Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы Многофункциональные микрочастицы и микрокапсулы
1.1. Формирование структур «ядро-оболочка» и микрокапсул методом ПА 19
1.2. Функционализация полиэлектролитной оболочки
1.2.1. Плазмонно-резонансные наночастицы 25
1.2.2. Магнитные наночастицы 27
1.2.3. Углеродные нанотрубки 28
1.2.4. Органические красители и квантовые точки 28
1.2.5. Другие материалы для функционализации 30
1.3. Инкапсуляция 30
1.3.1. Прямые методы инкапсуляции 32
1.3.2. Непрямые методы инкапсуляции
1.4. Поглощение микрочастиц/микрокапсул клетками 36
1.5. Высвобождение молекул из объема микрочастиц/микрокапсул
1.5.1. Оптическое излучение 39
1.5.2. Электромагнитное поле 42
1.5.3. Воздействие ультразвука 42
1.5.4. Воздействие электрическим полем и механическое воздействие 42
1.5.5. Биологическое воздействие 43
1.5.6. Химическое воздействие 45
1.9. Заключение главы 51
2. Обзор литературы Платформы Гигантского комбинационного рассеяния и их применение 53
2.1. Спектроскопия Комбинационного Рассеяния Света 53
2.2. Гигантское комбинационное рассеяние света (ГКР) 57
2.3. Механизм ГКР и коэффициент усиления 60
2.4. Оценка коэффициента усиления структур ГКР 62
2.5. Методы получения платформы ГКР и их применение
2.5.1. Структуры ГКР на основе одиночных и агрегированных наночастиц 64
2.5.2. Анизотропные наночастицы и структуры в качестве платформ ГКР65
з
2.5.3. Нанооболочки, зонды и оптические волокна в качестве структур ГКР
2.5.4. Получение структур ГКР на различных подложках 71
2.6. Применение платформ ГКР для внутриклеточного обнаружения молекул и исследования клеточных процессов 76
2.7. Использование платформ ГКР для детектирования клеточных экстрактов 84
2.8. Применение метода ГКР для детектирования глюкозы 87
2.9. Идентификация микроорганизмов методом ГКР
2.10. Применение метода ГКР для исследования биологических тканей 91
2.11. Заключение главы 95
3. Результаты и обсуждения Многокомпонентные носители для инкапсулирования низко-и высокомолекулярные веществ 96
3.1. Влияние ионной силы и концентрации контейнеров на степень заполнения и агрегацию периферических многокомпонентных носителей 97
3.2. Использование объема многокомпонентных носителей в качестве микрореакторов ферментативной реакции 101
3.3. Заключение главы 108
4. Биоразлагаемые полиэлектролитные микрокапсулы, содержащие терапевтический фермент и их взаимодействие с раковыми клетками109
4.1. Влияние количества полиэлектролитных слоев и типа полиэлектролита на разложение оболочек микрокапсул при действии фермента 110
4.2. Создание биоразлагаемых полиэлектролитных микрокапсул, содержащих терапевтический фермент L-аспарагиназа 117
4.3. Изучение биохимической и температурной стабильности терапевтического фермента L-аспарагиназа, находящегося в объеме микрокапсул
4.3.1. Устойчивость фермента ScASNaseI к разложению 125
4.3.2. Температурная и временная стабильность фермента в свободного виде и инкапсулированного в микрокапсулы 128
4.4. Взаимодействие фермента L-аспарагиназа в свободном виде и инкапсулированного в биоразлагаемые полиэлектролитные микрокапсулы с раковыми лимфоцитами 133
4.4. Заключение главы 137
5. Использование ГКР структур для мониторинга каталитических реакций, детектирование низкомолекулярных веществ и мембранных белков эритроцитов 139
5.1. Использование ГКР платформ для мониторинга транформации 4-нитротиофенола в 4-аминотиофенол 139
5.2. Регистрация спектров ГКР от собственных молекул эритроцитов, находящихся на плазматической мембране 147
5.3. Структуры ГКР на основе пористых материалов для неспецифического обнаружения биологически активных веществ 151
5.4. Заключение главы 170
6. Платформы ГКР на основе наноструктурированных оболочек для их визуализации в живых клетках и обнаружения биологически активных веществ 172
6.1. Сруктуры ГКР на основе микрочастиц диоксида кремния, одностенных углеродных нанотрубок и наночастиц золота 173
6.2. Микрочипы нитрида кремния в качестве структур ГКР для внутриклеточного обнаружения веществ 180
6.3. Экспериментальное исследование нагрева наноструктурированных оболочек из одностенных углеродных нанотрубок и золотых наночастиц методом КР 183
6.4. Многофункциональных микрокапсул в качестве контрастных агентов для их визуализации методом фотоакустической спектроскопии 192
6.5. Заключение главы 199
Заключение 201
Благодарности 206
Литература
- Органические красители и квантовые точки
- Гигантское комбинационное рассеяние света (ГКР)
- Использование объема многокомпонентных носителей в качестве микрореакторов ферментативной реакции
- Регистрация спектров ГКР от собственных молекул эритроцитов, находящихся на плазматической мембране
Введение к работе
Актуальность темы. Развитие персонализированной медицины, направленное на повышение эффективности диагностики и качества лечения [1], неразрывно связано с разработкой функциональных нано- и микроструктур и систем на их основе [2]. Предполагается, что посредством таких функциональных систем будет осуществляться не только доставка и высвобождение биологически активных веществ, но и эффективный контроль окружающего пространства и визуализация систем в организме. Сравнительно недавно такое направление получило название тераностики. Значительные успехи в тераностике были достигнуты при использовании искусственных носителей, таких как, металлические наночастицы, липосомы, мицеллы, и полимерные нано- и микросферы. Однако существует ряд проблем, решение которых будет способствовать эффективному применению искусственных носителей в биологии и медицине. К ним относятся:
экранирование биологически активных препаратов от действия иммунной системы;
доставка и высвобождение биологически активных препаратов: в заданный момент или пролонгированное;
распознавание патологических областей и их зондирование разрабатываемыми носителями;
биосовместимость разработанных систем;
визуализация носителей в организме и мониторинг патологических областей после проведения терапии.
Использование методов самоорганизации для построения функциональных систем является весьма перспективным. Среди методов самоорганизации следует выделить метод последовательной адсорбции (ПА) [3]. С точки зрения выбора способов инкапсулирования веществ и спектра материалов (полимеры, флуоресцентные метки, квантовые точки, металлические наночастицы, биомолекулы) метод ПА является универсальным для построения функциональных нано- и микроструктур [4]. Структуры «ядро-оболочка» и микрокапсулы, физико-химическими свойствами которых можно управлять внешними воздействиями, например, химическим, физическим или биологическим [5], являются наиболее яркими представителями функциональных систем, получаемых методом ПА. Для управления свойствами таких структур наиболее перспективным является оптическое излучение, главным образом, благодаря широкому спектральному диапазону, возможности совмещения с другими методами и построения портативных систем, неинвазивности и возможности изучения интактных биологических объектов в окне прозрачности биотканей[6]. Благодаря высокой чувствительности и спектральной избирательности метод гигантского комбинационного рассеяния света (ГКР) является мощным аналитическим инструментом, который нашел
применение для физических и технологических приложений. Наряду с этим предпринимаются попытки использования метода ГКР для биологических и медицинских приложений. Однако несмотря на существенный прогресс, сделанный за минувшие десятилетие, в этом направлении имеется ряд проблем, относящихся к адекватности и точности определения коэффициента усиления сигнала ГКР, воспроизводимости и стабильности сигнала ГКР, стабильности структур ГКР и их токсичности, затратам на создание структур ГКР.
Целью работы являлись разработка и оптимизация новых подходов построения структур «ядро-оболочка» и микрокапсул, оболочка которых чувствительна к внешнему воздействию с целью их одновременного использования для инкапсулирования, доставки и высвобождения биологически активных веществ, а также в качестве сенсоров ГКР.
Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи исследования:
1. Разработать подход для построения многокомпонентных носителей методом
последовательной адсорбции с целью инкапсулирования нескольких биологически активных
компонентов и проведения ферментативной реакции в объеме носителей.
-
Экспериментально исследовать влияние количества полиэлектролитных слоев, типа полиэлектролита и их последовательности в структуре оболочек микрокапсул на скорость разложения биодеградируемых микрокапсул при действии протеолитического фермента.
-
Провести инкапсулирование терапевтического фермента в объем биоразлагаемых полиэлектролитных микрокапсул и экспериментально исследовать протеолитическую и температурную стабильность фермента, а также выживаемость лейкозных клеток при их взаимодействии с полученными микрокапсулами.
4. Разработать подходы построения сенсоров ГКР на основе микрочастиц карбоната кальция,
диоксида кремния и биосовместимых нетканых нановолокон хитозана и экспериментально
исследовать применение полученных структур в качестве систем обнаружения биологически
активных веществ методом ГКР, контрастных агентов для фотоакустической спектроскопии и
других биофизических приложений.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Возможна одновременная инкапсуляция низко- и высокомолекулярных веществ в
индивидуальные многокомпонентные носители, причем внутренний объем носителей можно
использовать в качестве микрореакторов для проведения ферментативной реакции.
2. Время ферментативного разложения микрокапсул, оболочка которых сформирована из
биоразлагаемых полиэлектролитов может быть увеличено от получаса до нескольких часов за
счет увеличения числа биоразлагаемых полиэлектролитных слоев или за счет включения недеградируемых синтетических полиэлектролитов в структуру оболочек микрокапсул.
-
Капсуляция терапевтического фермента L-аспарагиназы в биодеградируемые микрокапсулы приводит к увеличению протеолитической и температурной стабильности фермента при 37 C, что способствует сохранению активности фермента in vivo при терапии острого лимфобластного лейкоза.
-
Модификация пористых микрочастиц карбоната кальция и пористых нетканых нановолокон хитозана наночастицами золота с контролируемым распределением наночастиц на поверхности и в объеме этих структур обеспечивает условия для обнаружения глюкозы без использования специальных меток.
5. Включение одностенных углеродных нанотрубок в структуру сенсора ГКР позволяет
визуализировать его по характерной интенсивности КР сигнала одностенных углеродных
нанотрубок и создает условие для получения областей с локальным максимумом ЭМ поля, что
увеличивает отношение сигнал-шум при определении биомолекул внутри индивидуальной
живой клетки методом ГКР. Предложенный подход может быть использован при создании
платформ ГКР на любых неорганических микрочастицах.
6. Использование нанонагревателя в виде наночастиц золота и нанотермометра из одностенных
углеродных нанотрубок в индивидуальных микроносителях позволяет проводить определение
нагрева структур на их основе, измеряя Стоксово и Антистоксово КР одностенных углеродных
нанотрубок.
7. Микрокапсулы, оболочка которых состоит из одностенных углеродных нанотрубок и
наночастиц золота, эффективны в качестве контрастных агентов для фотоакустической
спектроскопии и их визуализации в крови с интенсивностью фотоакустического сигнала,
превышающей интенсивность фотоакустического сигнала, генерируемого средой.
Научная новизна
1. Предложен подход к получению многокомпонентных носителей, состоящих из наноносителей, адсорбированных на микроносители методом полиионной самосборки. Показано, что концентрация нано- и микроносителей, ионная сила растворов полиэлектролитов и материал «ядра» для микроносителей влияют на агрегацию многокомпонентных носителей и концентрацию наноносителей на поверхности микроносителей. С помощью предложенного способа были сформированы микрореакторы типа липосомы/пористые микрочастицы
карбоната кальция, ферментативная реакция в которых инициирована после разрушения липосом ультразвуком мощностью 50 мВт/см2 (35 кГц). Установлено влияние наличия пористых микрочастиц карбоната кальция в структуре многокомпонентных носителей на их стабильность и на кинетику ферментативной реакции в объеме носителей.
-
Показана эффективность использования диализа для растворения микрочастиц карбоната кальция, загруженных терапевтическим ферментом небактериальной природы типа L-аспарагиназа. Установлено, что концентрация растворителя этилендиаминтетрауксусной кислоты не более 20 мМ является оптимальной для сохранения полной терапевтической активности L-аспарагиназы в объеме микрокапсул, оболочка которых сформирована из биоразлагаемых полиэлектролитов. Проведена инкапсуляция L-аспарагиназы в микрокапсулы с разным числом биоразлагаемых полиэлектролитов в структуре оболочек микрокапсул, с сохранением полной каталитической активности и улучшенной биохимической стабильностью фермента. Установлено, что на скорость разложения оболочек микрокапсул, состоящих из биоразлагаемых полиэлектролитов типа полиаргинин/полиаспаргин, оказывает влияние число полиэлектролитных слоев в структуре оболочки, наличие и порядок недеградируемых синтетических полиэлектролитов и концентрация протеолитического фермента.
-
Предложен подход для создания платформ ГКР на основе нетканых биосовместимых нановолокон хитозана. Установлена зависимость концентрации золотохлористоводородной кислоты на заполнение и распределение наночастиц золота в структуре нановолокон. Показано, что разработанные платформы ГКР эффективны для обнаружения глюкозы без использования специальных меток с относительным стандартным отклонением сигнала КР не более 25 %.
4. Разработаны новые платформы ГКР типа пористые микрочастицы карбоната
кальция/наночастицы золота и микрочастицы диоксида кремния/одностенные углеродные
нанотрубки/наночастицы золота. Показана и раскрыта роль включения одностенных
углеродных нанотрубок в структуру платформ ГКР и их взаимодействия с наночастицами
золота, что позволяет получать области с локальным максимумом ЭМ поля и проводить
отображение платформ ГКР по характерной линии КР. Показана возможность определения
нагрева таких структур измеряя Стоксово и Антистоксово КР от одностенных углеродных
нанотрубок и определены предельные плотности мощности лазерного излучения для
сохранения целостности структуры ГКР.
5. Получены микрокапсулы с одностенными углеродными нанотрубками и наночастицами
золота в структуре оболочек. Показана возможность использовать такие микрокапсулы в
качестве контрастных агентов для фотоакустической спектроскопии и проведена их in vitro
визуализация в воде и в крови.
Практическая значимость работы
Практическая значимость работы заключается в усовершенствовании наноструктурированных функциональных систем для целей тераностики. Использование результатов работы может послужить практической базой для создания функциональных носителей, в которых объем будет использован для загрузки биологически активных веществ, в то время как оболочка будет выполнять роль чувствительного элемента. В частности, способ построения многокомпонентных носителей может лечь в основу капсулирования низко- и высокомолекулярных, гидрофильных/гидрофобных веществ одновременно в один носитель. Кроме того, такие многокомпонентные системы могут найти практическое применение в качестве микрореакторов химических и биохимических реакций. Исследование сохранения протеолитической и температурной активности терапевтического фермента, его капсулирование и высвобождение из биодеградируемых микрокапсул будет способствовать усовершенствованию терапии онкологических заболеваний.
Предложенная серия подходов к получению структур ГКР может стать базой для создания воспроизводимых и стабильных сенсоров ГКР и для обнаружения веществ без использования специальных меток. В частности, платформа ГКР на основе биосовместимых нетканых нановолокон хитозана может лечь в основу для создания имплантируемых сенсоров, например, для мониторинга процесса регенерации в организме. Сочетание одностенных углеродных нанотрубок и наночастиц золота в структуре оболочек микроносителей является весьма актуальным для визуализации носиетелей в живых клетках и сильно рассеивающих средах. Результаты нагрева структур с оболочкой из одностенных углеродных нанотрубок и наночастиц золота лазерным излучением, послужит базой для реализации лазерной гипертермии, фотоиндуцированного высвобождения веществ из объема микроносителей и лазерной трансфекции веществ через биологические мембраны, а также для теоретического и экспериментального изучения нагрева металлических наночастиц и превращения лазерного излучения в тепло в наноструктурированных объектах.
Диссертационная работа выполнена при поддержке следующих научных фондов:
Стипендия российско-немецкой программы German Academic Exchange Service (DAAD), проект «Multicomponent nanocomposite microcontainers with remote control properties», Referat 325 A/09/03626, (Max-Planck Institute of Colloids and Interfaces, Golm-Potsdam, Germany);
Стипендия фонда Александра фон Гумбольдта (Alexander von Humboldt Scholarship), проект «Label-free single molecule detection based on Raman scattering on self-assembled gold nanoparticles», (Max-Planck Institute of Colloids and Interfaces, Golm-Potsdam, Germany);
Грант Правительства Российской Федерации №14.Z50.31.0004 для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования, научных учреждениях государственных академий наук и государственных научных центрах Российской Федерации (исполнитель);
Грант Евросоюза, программа IRSES(PI) (International Research Staff Exchange Scheme) FP7 - «Люди» (Marie Curie Actions) 2013, «Dual - Imaging Nano/Microsized Theranostics (against cancer), DINaMIT», (the Marie Curie project PIRSES-GA-2013-612673) (исполнитель);
Грант РФФИ №15-29-01172 офи_м, «Платформы гигантского комбинационного рассеяния на основе неорганических пористых частиц, декорированных плазмонно-резонансными наночастицами, как сенсорные системы для внутриклеточных исследований» (ответственный исполнител ь).
Степень достоверности полученных результатов обеспечивается применением современных методов исследования, таких как просвечивающая и сканирующая электронная микроскопия, спектроскопия комбинационного рассеяния, оптическая конфокальная микроскопия, оптическая спектроскопия, использованием традиционных методик анализа полученных данных и воспроизводимостью результатов. Основные результаты работы прошли оценку независимых рецензентов с последующим опубликованием в высокорейтинговых международных научных журналах (Adv. Funct. Mater IF – 11.8, ACS Nano IF – 12.8, Angewandte Chemie IF – 11.6, Small IF – 8.6, Biomacromolecules IF – 5.7, ACS Applied Materials and Interfaces IF – 6.7). Полученные результаты находятся в соответствии с результатами других авторов, работающих в области нанотехнологий, материаловедения, спектроскопии комбинационного рассеяния света и гигантского комбинационного рассеяния света, биофотоники и их применения в медицине для решения задач диагностики и терапии.
Апробация работы
Основные результаты работы были представлены на научных семинарах, научных школах, всероссийских и международных конференциях, из них 13 устных докладов на конференциях и научных школах (5 приглашенных), в том числе:
Saratov Fall Meeting – SFM’15, Saratov, 2015; 8th International Conference on Materials for Advanced Technologies of the Materials Society of Singapore and 16th IUMRS - International Conference in Asia together with 4th Photonics Conference 2015 (ICMAT2015 & IUMRS-ICA2015, Suntec Singapore, 28.06. – 03.07.2015; 6th International Conference «NANOPARTICLES, NANOSTRUCTURED COATINGS AND MICROCONTAINERS: TECHNOLOGY, PROPERTIES,
APPLICATIONS» Saratov, Russia, 21. – 24.06.2015; “Breaking Frontiers: Submicron Structures in Physics and Biology”, 50th Zakopane School of Physics, Zakopane, Krakow, Poland, 18. – 23.06.2015; Technology Platform Microencapsulation 4th Phase 2014-2015, Potsdam-Golm, Germany 21.05.2014; SupraNano Self-Assembly, Paris, France06. - 07.06.2013; IV International Workshop on “Nanoparticles, nanostructured coatings and microcontainers: technology, properties, applications”, Golm, Germany 06. - 09.05.2013; Imagenano 2013, Bilbao, Spain 23. - 26.04.2013; Deutsches BioSensor Symposium, Wildau Berlin, Germany 10. - 13.03.2013; Network Meeting of the Alexander von Humboldt Foundation, Karlsruhe28. - 30.11.2012; German-Russian Conference on Fundamentals and Applications of Nanoscience at Free University Berlin 19. - 21.05.2012; 25th Meeting of the European Colloid and Interfaces Society, Berlin, Germany 05. - 09.09.2011; 2nd International School “Nanomaterials and Nanotechnologies in Living System. Safety and Nanomedicine” Moscow, Russia 19. - 24.09.2011; 1st International Summer School “Nanomaterials and Nanotechnology in Living Systems” at Moscow Region, Russia 29.06. – 04.07.2009; International workshop on nanobiotechnologies, Polytechnic University, Saint Petersburg, Russia, 11.2006; Industry Nanosystems and Materials: Materials conference at Moscow, Russia 10.2006.
Личный вклад
Большая часть экспериментальных результатов была получена лично соискателем, а также совместно с коллегами научных групп в рамках сотрудничества при выполнении совместных проектов. Вклад соискателя заключался в теоретическом обосновании проблемы, постановке и решении основных задач исследования, получении образцов и проведении экспериментальных работ, интерпретации полученных результатов, обосновании их практического применения, а также систематизации, написании и публикации статей. Результаты, опубликованные в статьях [1, 2, 6, 7, 9, 11, 12, 14, 15, 17, 22, 24, 25], были получены в сотрудничестве с исследовательскими группами (Enzyme Biochemistry Group, Max-Planck Institute for Biophysical Chemistry, Gottingen, Germany; Department of Interfaces, Max-Planck Institute of Colloids and Interfaces, Potsdam, Germany; Department of Molecular Biotechnology, Center for Nano-Biophotonics, Ghent University, Ghent, Belgium; Biophysics, School of Engineering and Sciences, Jacobs University of Bremen, Bremen, Germany; Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН, Москва, Россия; Fachbereich Physik, Philipps University of Marburg, Marburg, Germany), где соискатель выполнял экспериментальную работу, анализ данных и подготовку результатов к публикации. Также вместе с коллегами были подготовлены к публикации следующие обзорные статьи по тематике, относящейся к данной работе [1, 13, 16, 23, 28]. В серии ранних работ [30, 31, 32, 33] соискатель выполнял экспериментальную работу, анализ полученных результатов и подготовку материалов к публикации.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 42 научные работы, в том числе 33 статьи в изданиях, включенных в перечень рекомендованных ВАК, 7 статей в сборниках научных трудов, 2 учебно-методических пособия.
Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, списка использованных источников (604 наименования), приложения и списка сокращений. Диссертация изложена на 274 страницах, содержит 97 рисунков и 4 таблицы.
Органические красители и квантовые точки
Функционализацию неорганических нано- и микрочастиц (от 50 нм до 20 мкм) обычно проводят путем нанесения противоположно заряженных макромолекул (полиэлектролитов) на поверхность частиц. Для этого неорганические частицы помещаются последовательно в водно-солевые растворы (NaCl) полиэлектролитов и проводят инкубацию в течении 15 минут. Перед сменой типа полиэлектролита проводят промывку в воде для удаления избытка полиэлектролитов [7], [11]. Данный метод получил название последовательной адсорбции (ПА), в зарубежной литературе Layer-by-Layer (LbL) deposition, и был впервые применен для получения полиэлектролитных многослойных структур на поверхности твердых неорганических подложек [12][13]. На рисунке 1.1 показан процесс нанесения полиэлектролитных макромолекул на сферические частицы методом последовательной адсорбции. В зависимости от задач, возможно формировать полые микрокапсулы путем удаления ядра с использованием соответствующего растворителя. При этом полиэлектролитные оболочки микрокапсул проницаемы для низкомолекулярных веществ и ионов, и непроницаемы для высокомолекулярных веществ (более 1кДа). В качестве ядер используют различные неорганические
Метод последовательной адсорбции для функционализации поверхности микрочастиц и для получения полых микрокапсул. (a) Не модифицированная микрочастица с минимальным электрическим зарядом, (b) электростатическая адсорбция первого полиэлектролита, (c) адсорбция противоположно заряженного второго полиэлектролита. (d) Повторение процесса до нанесения необходимого числа слоев. (e) В случае твердой неорганической микрочастицы, ядро можно удалить с формированием полой микрокапсулы (f). нано- и микрочастицы, эмульсии, клетки крови, бактерии. Первые оболочки микрокапсул были получены из синтетических полиэлектролитов, как например полиалиламиногидрохлорид (PAH), полидиалилдиметиламониа хлорид (PDADMAC), полистиролсульфонат (PSS), полиакриловая кислота (PAA) (Рисунок 1.2). В настоящее время используют биоразлагаемые и биосовместимые полиэлектролиты, например, декстран сульфат (DS), полиаргинин (P A r g ) , полилизин (PLis), гиалуроновая кислота (HA), хитозан, различные белки, ДНК. В основе формирования полиэлектролитных оболочек лежит электростатическое взаимодействие между противоположно заряженными функциональными группами полиэлектролитов. При этом полиэлектролиты могут быть разделены на сильные и слабые. Конформация и заряд функциональных групп (ионизация) слабых полиэлектролитов зависят от кислотности среду (pH). В то время как заряженные группы сильных полиэлектролитов остаются неизменными при изменении концентрации ионов H+ и OH-. Сочетание сильного и слабого полиэлектролитов позволяет управлять проницаемостью оболочек микрокапсул. Такое свойство микрокапсул нашло применение для инкапсуляции и высвобождения веществ. На рисунке 1.2 представлен пример проницаемости полиэлектролитных оболочек микрокапсул в зависимости от кислотности среды.
Основное взаимодействие в полиэлектролитном комплексе – электростатическое, которое происходит между заряженными группами полиэлектролитов. Кроме электростатического взаимодействия, при подборе соответствующего полиэлектролита, комплекс может формироваться за счет донорных и акцепторных групп или с образованием водородной связи [14]–[16]. В н а стоя щ е е вр е мя д ля ф о рмир о ва н и я о б олочек ми кро кап сул пр и м ен я ют кова л е н тн о е связывание, или взаимодействие «клик-химия» [17], [18].
Не менее важен материал ядра на которых формируется оболочка, так как он определяет проницаемость оболочек, а также конечную форму, морфологию и свойства микрокапсул при удалении частицы. Микрочастицы полистирола (PS), диоксида кремния (SiO2) [19] и карбоната кальция (CaCO3) [20] наиболее часто используют для получения микрокапсул (Рисунки 1.3, и 1.4), в то время как карбонат магния (MgCO3), меламин формальдегид (MF), карбонат кадмия (CdCO3) были предметом исследования в ранних экспериментах. Одним из преимуществ микрокапсул, сформированных на микрочастицах диоксиде кремния, является низкий разброс по размерам, низкая агрегация микрокапсул и небольшая толщина оболочек. Основные трудности связаны с растворением диоксида кремния, которое проводят фтороводородной кислотой, что несколько увеличивает время приготовления микрокапсул и требует соответствующего навыка работы. Микрокапсулы, полученные на микрочастицах полистирола и меламин формальдегид, имеют аналогичные параметры диоксида кремния, однако существенный недостаток этих ядер их неполное растворение, что на данный момент до сих пор остается нерешенной проблемой. Карбонат кальция очень привлекательный материал для создания микрокапсул благодаря своей биосовместимости и возможности биоразложения. Кроме того, пористая структура и большая площадь поверхности карбоната кальция делает возможным их использование для инкапсуляции различных веществ. Неоднородность по размеру микрочастиц карбоната кальция и тенденция к агрегации в процессе приготовления микрокапсул можно отнести к их недостаткам.
Эмульсии еще один класс ядер, которые можно использовать для получения микрокапсул, однако их высокая полидисперсноть ограничивает их использование [22]–[24]. Среди органических ядер для получения микрокапсул следует выделить клетки крови, а именно эритроциты [25]–[27] (Рисунок 1.5). Высокая биосовместимость эритроцитов очень привлекательна для создания микрокапсул на их основе. Однако необходимость использования буферных растворов и других специальных условий для формирования микрокапсул несколько ограничивают их использование. Микрогели еще один класс органических материалов, которые могут быть использованы для создания микрокапсул [28].
Гигантское комбинационное рассеяние света (ГКР)
Несмотря на возможность спектрально идентифицировать материалы неразрушающим способом, метод КР имеет существенное ограничение из-за небольшого сечения рассеяния (10-31 - 10-29 cм2/мол) неупруго рассеянных фотонов по сравнению с сечением рассеяния для флуоресценции (10-15 cм2/мол). Поэтому наблюдение, в 1970 годах, неожиданно высокого комбинационного рассеяния от молекул пиридина, адсорбированных на шероховатую поверхность серебряного электрода, вызвало огромный интерес у научного сообщества в области комбинационной спектроскопии [230]. В особенности после повторения такого эксперимента в разных лабораториях стало понятно, что происходит действительно усилением КР сигнала, а не увеличения количества молекул на образце [231], [232]. В течении следующих нескольких лет, усиление КР сигнала было получено для многих молекул, которые были адсорбированы на различные шероховатые металлические поверхности, и таким образом эффект получил названия гигантского комбинационного рассеяния света (ГКР). В англоязычной литературе эффект стали называть surface-enhanced Raman scattering (SERS) [233]. С открытием ГКР эффекта появилась возможность повысить чувствительность метода КР. Первые оценки коэффициента усиления показали значения 103-105, впоследствии появились образцы с коэффициентом усиления 1010-1011 [234], [235]. Приблизительно 20 лет после открытия эффекта ГКР, появились новые методы определения сечения рассеяния, которые показали значение 10-16 см2 на молекулу [236]. Полученное значение сравнимо с сечением рассеяния для флуоресценции красителей, позволило использовать ГКР для детектирования молекул, вплоть до единичной молекулы [237], [238]. Другой отличительной особенностью ГКР является пространственное разрешение, которое возможно в локальных максимумах электромагнитного поля и может обеспечить разрешение вплоть до 10 нм [239], [240], что в два раза меньше дифракционного предела и меньше чем разрешение ближнепольного микроскопа. С момента открытия ГКР метод стал привлекать внимание биофизиков и биохимиков, прежде всего из-за неинвазивности метода, отсутствия значительного рассеяния от воды и возможности проведения измерений в небольших объемах. Одним из наиболее ярких примеров является использование детектирование одиночной молекулы методом ГКР, что может найти практическое применение, например, для секвенирования ДНК вплоть до отдельных оснований без применения специальных флуоресцентных или радиоактивных меток [241]. Одним из интересных подходов применения ГКР в биофизике является использование резонансного гигантского комбинационного рассеяния (РГКР), в англоязычной литературе surface-enhanced resonance Raman scattering (SERRS). Кроме высокого сечения рассеяния, РГКР имеет высокую специфичность, так как в резонансном КР спектре преобладает колебания молекул, которые ответственны за резонансный электронный переход. РГКР перспективен для исследования высокомолекулярных веществ, такие как хромофоры (хлорофилл, каротины, феофитин, гемоглобин) [242], [243]. Кроме того, флуоресценция, которая обычно является ограничением для резонансного КР, во многих эксперимента в РГКР исключена за счет взаимодействия молекул с металлической поверхностью.
Использование метода ГКР интересно для получения информации о молекулах, находящихся на поверхности, например, клеточной мембраны, а также для отслеживания процессов на границе раздела фаз. Например, платформы ГКР на основе серебряных и золотых электродов с характерным электрическим потенциалом могут быть использованы для изучения биологических процессов, таких как перенос заряда в молекуле цитохрома [244].
Выше было рассмотрено, что падающие фотоны с энергией hv„ неупруго рассеиваются от молекулы и происходит изменение частоты падающего излучения на величину равную характерному колебанию молекулы HVM. В результате рассеянные фотоны могут приобретать или терять свою энергию в зависимости в каком состоянии находится молекула, в основном (невозбужденном) или возбуждена состоянии. В первом случае фотоны теряют энергию при возбуждении молекулы и рассеянное излучение приходит с меньшей частотой vc - Стоксовое рассеяние. Однако если молекула находиться на возбужденном виртуальном уровне, фотон приобретает энергию от молекулы и рассеянный сигнал имеет большую частоту VAC - Анти-Стоксовое рассеяние.q
Использование объема многокомпонентных носителей в качестве микрореакторов ферментативной реакции
Впервые возможность детектирования глюкозы методом ГКР было продемонстрировано в работе [401]. Используя серебряное покрытие с монослоем алкантиолов на коллоидных наносферах исследователи смогли порционно локализовать молекулы глюкозы и буферного раствора в зоне наибольшего электромагнитного усиления сигнала КР [401], [402]. Используя многовариантный анализ ученые смогли проводить детектирование ГКР в диапазонах 0-450 мг/дл (0-25 мМ) [402]. Такие сенсоры ГКР оказались довольно устойчивыми в водной среде (до трех дней) и показали эффективность детектирования в присутствии белка сывороточного альбумина в качестве сывороточной модели крови. Позже исследователи смогли увеличить время использования таких сенсоров до 11 дней, повысить скорость измерения за счет замены серебряного слоя на золотое покрытие и использование в качестве функционального слоя молекул декантиола/меркаптогексанола [403], [404]. При этом стало возможным использовать ближний инфракрасный диапазон для измерения сигнала ГКР, который оптимален для проведения экспериментов in vivo в силу меньшего затухания сигнала в биологических тканях.
Первая демонстрация in vivo измерения глюкозы методом ГКР было освещено в работе с использованием серебряного покрытия с нанесенным монослоем декантиола/меркаптогексанола на коллоидных наносферах. Платформа ГКР была подкожно имплантированы лабораторной мыши для измерения уровня глюкозы в тканевой жидкости методом ГКР. Измерения показали, что сенсор ГКР имел относительно низкую как калибровочную RMSEC 7.46 мг/дл (0.41 мМ), так и предполагаемую ошибку RMSEP 53.42 мг/дл (2.97 мМ) [405]. Количественные in vivo измерения ГКР глюкозы в тканевой жидкости от подкожно имплантированных платформ ГКР методом пространственного смещения проводилось в работе [406]. Вскоре исследователям удалось значительно продлить срок службы имплантат ГКР до 17 дней для низких уровней глюкозы ( 80 мг/дл) с RMSEC (3.6 мг/дл) и RMSEP (13.7 мг/дл) ошибками соответственно, что значительно ниже чем действующий стандарт (ISO/DIS 15197) (Рисунок 2.19) [407]. Детектирование молочной кислоты платформой ГКР из наноразмерной пленки серебра на коллоидных частицах было представлено в работе [408]. Физиологический уровень молочной кислоты (6-240 мг/дл) успешно детектировали исследователи с ошибкой 39.6 мг/дл. Кроме этого, было показана возможность одновременного детектирования молочной кислоты и глюкозы. Исследователи в работе [409] использовали серебряные наночастицы для идентификации молочной кислоты в физиологических условиях. Ими была достигнута чувствительность определения молочной кислоты с концентрацией 10-5 М, что ниже физиологического уровня. Для детектирования молочной кислоты в сыворотке крови предложена фильтрация, с целью уменьшения неселективного связывания других молекул. Рисунок 2.19. Сравнение спектров ГКР, полученых методом пространственной спектроскопии КР при измерении кожи крысы in vivo в течении 5 дней. Длина волны 785 нм, мощность 50 мВ, время накопления 2 минуты [407].
В ряде работ показано что метод ГКР может быть эффективным для детектирования микроорганизмов, например, бактерий [363], [410], причем использование различных подходов для анализа спектров позволило идентифицировать разные линии бактерий, принадлежащих к одному типу [411], [412]. Для детектирования ГКР бактерий применяют различные подходы, среди них можно выделить синтез наночастиц внутри бактерий [363], [413], что позволило различать биомолекулы внутри бактерий и проводить мониторинг оксидации флавинадениндинуклеотида [363] и различать состояния валентных форм хроматина [413]. Другим подходом для связывания сенсоров ГКР с микроорганизмами и последующим их распознаванием является нанесение платформ ГКР на поверхность мембраны бактерий [410], [414], [415]. Такой подход позволяет проводить детектирование бактерий без селективно-связывающихся агентов и значительно уменьшить время детектирования. Метод конвективной сборки наночастиц и бактерий был предложен в работах [416], [417], такой подход позволил исследователям проводить детектирование двух типов микроорганизмов с высокой воспроизводимостью. Наноструктурированные подложки ГКР еще один подход для детектирования бактерий [418], при этом показано что нанесение слоя антибиотика на подложки позволяет селективно спектрально распознавать бактерии в многокомпонентной среде, такой как кровь (Рисунок 2.20) [419], [420]. В работе [421] исследователи предложили метод фильтрации для локализации бактерий на полимерной подложке ГКР и выделении микроорганизмов из многокомпонентных сред, например, кровь, молоко. Многофункциональные сенсоры ГКР на основе золотых нанооболочек и магнитных наночастиц эффективны для быстрого концентрирования бактерий магнитным полем и чувствительного детектирования методом ГКР [422]. Значительно увеличить селективность и воспроизводимость детектирования микроорганизмов позволила интеграция методов ГКР и микрофлюидики, ученным удалось показать точность в 92% в определении девяти линий бактерии E. coli [411], [423].
(a) Схема, показывающая взаимодействие бактерии с платформой ГКР, модифицированной ванкомицином. (b) Изображения бактерий на платформе ГКР, полученное методом сканирующей электронной микроскопии (масштабный отрезок - 500 нм). (c) Спектры ГКР бактерии L. plantarum полученный от платформы с ванкомицином (концентрация ванкомицина 10-2 M), и спектр КР ванкомицина на платформе ГКР и в растворе (510-2 M) [419]. 2.10. Применение метода ГКР для исследования биологических тканей
Микроспектрометрия комбинационного рассеяния была успешна применена для in situ детектирования антител в тканях. Для этого исследователи использовали золотые наночастицы с ароматическими молекулами, которые затем были связаны с соответствующими антителом. Такая структура позволила локально детектировать антитела простаты в эпителиальной раковой ткани предстательной железы [424].
Изучение тканей органов кролика методом ГКР было проведено в работе [425]. Для этого органы подвергались заморозке при температуре жидкого азота с последующим их измельчением и затем смешивались с серебряными наночастицами. Такой подход позволил получить довольно хорошую воспроизводимость спектров ГКР, а также найти различие в спектрах полученных от тканей разных органов.
Исследователи применили сенсоры ГКР на основе золотых наночастици селективного маркера для химического картирования живого эмбриона рыбы Данио-рерио (Zebrafish). Наночастицы были введены в эмбрион на первой стадии его развития. КР картирование для наблюдения за наночастицами было выполнено на стадиях между 6 и 96 часами деления. Изучение биосовместимости и токсичности наночастиц показало отсутствие токсических эффектов на эмбрион с характерной морфологией и экспрессией генов эмбриона, а также свойственной форме органов. Разработан протокол детектирования ГКР in vivo многофункциональных маркеров в неделящихся клетках и их развитие в органы [426].
Биосовместимые золотые нанозвезды с характерным размером 60 нм, стабилизированные гидрофильным этиленгликоль и содержащих маркеры КР, применялись для распознования подавителя белка p63 в тканях предстательной железы [427].
Метод пространственно-смещенного ГКР с использованием золотых наночастиц с маркером КР был использован для неинвазивного детектирования в тканях животных. Исследователи продемонстрировали детектирование агрегатов наночастиц при фиксированном смещении 2-3 мм в ткани, которая содержит значительное количество белков и липидов. Более того ими было достигнуто детектирование агрегатов наночастиц на глубине 7-8 мм в ткани с высоким содержанием белка с высоким отношением сигнала к шуму. В дополнении, такие агрегаты были задетектированы на глубине 1-2 мм в тканях с высоким количеством липидов, что как известно вызывает определенные трудности из-за высокого поглощения липидов в ИК диапазоне [428]. Мониторинг тканей меланомы на молекулярном уровне с использованием маркированных и не маркированных золотых и серебряных наночастиц методом ГКР проводился в работе [429]. Исследователи использовали ex vivo ткань кожи мыши, инициированную меланомой. Наночастицы меченые крезил фиолетовым оказались эффективны для локального связывания и детектирования в злокачественных тканях. Спектры ГКР были получены с использованием двух лазеров в видимом и ближнем ИК диапазонах [429], [430]. Три активных ГКР агента в ближней ИК области CyRLA-572, Cy7LA и Cy7.5LA были выбран для модификации золотых наночастиц с целью получения многокомпонентного сигнала ГКР. Дополнительно модифицированные антителами данные наночастиц были использованы для детектирования трех рецепторов в эмбриональных стволовых клетках мыши (mESCs), которые содержали три слоя, такие как экзодерма, мезодерма и эндодерма. В результате успешного распознавания клеток методом ГКР, исследователи провели детектирование трех слоев в тератоме, что является злокачественной опухолью, которая формируется из mESCs клеток в модельной ксенотрансплантации (Рисунок 2.21) [431]. В работе были синтезированы высокочувствительные платформы ГКР на основе золотых наночастиц с активным ГКР маркером липоевой кислоты CyNAMLA-381. Последующая конъюгация наночастиц антителами позволила успешно применить такие сенсоры для in vivo детектирования мембранного белка HER2 на моделях мышей с ксенотрансплантацией [432]. Исследователи провели модификацию оптоволокна золотыми наночастицами для изучения клеточных культур и тканей методом ГКР. Ими было успешно использован данный подход для измерений ГКР опухолевых клеток пищевода [433]. Новый метод ГКР
Регистрация спектров ГКР от собственных молекул эритроцитов, находящихся на плазматической мембране
Катаболический фермент L-аспарагиназа (L-ASNase) катализирует аминокислоту – аспаргин, необходимую для жизнедеятельности клетки, до аспаргиновой кислоты и аммиака. Данный фермент присутствует в живых организмах от бактерий до млекопитающих. Кроме метаболической роли в человеческом организме, фермент действует как терапевтический фермент в комбинации с другими лекарствами. Среди которых можно выделить, винкристин и преднизон для терапии острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) и диффузной неходжкинской лейкомы [477]. ОЛЛ классифицируется как рак крови у детей с довольно продолжительным периодом выживания около 80 % [478], [479]. Терапевтические свойств L-аспарагиназы были впервые идентифицированы и охарактеризованы в клинических тестах на человеке в 70-х годах прошлого века [480], [481]. С тех пор фермент L-аспарагиназа стал одним из наиболее часто применяемым в терапии ОЛЛ. Принцип его действия основан на том факте, что раковые лимфобласты не могут синтезировать достаточный уровень аспаргина из-за низкой регуляции аспаргин синтетазы, что в свою очередь характерно для здоровых клеток [482]. Поэтому аспаргин является очень важной аминокислотой для раковых клеток, чья выживаемость исключительно зависит от доступности аспаргина в потоке крови. Внутривенно или внутримышечно введённая L-аспарагиназа уменьшает наличие в крови свободного аспаргина, выделяемого из клеток, при этом происходит замедление синтеза белков и нуклеиновых кислот, что ведет в конечном счете к клеточному апоптозу раковой клетки [483]. Бактериальная L-аспарагиназа является не человеческим ферментом, который был одобрен управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (American Food and Drug Administration – FDA, США) для терапии ОЛЛ [484]. Изоформы фермента, которые используют в данное время, получают рекомбинантно из бактерий кишечной палочки (Escherichia coli) и Erwinia chrysanthemi. В большинстве случаев для ферментов, выделенных из бактерий, имеет место токсические эффекты, например, иммуногенность, гепатитная дисфункция, панкреатит, анормальность центральной нервной системы, анорексия, гипергликемия, тромбоз и очень часто летальная гиперчувствительность [485], [486]. Некоторые нежелательные эффекты могут быть вызваны активностью глютаминазы бактериальных L-аспарагиназ, которая оказывая влияние на глютамин и на уровень глютаминовой кислоты [487]. Глютамин является главным транспортом азота в кровь, в то время как глютаминовая кислота оказывает значительное влияние на центральную нервную систему, выполняя роль нейротранзмитера. Однако, главное ограничение использования бактериальных L-аспарагиназа в качестве антиракового агента связано с так называемой «тихой активацией» фермента [488]. Активация может быть вызвана взаимодействием с специфическими антителами, которые выделяются иммунной системой пациента при распознавании фермента как антигена, что обычно не связано с симптомами гиперчувствительности [489], [490]. Для уменьшения инактивация фермента (период полураспада в сыворотке крови около 24 часов) необходимо постоянное введение и достаточно высокие дозы [490]. Также было показано, что кроме выше упомянутых эффектов на активность фермента оказывает влияние две лизосомальные протеазы, при действии которых фермент деградирует с потерей своей активности [491]. Значительные усилия были сделаны для повышения стабильности фермента и для увеличения продолжительности каталитического действия фермента посредством модификации его поверхности и заключение его в объем нанокапсул [492] и наносфер [493]. Инкапсуляция позволила снизить влияние иммунной системы на ферментативную активность и уменьшить действие протеазами. Это было достигнуто пэгилированием фермента [494], выделенного из бактерий кишечной палочки, что позволило снизить иммуногенность и увеличить время жизни in vivo [490], [495], [496]. Кроме того, полисиализация фермента приводит к уменьшению антигенности фермента в зависимости от степени направленной модификации цепочки лизина полисиальной кислотой, в то время как отсутствие иммунного ответа было отмечено в случае конъюгации. Последние изыскания связаны с возможностью использования кровяных клеток, эритроцитов в качестве носителей терапевтического фермента [497]. Кроме того, первые пре-клинические результаты имеют очень хорошие перспективы, несмотря на относительно длительный процесс, его сложность и высокую стоимость в направлении персонализированных подходов.
В наших исследованиях представлен новый подход для инкапсулирования модельного фермента L-аспарагиназа, выделенного из цитоплазмы Пекарских дрожжей (ScASNaseI). Инкапсуляция L-аспарагиназы проведена с использованием пористых микрочастиц карбоната кальция в качестве носителя фермента, на которые затем были нанесены последовательно катионные (поли-L-аргинин) и анионные (Декстран сульфат) полиэлектролитные слои [74]. Формирование микрокапсул достигнуто за счет растворения карбоната кальция диализом в растворе ЭДТА. Поскольку L-аспарагиназа является терапевтическим ферментом, используемым для терапии рака крови, было проведено изучение биосовместимости инкапсулированного фермента для увеличения его биохимической стабильности и увеличению пролонгирующего действия in vitro. Эффективность использованного подхода подтверждается результатами в ряде работ, где проводилась инкапсуляция фермента различными полимерами [94], [498], [499].
Иинкапсуляция фермента в микрочастицы достигнуто методом преципитации, который, как было установлено, является эффективным по сравнению с методом адсорбцией на предварительно синтезированные микрочастицы [72]. Метод преципитации позволил инкапсулировать фермент с малыми потерями, установлено, что 3 мг фермента было загружено в микрочастицы с потерями около 0.06 мг. Для оценки среднего количества фермента на одну микрочастицу производился подсчет микрочастиц в камере Горяева. В результате 108 микрочастиц содержали фермент, что составляет 30 пикограмм на одну микрочастицу. Высокая эффективность загрузки может быть связана с электростатическим взаимодействием между ферментом и микрочастицами. Известно, что изоэлектрическая точка фермента составляет 5.3, что говорит преимущественно об отрицательном заряд фермента при pH 7.5. В то время как при тех же условиях микрочастицы карбоната кальция имеют положительный заряд [84]. Контрольные эксперименты при pH 6, где значение близко к изоэлектрической точки фермента, установлено снижение загрузки в 5 раз (Рисунок 4.4).
Для получения микрокаспул полиэлектролитные слои были последовательно нанесены на микрочастицы. Декстран сульфат и поли-L-аргинин были выбраны в силу их биосовместимости и перспективы использования in vivo. После каждого цикла нанесения полиэлектролита, проводилось измерение электрофоретической подвижности (Рисунок 4.5). После нанесения четырех полиэлектролитных слоев, микрочастицы карбоната кальция были растворены с целью получения полых микрокапсул. Растворение микрочастиц проводилось в смеси 50 мМ Na2HPO4, 0.5 М NaCl, 20 мМ EDTA, pH 6.5 (объемное соотношение 1:1000) путем диализа в течении минимум 12 часов. Данный протокол был применен для снижения инактивации фермента, которое может возникнуть при действие хелатообразующего агента ЭДТА (0.1 М). Такая концентрация ЭДТА является высокой и приводит к потере активности фермента. Поэтому было проведено изучение влияния концентрации ЭДТА на активность свободного фермента. Обнаружено, что концентрация ЭДТА до 20 мМ не оказывает ингибирующего действия на активность свободного фермента (Рисунок 4.6). В результате растворения микрочастиц диализом в растворе 20 мМ ЭДТА было достигнуто полное растворение карбоната кальция с сохранением полной активности загруженного фермента. Данный протокол может быть адаптирован для растворения микрочастиц карбоната кальция, содержащих белковые молекулы. Кроме того, данный метод растворения эффективен для структур, содержащих более чем четыре полиэлектролитных слоя (Рисунок 4.7).