических взаимодействии между прилегающими полимерными слоями. Сравнительное исследование проницаемости капсул, собранных из таниновой кислоты (ТК) в паре с сильным полиэлектролитом поли(диаллилдиметиламмоний хлоридом) (ПДАДМАХ) или слабым (ПАА) показало выраженную разницу в чувствительности таких капсул к рН в зависимости от ионизационных свойств полиэлектролита [48].

Так же, как и в планарных полиэлектролитных плёнках, капсульные мультислои, стабилизированные водородными связями, устойчивы при значениях рН, превышающих рКа используемой поликислоты. Например, величина рН растворения мультислойной плёнки из ПВП/ТК превышает значение рКа для ТК в растворе почти на полную единицу рН. Интервалы рН стабильности для мультислоёв, удерживаемых водородными связями, могут регулироваться с помощью выбора поликислот с различными значениями рКа, а также путем изменения химической природы и гидрофобности нейтрального полимерного компонента [44].

Инкапсулирование нуклеиновых кислот

Транспорт нуклеиновых кислот внутрь клетки является критическим процессом манипулирования клеточной активностью в широком спектре практических применений. Развитие генной терапии нацелено на множество различных болезней - генетические, вирусные, бактериальные, паразитарные, а также СПИД и онкологические заболевания [137]. Большое число исследований поддерживает идею генной доставки как многообещающую стратегию в терапии болезни Паркинсона, сердечно-сосудистых заболеваний и лизосомальных болезней [137-139].

При администрировании в живой организм нуклеиновые кислоты подвергаются энзиматическому расщеплению, что обуславливает необходимость их защиты во время доставки к месту действия (клеточному ядру в случае ДНК и цитоплазме в случае РНК). Один из первых разработанных методов доставки использует вектор на основе вируса, не способного к репликации. Подобная модель копирует нативную трансфекцию и обладает высокой эффективностью и длительным временем экспрессии генов [140], но имеет ряд существенных недостатков, таких как канцерогенность, опасность вызвать иммунный ответ, плохая целевая клеточная специфичность, неспособность транспортировать гены больших размеров и высокая стоимость [141].

Для того, чтобы обеспечить более эффективные и безопасные методы варьирования клеточной активности, значительные усилия были затрачены для того, чтобы улучшить как дизайн нуклеиновых кислот, так и способы их транспорта. Наиболее часто применяемые невирусные методологии трансфекции разделяются на три группы: физические, электрические и химические. Преимущества и недостатки каждого из них подробно рассмотрены в работе [142] и позволяют рекомендовать трансфекцию клеток с помощью катионных липосом как наиболее простой и наименее токсичный метод. С точки зрения сохранения целостности клетки, липосомная технология также является наиболее безопасным методом. Упакованные внутри липосом, транспортируемые гены остаются защищенными от кислотного среды в эндосомах и активности нуклеаз. Доступные в настоящее время липидные (липоплексы) или поликатионные (полиплексы) транспортные комплексы ДНК или РНК часто высокотоксичны и, более того, малоэффективны для многих типов клеток [143-146]. Вдобавок, липоплексы обычно нестабильны при хранении и при контакте с белками плазмы крови и поэтому малоперспективны с позиций крупномасштабного производства и ограниченного набора способов администрирования in vivo. Это вызвало ряд новых исследований, посвященных альтернативным материалам и системам упаковки, таким как новые катионные липиды [147-149], полимеры [150], нанотрубки [151,152] и нанокомпозитные материалы на основе графена [153,154]. Однако до сих пор ни одна из упомянутых невирусных векторных систем доставки не обеспечила такой же высокий трансфекционный эффект, какой дают нативные вирусы [155].

Нуклеиновые кислоты - природные полианионы, и в этом качестве они использовались как компонент мультислойных плёнок практически с начала развития технологии послойной сборки [156]. Более того, специфические взаимодействия, как например в паре ДНК/спермидин, использовались для получения капсул и плёнок на подложке [57,157]. Эти образования реагируют на наличие соли, которая разрушает комплех ДНК/спермидин. Для сборки капсул из молекул ДНК также применялось взаимодействие в паре нейтравидин/биотин: в таких ансамблях биотин-меченая ДНК использовлась в паре с нейтравидином [158].

Большое число публикаций имеет дело с инкорпорированием нуклеиновых кислот в мультислойные образования нано-размера путем введения их как анионный компонент капсул, сформированных на неорганических темплатах - таких, как например наночастицы золота[159] или мезопористого оксида кремния [160,161], золотые нанотрубки [162], карбонатные нанокристаллы [157] и галлоизиты [163]. Такой дизайн имеет ряд преимуществ, таких как, например, возможность регулировать размер частиц в суб-микронном диапазоне и уверенный контроль количества применяемой нуклеиновой кислоты. Гены защищены в архитектурных образованиях капсул и плёнок вспомогательными компонентами и не подвергаются опасности расщепления нуклеазами. Биологический эффект трансфекции с помощью неорганических частиц, инкапсулированных в комплементарные полимерные слои, был подтвержден экспрессией целевых белков [164]. Трансфекция клеточной линии СНО-К1 перемежающимися слоями миРНК и поли(этиленамина) на поверхности наночастиц золота наблюдалась по эффективному подавлению экспрессии гена зеленого флуоресцентного протеина [165]. Важным недостатком этой технологии является остаточное присутствие неорганического темплата, который уже не сможет деградировать после интернализации клеткой. Поэтому in vivo применение генных транспортных систем, основанных на неорганических частицах, оказывается органиченным.

В более предпочтительном варианте, нуклеиновые кислоты упакованы внутри мягкой полимерной мультислойной капсулы посредством пошаговой технологии, которая включает: 1) адсорбцию частиц темплата; 2) сборку мультислойной плёнки; и 3) разрушение темплата. Ранее была выполнена предварительная загрузка двухцепочечной ДНК [74] и аптамеров [166] посредством пористых частиц фатерита. Другой тип неорганического растворимого темплата, амино-функционализированный мезопористый оксид кремния, был использован для инкапсулирования линейной двухцепочечной ДНК, плазмидной ДНК и малой интерферирующей РНК (миРНК) [5,167,168]. Поскольку для растворения как карбоната кальция, так и мезопористого оксида кремния необходимы экстремальные рН, это представляет угрозу для инкапсулированных генов. Гелевый электрофорез [168] подтвердил идентичность инкапсулированных и неинкапсулированных молекул, однако для подтврждения биологической активности молекулярного груза необходимо детальное исследование экспрессии целевых генов в трансфектированных клетках, которое не было проведено. Группа Доната первой опуликовала результаты успешной доставки функционализированной ДНК с помощью полимерных мультислойных капсул, когда плазмидная ДНК, содержащая репортерные гены зеленого флуоресцентного протеина и красного флуоресцентного протеина (Дискосома), была инкорпорирована в мультислои пары декстрансульфат/протамин [161].

Мультислойные плёнки из пары ПСС/ПАА имеют удовлетворительную проницаемость для ДНК различной длины, что было доказано с помощью метода молекулярных маяков. [169] Однако нуклеиновые кислоты, будучи чувствительными к относительно мягким изменениям условий окружающей среды, будут деградировать при температурах и величинах рН, необходимых даже для минимального увеличения проницаемости капсулы из полимерных мультислоёв. Поэтому их использование в стандартном методе последующей загрузки будет проблематичным. Крефт et al. предложили оригинальную концепцию для создания капсул на эритроцитном темплате (последующая загрузка) путем их сушки после обработки раствором двухцепочечной ДНК [170].

Помимо непосредственно нуклеиновых кислот, мультислои могут быть собраны из олигонуклеотидов путем гибридизации комплементраных блоков (например, полиА-полиТ, полиГ-полиЦ) [171,172]. 2.3. Инкапсулирование противораковых лекарственных средств

Многие цитостатические и цитотоксические препараты - низкомолекулярные водорастворимые соединения, что требует дополнительных мер предосторожности при их инкапсулировании, поскольку полимерные мультислойные капсулы в своем большинстве проницаемы для соединений с молекулярной массой менее 1 кДа [104]. Доксорубицин и даунорубицин спонтанно инкапсулировались и удерживались внутри капсул с помощью предварительно загруженного низкомолекулярного декстран-сульфата [173], ПСС [174], или желатинированного БСА [175]. В последнем случае рН-регулируемый электрохимический заряд БСА позволяет высвобождать инкапсулированное соединение при понижении рН дисперсионной среды за счёт электростатического отталкивания БСА и противоракового средства.

Доксорубицин гидрохлорид был конъюгирован с ацетилен-функционализированой поли(L-глутаминовой кислотой) [176]. Такая модифицированная система была применена при послойной сборке микрокапсулы с ПВП. Взаимодействия типа «гость-хозяин» между циклодекстрином (ЦД) и адамантаном (АД) успешно использовались Луо et al. [177] для введения доксорубицина в толщу капсулы из полисахаридов; мультислой монтировался при этом попеременной адсорбцией карбоксиметилдекстран-графт-бета-ЦД с доксорубицином, модифицированным АД.

В другом подходе, препараты типа доксорубицина и фторурацила солюбилизировались в олеиновой кислоте и загружались в капсулу методом обмена растворителя [121]. Гидрофобный антираковый препарат Паклитаксел был введен в полисахаридные или полисахарид/поликислотные мультислойные плёнки с помощью универсального метода, предложенного группой Пикарта. Капсулы были собраны из химически модифицированного производного гиаулороновой кислоты (алкиламиногидразид), содержащего гидрофобные нано-углубления, с поликатионами либо поли (L-лизина) или четвертичного хитозана. Паклитаксел показал высокое сродство к алкилированному производному гиалуроновой кислоты и в связи с этим удерживался в толще таких капсул [178,179].

Изучение жизнеспособности клеток, проведенное Ян et al., продемонстрировало повышенную цитотоксичность противораковых лекарств, доставленных мультислойными капсулами к месту действия, по сравнению с препаратами, вводившимися в свободной форме [180].

Недавние достижения в фокусированной доставке лекарственных веществ с помощью полимерных мультислойных капсул [13,136] указывают на их огромный потенциал для использования в качестве транспортных средств для противораковых препаратов, призванный уменьшить повреждение здоровых тканей и одновременно увеличить терапевтический эффект подавления раковых клеток.

Факторы, способствующие стабилизации фатерита

Фатерит - минерал, полиморфная форма карбоната кальция. Фатерит бесцветен и имеет сферическую пористую структуру. Диаметр фатеритных частиц обычно колеблется в интервале от 0.05 до 5 мкм. Так же, как и арагонит, фатерит является метастабильной фазой карбоната кальция при нормальных условиях.

Так как фатерит менее стабилен, чем кальцит или арагонит, его растворимость в воде выше, чем у других полиморфных форм карбоната кальция. Характерно, что при контакте с водой фатерит превращается в кальцит или арагонит. Температуры до 60 С обеспечивают переход в кальцит, и при более высоких температурах фатерит превращается в арагонит [181,182].

Несмотря на нестабильную природу фатерита, он встречается в природе, в частности, в минеральных источниках. В незначительных количествах фатерит найден в отолитах рыб, жемчужинах, раковинах моллюсков и в желчных камнях человека [183]. В подобных случаях, наличие примесей (например, катионы/анионы или органические соединения) может стабилизировать фатерит и препятствовать его переходу в кальцит или арагонит.

Так же, как и другие формы карбоната кальция, фатерит легко растворяется в кислых средах, что приводит к его быстрой деградации in vivo и in vitro. Распад фатерита in vivo может происходить и в биологических жидкостях, и в эндосомах. Биологические жидкости содержат определенные кислотные метаболиты (например, молочную, лимонную и другие кислоты), которые обеспечивают необходимую кислую среду для растворения минерала.

При проникновении в клетки (преимущественно за счёт фагоцитоза) фатерит диссоциирует на ионы (Са и СОз ") под влиянием цитоплазматических и лизосомных ферментов. После этого, Са и СОз могут быть введены во внеклеточный матрикс. В последствии, катион кальция может принимать участие в создании новой ткани без нарушения органической структуры и патологического кальцифицирования [184]. Микрочастицы фатерита могут быть созданы разными способами, однако по большей части эти способы трудоёмки и требуют применения специальной аппаратуры. Наиболее популярный индустриальный метод для получения фатерита основан на барботировании углекислого газа в раствор, содержащий кальций (так называемый «способ Китано» [185,186]). Среди других часто используемых вариантов получения фатерита можно отметить методы двойной эмульсии [187], сольвотермального образования фатерита в автоклаве при температурах выше 100С [188] и биоминерализации [184,189,190]. Описанные в литературе способы синтеза фатерита часто требуют применения реакторов с двойным инжекторным впрыском [191] под действием ультразвука [192,193] и/или магнитного поля [194,195]. Упрощенный способ приготовления фатерита включает смешивание насыщенных водных растворов, содержащих Са и СОз ". Этот способ не требует существенных временнх и денежных затрат, и может быть относительно легко использован в промышленных объёмах [196-200], но недостатком его является нежелательная перекристаллизация фатерита в другие, более устойчивые полиморфные формы карбоната кальция. Поэтому детальные исследования процесса роста кристаллов СаСОз важны для успешного производства фатерита.

В данной главе обсуждаются современные технологии роста кристаллов фатерита и факторы, гарантирующие высокий выход этого полиморфа.

Благодаря низкой стоимости, уникальным физико-химическим свойствам и способности к биодеградации, фатерит широко используется в биомедицине, а также в производстве большого числа средств личной гигиены и продуктов бытовой химии, например, в костных имплантах, абразивах, чистящих средствах и адсорбентах. Помимо этого, фатерит играет ключевую роль в технологии инкапсулирования и доставки лекарственных препаратов. Критическим параметром, определяющим эффективность применения фатерита, является размер его частиц, и поэтому способность контролировать рост частиц и влиять на их размер имеют первостепенное значение для успешного использования фатерита в вышеперечисленных технологиях и целевых продуктах.

Появление новой твердой фазы карбоната кальция инициируется образованием зародышей в пересыщенном растворе. Кристаллы первоначально выпадают в виде аморфного осадка сферических гранул диаметром от 10 до 70 нм [185,194,196,201,202]. Последующие процессы трансформации и растворения-перекристаллизации приводят к образованию смеси кристаллогидратных форм карбоната кальция (гексагидрат и моногидрат) и трёх безводных кристаллических полиморфных форм (фатерит, арагонит и кальцит). Образование зародышей фатерита и рост его кристаллов представляют особый интерес, и механизм формирования частиц фатерита является предметом активной научной дискуссии [202].

В современной литературе обсуждаются две основные гипотезы образования первичных поликристаллических фатеритных сфер. Концепция нано-агрегации утверждает, что сферы образуются в результате быстрого скопления первоначально сформированных кристаллов нано-размеров [192,199,203,204]. Однако лишь относительно нерастворимые вещества способны образовывать сильно пересыщенные растворы, и поэтому осаждение может также быть расценено как кристаллизация труднорастворимого соединения. Соответственно, концепция классического сферолитического роста, приведенная на Рис. 3.1, предлагает, что формирование сферы фатерита поликристаллической природы начинается с образования единичного зародыша, за которым следует его разветвление (процесс, часто называемый созреванием кристаллитов) [203,205,206]. Встречается также предположение, что полностью сформировавшаяся частица фатерита является результатом обоих выше описанных кристаллизационных процессов, происходящих одновременно [207]. Рис. 3.2. (а) Зависимость ионной активности продукта, loglAP, от времени при 25 С [196]; (Ь) зависимость скорости зародышеобразования от величины пересыщения раствора [208].

В соответствии с теорией кристаллографии, формирование кристаллов начинается с образования зародышей. Первоначально сформировавшиеся зародыши перерастают в кристаллиты. В некоторых случаях процесс роста кристаллов сопровождается значительными изменениями исходных концентраций ионов кальция и карбоната в растворе, что является следствием образования вторичных зародышей.

Рост кристаллов - это комплексное явление, которое состоит из двух более простых процессов, протекающих как в интерфейсе кристалл-раствор, так и на некотором удалении от поверхности кристалла: 1) диффузия и/или конвекция растущих частиц через объём раствора к интерфейсу кристалл-раствор, и 2) поверхностная интеграция (частиц) в интерфейсе кристалл-раствор. Более медленный из этих двух процессов определяет общую скорость роста кристаллов. Образовавшаяся в результате твердая фаза подвергается дальнейшим изменениям физико-химических свойств. Эти (вторичные) изменения происходят в условиях, приближенных к равновесию, что в свою очередь определяет тенденцию системы достигнуть равновесие. Теоретически, формирование кристаллов прекращается тогда, когда изо всех образовавшихся кристаллов формируется один, находящийся в равновесии с насыщенным раствором. На практике же, формирование кристаллов закончено тогда, когда кристаллы достигают размера, который вызывает их осаждение. Процесс, ведущий к равновесию, называется старением и протекает в системе по нескольким возможным путям.

Скорость высвобождения FGF2 из капсул ДекС/п-L-Ap in vitro

Вода, использовавшаяся для получения и анализа образцов, была получена с помощью трехступенчатой системы очистки Milli-Q Plus 185 и имела удельное сопротивление 18.2 MQ/CM при 25 С.

Инкапсулирование льняного масла. Смесь, содержащую 10% об. льняного масла и 90% об. водного раствора БСА (или БСА-ТРИТЦ) (4 мг/мл) интенсивно встряхивали в 50 мл пробирке для центрифугирования Falcon (CORNING) в течение 1 минуты, а затем обрабатывали ультразвуком с помощью Vibra-Cell (Sonics&Materials, Inc., USA) с частотой 20 кГц и мощностью 300 Вт в течение 2 минут. Т.к. рН дисперсионной среды не был поддержан буфером, измерения С,-потенциала помогли установить, что поверхность образовавшихся частиц дисперсной фазы заряжена отрицательно, и, следовательно, для формирования последующего слоя капсулы был выбран n-L-Ap. Для этого одну часть полученной дисперсии смешивали с двумя частями водного раствора n-L-Ap, содержащего 2 мг/мл полимера, и повторно обрабатывали ультразвуком при тех же параметрах в течение 30 сек. Далее образец помещали в перемешивающую фильтрационную ячейку (Millipore Corp., USA), вмещающую 50 мл жидкости. После интенсивного перемешивания в течение 15 минут микрочастицы масла, инкапсулированные в БСА/п-L-Ap, трижды промывали водой. Каждая промывка состояла из доведения общего объёма образца водой до 50 мл и удаления 40 мл дисперсионной среды через поры (0.22 мкм) гидрофильной мембраны MF-Millipore. Для формирования следующего слоя ДекС или ТК 20 мл их растворов (2 мг/мл - ДекС, 3 мг/мл ТК) соединяли в ячейке с 10 мл отфильтрованной суспензии капсул и интенсивно перемешивали в течение 15 минут, после чего капсулы трижды промывали водой, как описано выше. Все последующие комплементарные слои капсулы были получены аналогичным образом.

Для получения капсул, содержащих СТ или ТГКП, 10000 миллионных долей указанных веществ сначала смешивали с льняныммаслом, которое затем инкапсулировали согласно описанному выше протоколу.

Измерения -потенциала. Электрокинетический потенциал частиц измеряли с помощью прибора Zeta Plus (Brookhaven Instrument Corporation), для чегої мл суспензии, содержащей 0.05% об. капсул помещали в оригинальные прозрачные одноразовые полистирольные кюветы размером 10 мм х 10 мм х 45 мм.

Анализ размера капсул. Гидродинамический диаметр суспендированных в воде капсул (0.05% об.) определяли на спектрометре динамического рассеяния света Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, UK). В качестве модели для анализа полученных данных использовались эталонные результаты измерений суспензий частиц полистирольного латекса. Измерения проводились при 25 С.

Определение количества ТК в капсулах. Данные, подтверждающие формирование слоя антиоксиданта и позволяющие количественно оценить его содержание в капсулах, были получены с помощью оптической спектроскопии. Растворы для анализа готовили следующим образом. 10 мл суспензии капсул БСА/п-L-Ap, наполненных льняным маслом, соединяли с 20 мл раствораТК (3 мг/мл) в перемешивающей фильтрационной ячейке. По истечении 15 минут активного перемешивания, дисперсионная среда была пропущена через фильтр, после чего было измерено поглощение в пробе, объёмом 100 мкл, на длине волны 283 нм. Для измерения поглощения использовалось многофункциональное микропланшетное считывающее устройство Tecan Infinite 200 Pro (Tecan Group Ltd.) и микротитрационные планшеты с круглодонными ячейками (на 96 ячеек) (BD Bioscience). Концентрацию ТК определяли, используя уравнение калибровочной прямой, полученной измерением поглощения в серии разбавлений раствора ТК известной концентрации. Количество ТК в полученных капсулах БСА/п-L-Ap/TK определяли как разность содержания ТК в растворе, в котором были суспендированы капсулы БСА/п-L-Ap, и содержания ТК в фильтрате. Аналогичным образом было определено содержание ТК в каспулах БСА/п-L-Ap/TK/n-L-Ap/TK. Данные, отражающие общее количество антиоксиданта в суспензиях с разным процентным содержанием частиц, приведены в Табл. 4.2. Средние значения и стандартное отклонение среднего получены по данным спектроскопических измерений в трёх аликвотах от трёх разных образцов.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Изображения были получены на оптической системе Carl Zeiss Lsm 510 МЕТА (Carl Zeiss), оборудованной объективом С 116

Apochromat 63x/1.2 для водной иммерсии. Флуоресцентный сигнал от БСА-ТРИТЦ детектировали при Хехс = 529 нм, Хеш = 596 нм, а от ТГКП - при Хехс = 488 нм, Я,ет = 525 нм.

Лиофильное высушивание. 25 мл суспензии капсул помещали в пробирки для центрифугирования Falcon (CORNING), которые выдерживали 12 часов при -80 С. Образовавщийся лёд сублимировали на лиофилизаторе FreeZone 12 (Labconco Corporation, USA) под вакуумом 0.006 мБар. Длительность процесса составляла примерно 48 часов.

Измерение интенсивности пероксидации. Степень деградации липидов измеряли с помощью набора реагентов для определения содержания РВТК в строгом соответствии с протоколом производителя (CELLBIOLABS, INC.). Метод нацелен на количественное определение одного из молекулярных продуктов пероксидации - малонового диальдегида (МД) [275]. Окисление масла инициировали следующим образом. 10 мл суспензии капсул помещали в пробирки для центрифугирования Falcon (CORNING) ёмкостью 15 мл, которые выдерживали при 37 С без доступа света. Суспензии разбавляли водой в 5-20 раз, применяли набор реагентов и затем приступали к определению содержания МД по интенсивности поглощения на длине волны 532 нм, соответствующей максимуму поглощения аддукта МД-тиобарбитуровая кислота. Для измерения поглощения использовалось многофункциональное микропланшетное считывающее устройство Tecan Infinite 200 Pro (TecanGroupLtd.) и микротитрационные планшеты с круглодонными ячейками (на 96 ячеек) (BDBioscience). предотвратить пероксидацию инкапсулированного масла в течние по крайней мере 15 дней наблюдения за счёт того, что ТК эффективно связывает катионы переходных металлов (основные повреждающие факторы) в дисперсионной среде, предотвращая тем самым инициацию процесса окисления.

Общее значение разработок, описанных в данной главе диссертации, состоит в существенном усовершенствовании капсул, получаемых посредством самоорганизации биополимеров, результат которого состоит в возможности инкапсулировать, хранить, доставлять и высвобождать БАВ в биологически активной форме.