Введение к работе
Актуальность исследования. Современная диагностика
онкогематологических заболеваний основывается на анализе совокупности данных морфологии и результатов иммунофенотипирования. Исследование морфологии клеток периферической крови человека в стандартных мазках является одним из основных методов подобной диагностики. Присутствие в периферической крови лимфоцитов с атипичной или патологической морфологией, даже в небольших количествах, считается важнейшим признаком развития или обострения онкогематологического заболевания. Однако, согласно стандартной процедуре такого морфологического исследования, единичные атипичные клетки, встреченные в мазках крови, как правило, не принимают во внимание, считая их возможным артефактом приготовления образца. В связи с этим из-за небольшого количества лимфоцитов в стандартном мазке эти диагностически важные клетки зачастую оказываются не выявленными или выявляются слишком поздно.
Поэтому актуальной является задача систематизации морфологии нормальных и патологических лимфоцитов периферической крови человека с использованием какой-либо дополнительной информации о наблюдаемых клетках. В качестве такой информации может рассматриваться экспрессия на поверхности клеток того или иного дифференцировочного поверхностного антигена. Регистрация присутствия определенных дифференцировочных поверхностных антигенов на этих клетках крови обычно проводится с помощью проточной цитофлуориметрии. Однако данный метод дает возможность лишь определить общее количество клеток того или иного иммунофенотипа, но не позволяет исследовать их морфологию. Кроме того, этот метод является дорогостоящим и требует наличия специального оборудования. Данные проблемы позволяет решить использование клеточного биочипа.
Целью работы являлась разработка клеточного биочипа для параллельного исследования морфологии и иммунофенотипа нормальных и патологических лимфоцитов периферической крови человека.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Выбрать метод иммобилизации антител, обеспечивающий равномерно
высокую плотность связывания клеток в пятнах биочипа и предотвращающий
неспецифическое связывание клеток как в пятнах биочипа, так и в пространстве
между ними. Разработать способ инкубации клеток с биочипом для
минимизации неспецифического связывания лейкоцитов с подложкой биочипа.
-
Разработать метод высушивания клеток периферической крови, связавшихся с биочипом, дающий максимальное сходство их морфологической картины с результатами в стандартных мазках крови.
-
С помощью клеточного биочипа исследовать морфологию и иммунофенотип мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров, сравнить полученные данные с результатами стандартных методов: морфологического исследования мазков крови и проточной цитофлуориметрии.
4. Исследовать морфологию и плотность связывания мононуклеаров
периферической крови с антителами на клеточном биочипе для пациентов с
различными лейкозами и лимфомами в целях изучения возможности
использования биочипа в диагностике гемобластозов.
Научная новизна. Разработан принципиально новый способ
параллельного исследования морфологии и иммунофенотипа лимфоцитов человека с помощью клеточного биочипа. Показано, что морфология и иммунофенотип клеток, определяемые этим методом, практически совпадают с результатами стандартных методов. Разработаны и апробированы критерии дифференциальной диагностики волосатоклеточного лейкоза (ВКЛ) с использованием биочипа. Впервые напрямую определен иммунофенотип гранулярных лимфоцитов и лимфоцитов с дольчатой формой ядра нормальной периферической крови.
Практическая значимость работы. Результаты применения
разработанного нами клеточного биочипа показали высокую специфичность и чувствительность метода при исследовании лимфоцитов периферической крови здоровых доноров и при различных лимфопролиферативных заболеваниях (ЛПЗ) и могут с успехом применяться для ранней диагностики волосатоклеточного лейкоза даже при глубокой лейкопении и малом количестве опухолевых клеток в образце крови. Показано, что применение биочипа облегчает и ускоряет дифференциальную диагностику типичной формы ВКЛ с лимфомой из клеток маргинальной зоны селезенки (ЛКМЗС) и вариантной формой ВКЛ. Результаты данной работы возможно использовать для создания новых методов диагностики онкогематологических заболеваний, а также для построения атласа морфологии и иммунофенотипа лимфоцитов крови в норме и при патологии, облегчающего раннее выявление ЛПЗ и обеспечивающего своевременное начало лечения.
Положения, выносимые на защиту
1. Высушивание связавшихся с биочипом клеток в бычьей сыворотке при
определенных условиях с использованием специальной центрифуги за счет
вращения вокруг оси, перпендикулярной поверхности биочипа и проходящей
через его центр позволяет достичь максимального сходства между
морфологией клеток на биочипе и морфологией тех же клеток в стандартных
мазках крови.
2. Относительная плотность связывания на биочипе нормальных
мононуклеарных клеток с иммобилизованными антителами к различным CD
антигенам соответствует данным о доле в образце клеток, положительных по
данным CD, получаемым методом проточной цитофлуориметрии.
3. Параллельное исследование морфологических особенностей
опухолевых клеток на биочипе, определение плотности их связывания с
антителами к В-клеточным маркерам CD19, CD20, CD22, маркерам CD11c,
CD103, CD123 и CD25, оценки их клональности и активности в них тартрат-
резистентной кислой фосфатазы (TRAP) позволяют достоверно отличать ВКЛ от вариантной формы ВКЛ и ЛКМЗС.
Внедрение полученных результатов исследования в практику.
Получен патент на разработанный нами клеточный биочип для одновременного исследование морфологии и иммунофенотипа клеток крови. На основе метода дифференциальной диагностики ВКЛ с помощью клеточного биочипа разработана процедура анализа «Определение активности тартрат-резистентной кислой фосфатазы различных групп лимфоцитов», включенного в число платных, выполняемых в ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева. Материалы диссертации составили основу задачи специального практикума по биофизике для студентов 4 курса кафедры биофизики физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова «Наночипы и микроскопия: исследование морфологии и иммунофенотипа лимфоцитов крови человека с помощью клеточного биочипа».
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены, доложены и обсуждены на следующих конференциях и конгрессах: I и II Конгрессах гематологов России (Москва – 2012, 2014); 17-th EHA Congress (Amsterdam – 2012); Society of Hematologic Oncology (Houston – 2015); VIII и IX Симпозиумах «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» (Москва – 2013, 2015); XX Всероссийской конференции «Достижения и перспективы развития лабораторной службы России» (Москва – 2015); Всероссийской конференции с международным участием «Инновационные технологии в нейроэндокринологии, нейронауках и гематологии» (Санкт-Петербург – 2013); Всероссийской конференции c международным участием «Инновационные технологии в диабетологии и гематологии» (Санкт-Петербург – 2012); Международных конференциях «Ломоносов-2011» и «Ломоносов-2012» (Москва – 2011, 2012); XIV и XV Всероссийских конференциях «Фундаментальная наука и клиническая медицина. Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург – 2011, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них статей в рецензируемых журналах – 3; патент на полезную модель – 1; тезисов докладов в трудах научных конференций и конгрессов – 13.
Личный вклад автора заключается в разработке клеточного биочипа совместно с соавторами (Ф.И. Атауллаханов, С.А. Кузнецова, А.В. Вылегжанина, А.А. Бутылин, А.И. Воробьев). Экспериментальные данные, использованные в работе, получены автором лично, включая подбор условий для надежной регистрации морфологии и иммунофенотипа клеток в норме и при патологии. Автору принадлежит ведущая роль в анализе и обсуждении полученных результатов. Ведение пациентов, выработка диагностических критериев при применении биочипа проходила при участии практикующих врачей.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы. Материал изложен на 130 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 44 рисунка. Список использованной литературы включает 100 работ, из них 87 – иностранных авторов.