Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Производство водорода 8
1.2. Моделирование производства водорода 17
1.3. Структура ферредоксина, ФНР и гидрогеназы 25
1.4. Постановка задачи 38
Глава 2. Метод многочастичного моделирования 40
2.1. Броуновское движение 41
2.2. Модельная сцена 44
2.3. Описание движения белков 45
2.4. Электростатическое взаимодействие белков 49
2.5. Кинетические кривые 54
Глава 3. Подбор параметров модели. Валидация модели. Зависимость от ионной силы 56
3.1. Подбор параметров модели 56
3.2. Валидация модели. Зависимость от ионной силы 64
Глава 4. Результаты исследования. Влияние pH на взаимодействие ферредоксина, ФНР и гидрогеназы 68
4.1. Зависимости констант скоростей образования комплексов ферредоксин-ФНР и ферредоксин-гидрогеназа от pH 68
4.2. Сравнительный анализ эквипотенциальных поверхностей ферредоксина, ФНР и гидрогеназы 71
Глава 5. Исследование влияния мутаций на скорость связывания ферредоксина, ФНР и гидрогеназы 78
Заключение 88
Список литературы 91
- Структура ферредоксина, ФНР и гидрогеназы
- Описание движения белков
- Валидация модели. Зависимость от ионной силы
- Сравнительный анализ эквипотенциальных поверхностей ферредоксина, ФНР и гидрогеназы
Введение к работе
Актуальность работы. Процесс фотосинтеза лежит в основе жизни на Земле. Фотосинтезирующие организмы производят органические вещества из неорганических и обогащают воздух кислородом. Однако человечество расширило функции растений и водорослей и научилось использовать их во всех областях своей деятельности. Много тысяч лет растения используются в качестве топлива, хотя это далеко не самый эффективный метод получения энергии. Недавно было показано, что некоторые фотосинтезирующие организмы способны на свету производить молекулярный водород – экологически чистый источник энергии. Его сгорание в присутствии кислорода дает единственный продукт – воду, не наносящую вреда окружающей среде. Фотосинтезирующие организмы способны на это благодаря специальному ферменту – гидрогеназе, получающей электроны из электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) фотосинтеза от белка ферредоксина и восстанавливающей протоны до молекулярного водорода.
Линейный транспорт электрона по ЭТЦ фотосинтеза приводит к формированию электрохимического потенциала на мембране, служащего движущей силой синтеза АТФ, и образованию НАДФН — сильного восстановителя, необходимого для фиксации углерода в цикле Кальвина и синтеза органических веществ. Этот последний этап опосредуется белком ферредоксин-НАДФ+-редуктазой (ФНР), получающей необходимый электрон от белка ферредоксина (Фд). Наряду с этим бактерии и зеленые водоросли содержат белок гидрогеназу, которая может восстанавливать протон до атомарного водорода, получив электрон от ферредоксина. Именно этот процесс может служить источником водорода как биотоплива. В настоящее время активно исследуются пути максимизации выделения водорода организмами, в которых протекает эта реакция. В основном, экспериментальные исследования в данной области направлены на поиски условий выращивания микроорганизмов и создание химерных белков, сокращающих физическое расстояние между ферредоксином и гидрогеназой [Yacoby et al., 2011]. Для практического решения конкретной задачи — получения биоводорода – необходима информация о молекулярных механизмах, делающих возможным процесс синтеза водорода живыми организмами под действием света.
Для изучения молекулярных механизмов взаимодействия белковых молекул используются методы молекулярного моделирования, в которых выявляются факторы, влияющие на процесс образования белок-белковых комплексов. На дальних расстояниях к этим факторам можно отнести силы электростатического взаимодействия между молекулами, вязкость среды,
размеры самих белков, определяющие скорость их диффузии. На близких
расстояниях начинают играть роль строение комплементарных поверхностей
(«интерфейсов») молекул, гидрофобные и Ван-дер-Ваальсовы силы, толщина
гидратной оболочки молекулы. Эти факторы определяют скорость
взаимодействия молекул в клетке и их сродство друг к другу, а значит и кинетику соответствующего процесса.
Подвижность биомакромолекул традиционно изучается методами броуновской и молекулярной динамики. Броуновская динамика позволяет моделировать процесс формирования предварительного комплекса, то есть комплекса, образующегося при столкновении молекул в результате диффузии.
В работе методами броуновской динамики исследуются механизмы и кинетика взаимодействия ферредоксина с его белками-партнерами, а именно ФНР и гидрогеназой, и исследуются условия, влияющие на эти процессы.
Цели и задачи работы. Целью работы было изучение молекулярных механизмов переключения потоков электронов с ферредоксина на ФНР и гидрогеназу методом многочастичной броуновской динамики. В связи с целью исследования были поставлены следующие задачи:
1. Создание многочастичных броуновских моделей взаимодействия
ферредоксина с ФНР и гидрогеназой.
2. Изучение формы и свойств электростатических полей молекул ферредоксина,
ФНР и гидрогеназы и их влияния на сродство белков друг к другу.
-
Исследование на модели влияния ионной силы среды на скорость взаимодействия ферредоксина с ФНР и гидрогеназой.
-
Исследование на модели влияния точечных мутаций на скорость взаимодействия белков.
5. Исследование влияния pH среды на конкуренцию за ферредоксин между ФНР
и гидрогеназой.
Научная новизна и практическая значимость работы. Научная и практическая значимость работы заключается в разработке прямых моделей взаимодействия ферредоксина с ФНР и гидрогеназой. Было исследовано влияние pH, ионной силы и мутаций на скорость взаимодействия белков. Было показано, что увеличение pH значительно влияет на свойства электростатического поля гидрогеназы и ее сродство к ферредоксину, что указывает на регуляцию переключения электронных потоков в клетке посредством pH. Помимо этого, были идентифицированы аминокислотные остатки, мутации которых потенциально увеличивают скорость взаимодействия ферредоксина и гидрогеназы.
Используемый метод позволяет моделировать процессы так, как они протекают в клетке с учетом свойств растворителя, формы молекул и их
количества. Предсказательная сила метода основывается на возможности моделирования мутаций и исследования их влияния на скорость взаимодействия молекул.
Апробация работы
Материалы диссертации докладывались и обсуждались на: 15-той–20-той
и 22-ой Международных конференциях «Математика. Компьютер.
Образование», Дубна 2008, 2010, 2012, 2016, Пущино, 2009; 2011, 2013; IV и V Съездах биофизиков России, Нижний Новгород, 2013, Ростов-на-Дону, 2015; 16-ом Международном симпозиуме «Flavins and Flavoproteins», Хака, Испания, 2008; 7-ой международной конференции «Bioinformatics of genome regulation and structure», Новосибирск, 2010; 1-ом международном симпозиуме «1st International Symposium on Computational Materials and Biological Sciences», Токио, Япония, 2013; Международной школе «Вычислительное и теоретическое моделирование биологических взаимодействий», Дубна, 2013; семинарах кафедры биофизики биологического факультета МГУ.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 21 работа, из них 7 – в журналах, рекомендованных ВАК для соискателей ученых степеней, 4 – в сборниках научных трудов международных конференций и 9 тезисов – в сборниках тезисов докладов международных конференций.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, четырех глав, содержащих описание методов и результатов работы, заключения, списка литературы из 110 наименований. Объем диссертации 103 страницы, 29 рисунков и 2 таблицы.
Структура ферредоксина, ФНР и гидрогеназы
Помимо ограничений, связанных с чувствительностью гидрогеназы к кислороду, существуют другие факторы, регулирующие потоки от ФСI. В анаэробных условиях или при инактивации Рубиско, происходит накопление фотосинтетически синтезируемых восстановителей [Greenbaum et al., 1995], что приводит к фосфорилированию и отсоединению светособирающей антенны от ФСII. В результате, происходит так называемый переход из состояния 1 в состояние 2, характеризующемуся большим световым возбуждением ФСI по сравнению с ФСII [Bellafiore et al., 2005]. В этом состоянии циклический электронный транспорт вокруг ФСI преобладает над линейным [de Vitry et al., 2004]. Эти процессы снижают электронный транспорт от воды на гидрогеназу.
На выделение водорода также значительно влияют разобщители электрогенного фосфорилирования и ингибиторы синтеза АТФ [Kruse et al., 2005]. Добавление разобщителей до начала анаэробной адаптации подавляет гидрогеназную активность, подавляя требующие затрат энергии процессы – экспрессию, созревание и транслокацию гидрогеназы [Happe et al., 1994]. Однако добавление разобщителей к уже адаптированным клеткам, наоборот, стимулирует фотопродукцию водорода за счет снятия эффекта замедления электронного потока протонным градиентом [Happe et al., 1994]. В условиях, когда утилизация АТФ за счет фиксации углерода ограничена, перенос протонов через тилакоидную мембрану ингибирован. Это приводит к закислению люмена, и снижению фотосинтетической активности [Lee and Greenbaum, 2003]. Добавление ионофоров приводит к увеличению электронного транспорта на гидрогеназу и, следовательно, выделения H2.
Другим фактором, влияющим на эффективность выделения водорода, является конкуренция между различными метаболическими путями за ферредоксин. Поскольку в отсутствие НАДФ+, акцептора электронов ФНР, ФНР не активна, добавление НАДФ+ к изолированным тилакоидам, содержащим гидрогеназу и ФНР, приводит к снижению выделения водорода на 75% по сравнению с той же системой без НАДФ+, то есть с неактивной ФНР [Yacoby et al., 2011]. В частности, в анаэробных условиях, конкуренция между гидрогеназой и ФНР за ферредоксин является важным фактором, ограничивающим выделение водорода.
Активность ферредоксин-НАДФ+-редуктазы в хлоропласте также регулируется. Известно, что в темноте величина pH стромы тилакоидов примерно равна 6, но при освещении, то есть при протекании фотосинтеза, в результате транспорта протонов в люмен она быстро достигает 8 [Wagner et al., 1990]. Также известно, что в темноте, при pH 6, когда нет необходимости в протекании реакции ферредоксина и ФНР, ФНР «заякоривается» в тилакоидной мембране через белок TROL [Alte et al., 2010; Juri et al., 2009; Mulo, 2011] и во внутренней мембране хлоропласта через белок Tic62 [Balsera et al., 2007; Benz et al., 2009; Mulo, 2011]. Взаимодействие ФНР с этими белками опосредуется гидрофобными взаимодействиями. Более того, при pH около 6 за счет конформационных перестроек НАДФ+-связывающего домена ФНР сродство ФНР к НАДФ+ снижается [Lee et al., 2007]. При повышении pH до 7-8 эти процессы обращаются, и ФНР вновь становится способной взаимодействовать как с ферредоксином, так и с НАДФ+. Благодаря этим процессам при освещении молекулы ФНР могут быстро отсоединиться от связывающих их белков и начать участвовать в электронном транспорте.
Таким образом, для выделения H2 при недостатке серы необходима скоординированная работа: 1) оксигенного фотосинтеза, то есть остаточная активность ФСII для генерации электронов посредством окисления воды; 2) митохондриального дыхания, в результате которого поглощается весь образованный в процессе остаточного фотосинтеза кислород и сохраняются анаэробные условия; 3) катаболизма эндогенных субстратов, включающего в себя катаболизм белков, крахмала и, по-видимому, жиров, и дающего субстрат, подходящий для окислительного фосфорилирования и, возможно, для совместного с НАД(Ф)Н электронного транспорта в хлоропласт; 4) электронного транспорта по гидрогеназному пути и выделения H2, поддерживающих базовый уровень фотосинтеза и ЭТЦ дыхания для синтеза АТФ.
Описание движения белков
Электростатические взаимодействия играют важную роль в связывании белков электрон-транспортной цепи. Парциальные заряды на белках создают гетерогенное электростатическое поле, которое значительно снижается с ростом расстояния от поверхности белка за счет экранирования полярными молекулами воды. Если белок находится далеко от других белков, он движется за счет броуновской силы, но не электростатической. Таким образом, его движение определяется исключительно броуновской диффузией. Как только белок подходит близко к другим белкам, его движение задается электростатическим полем последних для достижения правильной ориентации и формирования предварительного комплекса. При значительных расстояниях между поверхностями белков (больше 35 ) электростатические взаимодействия очень слабы из-за экранирования электрического поля молекулами воды и противоположно заряженными ионами. На расстоянии 35 в растворе с ионной силой 100 мМ экранирование приводит к уменьшению электростатического потенциала в 80 раз по сравнению с раствором без ионов соли. Поэтому в модели электростатическое взаимодействие между белками учитывается только при сближении их поверхностей на расстояние менее 35 , которое мы назвали расстоянием электростатического взаимодействия.
Для описания электростатических взаимодействий необходимо рассчитать электростатическую силу и ее момент, действующие на белок со стороны других белков, находящихся ближе расстояния электростатического взаимодействия. Для этого перед началом моделирования движения белков вокруг каждого белка в прямоугольной трехмерной области заданного размера рассчитывается значение потенциала электрического поля для заданной ионной силы и pH раствора. Размер области зависит от расстояния взаимодействия и выбирается автоматически таким, чтобы возможно было рассчитать взаимодействие рассматриваемых белков внутри расстояния взаимодействия. Для расчета электростатической силы и момента силы, при выполнении условия, что расстояние между поверхностями двух молекул белков меньше расстояния взаимодействия, нам надо знать значение потенциала первого белка не только на расстоянии взаимодействия, но и в области, занимаемой остальными частями второго белка. Таким образом, размер области для расчета потенциала вокруг первого белка определяется максимальным его радиусом (расстоянием от центра белка до наиболее выступающего атома), максимальным диаметром второго белка (максимальным расстоянием между атомами белка) и расстоянием взаимодействия.
В области для расчета потенциала задается прямоугольная трехмерная сетка с определенным шагом h (рис. 12). Величина шага является параметром модели и определяет точность расчета потенциала. В наших расчетах мы брали величину шага сетки равную 2 . Ячейкам сетки присваиваются значения заряда, диэлектрической проницаемости и ионной силы.
Значения зарядов на атомах вычисляются по уравнению Хендерсона-Хассельбальха [Henderson, 1908; Hasselbalch, 1917]: Здесь pH – это десятичный логарифм концентрации протонов в среде со знаком минус, pOH=14 – pH, Ka - константа диссоциации кислоты, pKa = -log10(Ka). Kb - константа диссоциации основания, pKb = 14 – pKa. [A–] ([B]) – концентрация кислоты (основания) в депротонированной форме, [АН] ([BH+]) – концентрация кислоты (основания) в протонированной форме.
Значения pKa аминокислот взяты из [Dawson et al., 1959]. Если в одну ячейку попадает несколько заряженных атомов, в нашей модели заряд суммируется.
В модели белок считается областью с диэлектрической проницаемостью = 2 с пространственно-распределенными фиксированными зарядами. Раствор считается областью с диэлектрической проницаемостью = 80 с мобильными зарядами (ионами).
Значения в каждой ячейке определяются по наличию в ней атома. Ячейкам, в которые попали атомы, присваивается значение = 2. Затем определяются ячейки, находящиеся внутри белка, но в которые не попали атомы, и им тоже присваивается значение = 2. Ячейкам, находящимся в непосредственном соседстве с ячейками с = 2, присваивается = 40. Всем остальным ячейкам присваивается = 80.
Значение ионной силы для ячеек с = 2 считается равным нулю. Для остальных ячеек значение ионной силы принимается равным ионной силе раствора.
Потенциал в ячейках сетки рассчитывается по итерационной формуле (2.4), которая получена из линеаризованного уравнения Пуассона–Больцмана (2.5) [Fogolari, 2011]. Потенциал в данной ячейке на данном шаге вычисляется в соответствии с потенциалами в соседних ячейках на предыдущем шаге и суммарным зарядом данной ячейки:
Таким образом, для каждого типа объектов (белок в восстановленном и окисленном состояниях) в некоторой области вокруг объекта известно значение потенциала электрического поля. Теперь для нахождения силы и ее момента, действующих на отдельный заряд в белке, необходимо вычислить градиент потенциала, создаваемого другими белками, в той точке, где находится заряд. По известному градиенту поля и величине заряда вычисляется сила, действующая на заряд. Для того чтобы рассчитать силу и момент, действующие в целом на молекулу, надо просуммировать силу и момент, действующие на каждый из зарядов данной молекулы.
Валидация модели. Зависимость от ионной силы
Свойства белков, включая их растворимость, суммарный заряд и конформацию, зависят от рН среды, то есть от концентрации ионов водорода в среде. рН цитозоля как животных, так и растительных клеток поддерживается постоянным и близким к 7. Однако в некоторых компартментах клетки рН значительно отличается от цитозольного и в некоторых органеллах, таких как хлоропласты, может изменяться в зависимости от внешних условий и протекающих в клетке процессов [Heldt et al, 1973; Wu and Berkowitz, 1992]. Таким образом, можно говорить о некоторой оптимальной величине рН, при которой белки клетки функционируют наиболее эффективно. Более того, в клеточных компартментах, в которых рН изменяется, он может служить регуляторным механизмом, изменяющим скорости взаимодействия белков друг с другом и другими типами молекул, их растворимость и конформационную стабильность [Nelson and Сох, 2004].
Что же происходит с белками при изменении рН? При снижении рН, то есть закислении среды и увеличении концентрации протонов Н+, карбоксильные группы аминокислотных остатков глютаминовой и аспарагиновой кислот (Glu и Asp, соответственно) протонируются в соответствии с реакцией -СОСГ+Н+ — -СООН. Одновременно протоны садятся на аминогруппы аргинина (Arg) и лизина (Lys), превращая нейтральную группу -NH2 в положительно заряженную -NH . Эти два процесса приводят к одному результату - белок становится более положительно заряженным. С другой стороны, при увеличении рН и защелачивании раствора, количество протонов уменьшается, и боковые группы –СООН Glu и Asp и -NH+ Arg и Lys теряют протоны. В результате, белок становится более отрицательно заряженным. В любом случае, изменение pH приводит к изменению электростатических свойств белковых молекул и, следовательно, их физиологической активности.
За влиянием pH на белки можно проследить путем измерения их активности (в случае ферментов) или скорости взаимодействия с белками-партнерами. Эксперименты показали, что зависимость активности большинства белков от pH имеет широкое плато в диапазоне физиологического pH. Более того, считается, что белки могут существовать в своей нативной конформации только в границах pH 4-10 [Nelson and Cox, 2004]. При значениях pH, выходящих из границ этого диапазона, белок денатурирует. В щелочных растворах это происходит из-за частичного разрушения дисульфидных мостиков в реакции -элиминирования; в кислых – в результате гидролиза подвижных пептидных связей, часто вблизи остатков аспарагиновой кислоты.
Известно, что на световой стадии фотосинтеза помимо транспорта электронов происходит транспорт протонов из стромы в люмен. В результате pH люмена становится более кислым, а pH стромы – более щелочным, причем эти изменения составляют около 2 единиц pH [Hauser et al. 1995]. Такое значительное изменение pH может служить регуляторным механизмом, влияющим на сродство ферредоксина к ФНР и гидрогеназе и, следовательно, на распределение электронных потоков. Для оценки влияния изменения pH стромы на распределение потоков от ферредоксина, нами были рассчитаны зависимости скоростей образования комплексов ферредоксина с ФНР и гидрогеназой в парных моделях и конкурентной модели (рис. 20 и 21). Рисунок 20. Зависимость константы скорости связывания ферредоксина с ФНР (пунктирная линия) и гидрогеназой (сплошная линия) от pH.
Рассчитанные нами на модели константы скорости взаимодействия ферредоксина c ФНР (пунктирная линия) и гидрогеназой (сплошная линия) для разных значений рН приведены на рисунках 20 и 21. В обоих типах моделей минимальные значения константы для обеих пар белков соответствуют значениям pH 4 и 10; при таких pH начинает нарушаться нативная конформация белков. В области значений pH 5-7,5 константа скорости связывания гидрогеназы и ферредоксина практически не изменяется, а затем резко увеличивается, достигает максимума при pH 9 и вновь снижается. При этом при pH 6,5 константа скорости связывания ферредоксина с гидрогеназой в парной модели примерно в три раза меньше, чем константа скорости связывания Фд с ФНР; в тройной – примерно в два раза. Данный результат согласуется с экспериментальными данными: при pH 7 около 85% электронов идет на ФНР и только 15% — на гидрогеназу [Yacoby et al., 2011].
Зависимость константы скорости связывания ФНР и ферредоксина имеет небольшой максимум при pH 5, не соответствующем физиологическим значениям, практически постоянна на промежутке от 6 до 7,5 единиц pH, и имеет второй максимум при pH 9. Такая форма зависимости от pH с широким плато характерна для многих белков, поскольку она позволяет белкам сохранять активность при изменении pH среды. pH стромы хлоропластов изменяется от примерно 6 единиц pH в темноте до 8-8,5 единиц на свету. Как показано выше, этот процесс сопровождается изменением сродства белков друг к другу. Для того, чтобы понять механизм этого изменения, мы построили эквипотенциальные поверхности белков, отражающие распределение зарядов на молекулах.
Сравнительный анализ эквипотенциальных поверхностей ферредоксина, ФНР и гидрогеназы
Одним из подходов к решению биотехнологической задачи получения водорода из зеленых водорослей является воздействие на молекулярном уровне, а именно изменение структуры или синтеза участвующих в процессе белков. Необходимо, чтобы ферредоксин предпочтительнее взаимодействовал с гидрогеназой, а не с ФНР. Одним таким экспериментальным подходом является даун-регуляция производства ФНР методом РНК-интерференции, приводящая к увеличению выхода молекулярного водорода [Sun et al., 2013]. Также проводились работы по сшиванию гидрогеназы и ФСI, что позволило увеличить доступность белка для взаимодействия с ферредоксином [Yacoby et al., 2011]. Другой подход заключается во введении в ферредоксин, ФНР или гидрогеназу точечных мутаций, изменяющих сродство белков друг к другу. Таким образом, задача заключается в идентификации мутаций, уменьшающих сродство ферредоксина к ФНР и увеличивающих – к гидрогеназе. Основным экспериментальным методом определения роли аминокислотных остатков во взаимодействиях между белками является сайт-специфический мутагенез [Casaus et al., 2002; Faro et al., 2002; Gomez-Moreno et al., 1998; Hurley et al., 1993, 1999, 2000; Martinez-Julvez et al., 1998a,b, 1999]. Используя нашу модель, мы можем воспроизвести такие эксперименты для мутаций, изменяющих заряд белка.
На поверхности ФНР вокруг экспонированной наружу части ФАДа расположено несколько положительно заряженных аминокислотных остатков [Serre et al., 1996] (рис. 26). Эти аминокислотные остатки условно можно подразделить на две группы, различающиеся по степени влияния на взаимодействие с ферредоксином [Hurley et al., 1999]. Вблизи ФАДа на поверхности ФНР, взаимодействующей с ферредоксином, расположено несколько положительно заряженных аминокислотных остатков, ориентирующих отрицательно заряженный ферредоксин при формировании комплекса. К этим остаткам относятся Arg16, Lys72, Lys75, Arg100, Lys138, Arg264 и Lys294. Они располагаются в области нейтрального потенциала, следовательно, изменение их заряда значительно влияет на распределение потенциала в области ФАДа, то есть области взаимодействия с ферредоксином. Замены этих аминокислотных остатков на нейтрально или противоположно заряженные должно привести к неоптимальной для докинга ориентации ферредоксина относительно ФНР, то есть более слабому взаимодействию между белками и неподходящей для электронного транспорта ориентации. Рисунок 26. Поверхность молекулы ФНР в области ФАДа. Боковые цепи основных аминокислотных остатков показаны голубым цветом (атомы азота – синим). Кислые остатки показаны розовым цветом (атомы кислорода карбоксильной группы – красным). ФАД изображен желтым цветом (адаптировано из [Hurley et al., 2000])
Для определения кинетических констант для различных мутантов ФНР мы изменяли заряды на соответствующих аминокислотных остатках и проводили моделирование при заданных значениях параметров (r = 18 , p = 0,003). Результаты представлены в таблице 1. Точное совпадение значения константы для дикого типа ФНР объясняется тем, что для него производился подбор параметров.
Мы исследовали влияние мутаций с заменой заряда на скорость образования комплекса Фд-ФНР. На модели мы воспроизвели экспериментальные результаты. Изменение заряда в местах расположения аминокислотных остатков Arg16, Lys72 и Lys75 значительно снизило константу скорости взаимодействия ферредоксина и ФНР. Эти аминокислотные остатки лежат в области нейтрального потенциала, поэтому изменение заряда на них значительно меняет форму электростатического потенциала и, следовательно, силу взаимодействия между ФНР и ферредоксином. Более того, эти аминокислотные остатки напрямую взаимодействуют с отрицательно заряженными остатками на ферредоксине, формируя межмолекулярные солевые мостики. Таким образом, Arg16, Lys72 и Lys75 отвечают как за ориентацию ФНР и ферредоксина относительно друг друга, так и за стабилизацию комплекса. Полученные в модели значения скорости для мутантов Arg16Glu, Lys72Glu и Lys75Glu различаются не очень сильно (не более, чем на порядок). Такой результат отражает тот факт, что эти аминокислотные остатки расположены рядом, и замена их положительного заряда на отрицательный примерно одинаково влияет на распределение электростатического потенциала на белке. В эксперименте константа скорости для мутации Lys75Glu падает драматически (более, чем на три порядка). Несоответствие модельной константы скорости для мутанта Lys75Glu объясняется тем, что этот аминокислотный остаток является критическим для образования комплекса не только за счет изменения потенциала при его мутации, но и благодаря другим межмолекулярным взаимодействиям [Martinez-Julvez et al., 1998b].
Мутация Arg100Ala, несмотря на замену положительного заряда на нейтральный, незначительно влияет на скорость реакции образования комплекса между ферредоксином и ФНР [Martinez-Julvez et al., 1998a]. Модельная константа скорости хорошо согласуется с экспериментальной. Для других незначительно влияющих на скорость реакции мутаций ФНР, Arg264Glu, Lys294Glu и Lys138Glu, также было показано качественное совпадение экспериментальных и модельных констант второго порядка. Соответствующие аминокислотные остатки лежат в области отрицательного потенциала, то есть добавление в этой области еще одного отрицательного заряда не сильно влияет на общее распределение потенциала.