Пероксидация липидов под действием цитохрома c и его комплекса с анионными липидами и ее роль в апоптозе ВИКУЛИНА АННА СЕРГЕЕВНА

Введение к работе

Актуальность исследования. Апоптоз - генетически запрограммированная смерть

клетки, один из механизмов ее гибели наряду с некрозом, необходимый для

развития многоклеточного организма и участвующий в поддержании тканевого

гомеостаза. В то же время, нарушения апоптоза лежат в основе патогенеза многих

заболеваний: ингибирование апоптоза приводит развитию раковых опухолей,

аутоиммунных болезней и нейропрофилеративных заболеваний (шизофрения); с

усилением апоптоза связывают развитие СПИДа, нейродегенеративных

заболеваний (болезнь Альцгеймера, паркинсонизм), ишемических повреждений

(инсульт, инфаркт миокарда) и др. Современные биофизические и медицинские

исследования в области апоптоза направлены, в основном, на изучение его

молекулярных механизмов, понимание которых позволит разработать

эффективные способы контроля над этим процессом и, в конечном счете,

управлять самой клеточной смертью. На настоящий момент известно, что апоптоз

представляет собой многостадийный процесс биологически регулируемых

последовательных событий, берущий свое начало в митохондриях, при этом

ключевым моментом в развитии апоптоза принято считать образование комплекса

между белком цитохромом c и анионным липидом митохондриальной мембраны

кардиолипином (комплекс Цит-КЛ), приводящее к образованию пор во внешней

митохондриальной мембране и последующему высвобождению

митохондриального цитохрома c в цитозоль. Было также показано, что комплекс

Цит-КЛ обладает пероксидазной активностью и участвует в процессе

пероксидации липидов. Точные молекулярные механизмы действия комплекса

Цит-КЛ не были установлены, однако известно, что реакции пероксидации

липидов под действием комплекса Цит-КЛ приводят к нарушению целостности

митохондриальной мембраны. Вопрос о существовании других биологических

функций процесса пероксидации липидов под действием комплекса цитохрома c с кардиолипином, а также другими анионным липидами остается открытым. Ответы на эти вопросы позволят уточнить механизм и значимость процесса пероксидации липидных мембран в апоптозе, что, в свою очередь, является важным шагом для понимания и регулирования механизмов клеточной смерти. Цель работы: изучение молекулярных механизмов реакций пероксидации липидов под действием комплекса цитохрома c с анионными липидами и исследование роли этого процесса в апоптозе. В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить молекулярные механизмы реакций липидной пероксидации под
действием комплекса Цит-АЛ методом активированной хемилюминесценции в
сочетании со спектральными методами исследования.

1. Сравнить пероксидазные свойства комплекса Цит-АЛ в водном окружении и в монослое липида методом люминол-активированной хемилюминесценции. Разработать новые системы для изучения комплекса Цит-АЛ в гидрофобном окружении.

2. Выявить роль реакций пероксидации липидов под действием комплекса Цит-КЛ в биосинтезе липидных медиаторов в клетках, подверженных апоптозу, методом хромато-масс-спектрометрии.

3. Установить роль реакций пероксидации липидов под действием комплекса Цит-КЛ в тканях животных с ишемическими повреждениями и с нейродегенеративными заболеваниями (болезнь Паркинсона) методом ВЭЖХ-МС.

5. Установить роль пероксидации анионного липида фосфатидилсерина на
последней (фагоцитарной) стадии апоптоза с использованием хромато-масс-
спектрометрии.

6. Разработать методики экспрессного определения первичных продуктов реакций пероксидации липидов, их гидропероксидов, в химических системах и биологических объектах для медицинских исследований.

Научная новизна работы. Для описания процесса пероксидации липидов под действием цитохрома c и его комплекса с АЛ предложено использовать две реакции. Описаны возможные схемы этих реакций. Определена пероксидазная активность комплекса Цит-КЛ в монослое липида. Комплекс Цит-КЛ впервые получен в гидрофобном растворителе. Показано, что комплекс Цит-КЛ в гидрофобном растворителе обладает пероксидазной активностью. Установлено, что реакции пероксидации липидов под действием комплекса Цит-КЛ играют роль не только при инициации апоптоза, но и приводят к биосинтезу окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов. Показано, что реакции пероксидации липидов под действием комплекса Цит-КЛ приводят к биосинтезу окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов, при болезни Паркинсона и при церебральной ишемии, вызванной остановкой сердца с последующей реперфузией. Установлено, что про-фагоцитарная активность фосфатидилсерина примерно в 50 раз выше по сравнению с неокисленным.

Практическая ценность работы. Открытие нового механизма биосинтеза окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов, важно для клинической практики: понимание механизма биосинтеза медиаторов воспаления для тех или иных заболеваний поможет выбирать оптимальную и наиболее эффективную схему лечения. Был установлен механизм биосинтеза липидных медиаторов при болезни Паркинсона и церебральной ишемии, вызванной остановкой сердца с последующей реперфузией, в последнем случае

показана эффективность действия лекарственного вещества XJB-5-131, ингибитора

пероксидации кардиолипина. Разработана и апробирована высокочувствительная методика (10^-8 М) определения гидропероксидов липидов крови - маркера многих апоптоз-инициированных патологий.

Положения, выносимые на защиту:

1. Пероксидация липидов под действием цитохрома c и его комплекса с анионными
липидами осуществляется путем протекания двух реакций: собственно,
пероксидации липидов под действием активных форм кислорода и реакции
разложения гидропероксидов липидов с образованием липидных радикалов.

4. Комплекс Цит-КЛ впервые получен в неполярном растворителе. Соотношение липид:белок в комплексе в хлороформ-метанольной смеси найдено равным 77±11.

5. Реакции пероксидации кардиолипина под действием цитохрома c не только приводят к инициации апоптоза, нарушая целостность митохондриальной мембраны, но и могут сопровождаться последующими реакциями гидролиза окисленных жирных кислот Ca²⁺-независимыми фосфолипазами, что приводит к образованию окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов.

4. Биосинтез окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов, при церебральной ишемии, вызванной остановкой сердца с последующей реанимацией происходит согласно предложенному выше механизму из окисленного кардиолипина.

5. Биосинтез окисленных жирных кислот, выполняющих функции липидных медиаторов, при болезни Паркинсона происходит согласно предложенному выше механизму из окисленного кардиолипина.

6. Про-фагоцитарная активность окисленного фосфатидилсерина примерно в 50 раз
выше, чем для неокисленного ФС.

Личное участие автора заключалось в проведении всех экспериментов, результаты которых представлены в диссертационной работе, за исключением культивации клеток и описания клеточного ответа, а также операций, проводимых с животными; лично автором были проведены обработка и интерпретация всех полученных данных.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Результаты работы были представлены на симпозиуме с международным участием «Проблемы медицинской биофизики» (Москва, 2012), всероссийской конференции «Второй съезд аналитиков России» (Москва, 2013) и международной конференции «Ломоносов-2015» (Москва, 2015).

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 183 страницах, содержит 71 рисунок и 9 таблиц. Библиография содержит 226 литературных источников.