Нарушение кальциевого гомеостаза и его коррекция при гипервозбуждении нейронов культуры клеток гиппокампа Сергеев Александр Игоревич

Введение к работе

Актуальность проблемы. Нейроны обладают способностью к самоорганизации в сети, которые проявляют спонтанную синхронную активность.

Спонтанная синхронная активность (ССА) нейронов в сети – спонтанная генерация пачек потенциалов действия (bursts) и [Са²⁺]_i импульсов, происходящая синхронно в нейронах в сети. Она обладает широким спектром функций в нервной ткани. Пульсации [Са²⁺]_i не только регулируют активность ионных каналов, формирующих потенциал действия (ПД), синтез и секрецию нейротрансмиттеров, но и имеют крайне важное значение в регуляции метаболических процессов. Нарушения механизмов генерации ССА могут приводить к дисрегуляции Са²⁺ гомеостаза клеток и, как следствие, патологическим процессам в клетке, таким как энергетический коллапс, апоптоз и гибель клеток. Выявление модуляторов ССА может позволить разработать подходы по предупреждению эпилепсии; глутаматной токсичности при целом спектре патологических состояний, в том числе ишемии и гипераммониемии. Ряд нарушений ССА нейронов сопровождаются гипервозбуждением.

Гипервозбуждение нейронов в сети определяется как увеличение частоты ССА в нейронах до величины, при которой кальций-транспортирующие системы не успевают произвести откачку Са²⁺ до уровня покоя за время между импульсами, вследствие чего происходит рост базальной [Са²⁺]_i; также происходит гиперсинхронизация всех нейронов. Гипервозбуждение нейронов в сети возникает при действии различных факторов: избыток возбуждающих нейромедиаторов, токсины, ишемия и др. При токсическом действии иона аммония наряду с изменениями концентраций внутриклеточного кальция ([Са²⁺]_i) происходит увеличение частоты пачек ПД (bursts), а также характерная деполяризация в 25-35 мВ, формирующая фазу плато в пачках ПД ([Dynnik et al., 2015] – см. список публикаций по теме диссертации). При гипервозбуждении происходит глобальное повышение [Са²⁺]_i (ГП [Са²⁺]_i) в некоторых нейронах, что может приводить к их селективной гибели. Механизмы селективной гибели и защиты клеток мозга от гибели при гипервозбуждении изучены недостаточно.

Настоящая работа посвящена поиску методов коррекции нарушений кальциевого гомеостаза при гипервозбуждении, исследуются механизмы, регулирующие частоту и амплитуду Са²⁺ импульсов, базальный уровень [Са²⁺]_i при ССА. В качестве активаторов сетей нейронов в работе использовали нейротоксин NH₄Cl (NH₃/NH₄⁺) и кислородно-глюкозную депривацию.

Мишенями токсического действия аммония на клетки мозга могут быть астроциты и нейроны. Schwarz и соавторами в 2012 году на сетях кортикальных нейронов in vitro показано, что аппликация 5 мМ NH₄Cl приводит к активации сети. На текущий момент слабо изучены нарушения Са²⁺-гомеостаза нейронов в сети при воздействии на них NH₄Cl. Выявление механизмов гипервозбуждения аммонием нейронов в сети (ГВА) и его коррекции является важным теоретическим базисом для разработки стратегий терапии гипераммониемических состояний.

Гипераммониемия у людей (при [NH₄⁺] в крови свыше 40 мкМ) наблюдается при печеночной энцефалопатии (ПЭ), абсцессах мозга, транзиентной гипераммониемии у новорожденных и др. У пациентов с [NH₄⁺] в крови свыше 1 мМ имеют место необратимые неврологические последствия. При ПЭ [NH₄⁺] в мозге достигает 3-5 мМ и может приводить к летаргии, судорогам, атаксии и коме. Также инъекции летальных доз NH₄Cl животным вызывают состояния сонливости, сопора, сопровождаемые клоническими и тоническими судорогами, комой и гибелью животных в течение 10-20 мин.

В диссертационной работе также исследуется коррекция нарушения Са²⁺ гомеостаза клеток, связанного с гипервозбуждением нейронов, при кислородно-глюкозной депривации in vitro. Sorimachi и соавторы в 2002 году для поля CA1 гиппокампа in vivo установили наличие

деполяризации нейронов при ишемии (ишемическая деполяризация) и определили ее взаимосвязь с последующей гибелью нейронов. Turovsky и соавторы в 2017 году с использованием кислородно-глюкозной депривации in vitro (КГД) на культурах клеток гиппокампа зарегистрировали явление кратковременного гипервозбуждения нейронов (вызванного деполяризацией). Коррекция гипервозбуждения и нарушений Са²⁺ гомеостаза нейронов при кислородно-глюкозной депривации in vitro является теоретическим базисом для разработки стратегий терапии ишемических состояний.

Цель работы: исследование механизмов и разработка методов коррекции нарушений Са²⁺ гомеостаза при гипервозбуждении нейронов в сети, которое вызвано гипераммониемией и ишемической деполяризацией.

Задачи:

1. Исследование изменений ССА при действии NH₄Cl на нейроны и влияния NH₄Cl на [Са²⁺]_i астроцитов.

2. Определение степени участия NMDA- и AMPA/каинатного ионотропных рецепторов в ГВА. Коррекция состояний ГВА глицином.

3. Коррекция состояний ГВА в нейронах агонистами ряда метаботропных рецепторов (mGluRIII, CB1R, CB2R, ₂ADR).

4. Выявление эффектов при воздействии NAD⁺ на нейроны при ССА и ГВА, определение молекулярных мишеней воздействия NAD⁺ на ССА и ГВА.

5. Выявление эффектов метиламинов (L-карнитина и бетаина) на [Са²⁺]_i колебания в нейронах при ГВА.

6. Коррекция гипервозбуждения нейронов in vitro при кислородно-глюкозной депривации ингибиторами SAPK/p38 и IB-киназы: молекулярных мишеней в составе PI3K-Akt, MAPK сигнальных путей, нейропротекторного каскада IL-10.

Научная новизна работы.

Выявлен ряд молекулярных механизмов и путей сигнализации, обеспечивающих контроль частоты, длительности Са²⁺-импульсов при ССА и при ГВА; а также возможность устранения ишемической деполяризации рядом ингибиторов.

Показано, что ионы аммония в концентрации 5-6 мМ и выше вызывают во всех нейронах значительное увеличение частоты Са²⁺-импульсов и увеличение базального уровня [Са²⁺]_i, а также гиперсинхронизацию нейронов. Показано, что воздействие NH₄Cl (5-6 мМ и более) на астроциты ведет к росту базального [Са²⁺]_i, а в некоторых астроцитах к усилению импульсной активности. Обнаружено явление ГП [Са²⁺]_i для одной из субпопуляций нейронов при воздействии NH₄Cl, приводящее к необратимой дисрегуляции Са²⁺ гомеостаза.

Определен ряд ионных каналов, принимающих участие в ГВА, ингибиторы/блокаторы которых частично или полностью подавляют ГВА: NMDA- и AMPA/каинатные рецепторы.

Выявлен ряд метаботропных рецепторов, агонисты которых полностью или частично подавляют ГВА: mGluRIII, CB1R, CB2R, ₂ADR, P2RY12/P2RY13. Впервые показана коррекция нарушений Са²⁺ гомеостаза при ГВА в сети нейронов глицином, метиламинами (L-карнитином и бетаином), NAD⁺.

Установлено, что «феномен растормаживания» («disinhibition phenomena») не является определяющим (слабо выражен или отсутствует) в ГВА. Так же впервые показана коррекция нарушений Са²⁺ гомеостаза при гипервозбуждения нейронов in vitro при кислородно-глюкозной депривации ингибиторами SAPK/p38 и IB-киназы.

Научно-практическая значимость работы. Определение механизмов регуляции ССА и ГВА создают основу теоретических знаний, позволяющих находить новые стратегии коррекции состояний гипервозбуждения в сетях нейронов, и связанных с ними патологических состояний (гипераммониемии, ишемической деполяризации).

Показана взаимосвязь блокирования NMDAR и AMPA/каинатных каналов с устранением ГП [Са²⁺]_i, что позволит усовершенствовать подходы в использовании блокаторов этих каналов для коррекции гипераммониемических состояний in vivo.

Установлено, что использование агонистов ряда метаботропных рецепторов (mGluRIII, CB1R, CB2R, ₂ADR) приводит к подавлению ГВА нейронов in vitro, что может позволить в дальнейшем осуществлять коррекцию гипераммониемических состояний in vivo. А также будет способствовать поиску способов коррекции гипераммониемических состояний в клинике.

Впервые на нейронных сетях показаны эффекты подавления [Са²⁺]_i колебаний при ГВА метиламинами (L-карнитин и бетаин). Обнаружено нейропротекторное действие NAD⁺ при ГВА, определены молекулярные мишени воздействия NAD⁺ (возможно его метаболитов) на ССА и ГВА (P2RY12/P2RY13). Показано подавление глицином ГВА (предположительно опосредованное глициновыми рецепторами).

Таким образом, выявление новых молекулярных мишеней и корректоров (веществ) гипераммониемических состояний позволят усовершенствовать подходы к терапии гипераммониемии.

Показана возможность устранения ишемической деполяризации (гипервозбуждения) при кислородно-глюкозной депривации in vitro посредством ингибиторов SAPK/p38, IB-киназы: молекулярных мишеней в составе нейропротекторного каскада IL-10. Это является теоретической основой для разработки стратегий терапии ишемических состояний.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация. Пущино. 2017» в составе пленарного доклада. Эти материалы частично напечатаны в сборнике: Теплов И.Ю., Сергеев А.И., Косенков А.М., Гайдин С.Г., Зинченко В.П. Нейропротекторное действие ингибиторов HCN каналов // Материалы международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» 23-26 мая 2017 г., (ред. Зинченко В.П. и др.). Пущино, Fix-Print, 2017, с. 285-292. Проведена апробация представленной диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.01.02 – биофизика на межлабораторном семинаре ИБК РАН.

Личный вклад соискателя. Исследования по теме диссертации были проведены соискателем лично. Автор самостоятельно выдвигал ряд идей, реализованных в работе, решал большинство экспериментальных задач, обрабатывал полученные результатов и формулировал выводы. Вейвлет-анализ Морлета проведен совместно с Танканаг А.В. (ИБК РАН). Результаты исследований, проведенных на препаратах митохондрий, были получены совместно с Дынником В.В., Федотчевой Н.И., Гришиной Е.В. (ИТЭБ РАН). Материалы работы в основном опубликованы в статьях, автор принимал непосредственное участие в написании и оформлении статей.

Публикации. По результатам работы опубликовано 4 печатные работы, в том числе 3 статьи в реферируемых научных журналах и 1 – в материалах конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 119 страницах, содержит 23 рисунка. Список литературы содержит 368 источников.