Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1 Общие сведения о микротрубочках 11
1.2 Строение и свойства микротрубочек
1.2.1 Cтруктура микротрубочек. 12
1.2.2 Динамическая нестабильность 15
1.2.3 Феномен «старения» микротрубочек 17
1.2.4 Размер слоя ГТФ-димеров на конце микротрубочки 21
1.2.5 Структурные данные 26
1.3 Математическое моделирование микротрубочки 27
1.3.1 Общие принципы моделирования микротрубочки 27
1.3.2 Молекулярно-кинетические модели 29
1.3.3 Кинетико-механические модели 35
1.3.4 Механические модели. Статическое моделирование и метод Метрополиса Монте-Карло 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы 42
2.1 Описание модели 42
2.1.1 Типы взаимодействий в решетке микротрубочки 42
2.1.2 Продольные и поперечные взаимодействия 42
2.1.3 Изгибные взаимодействия. 44
2.1.4 Нахождение полной энергии системы 45
2.1.5 Вычисление градиента энергии 45
2.2 Алгоритм вычислений 46
2.2.1 Метод броуновской динамики 46
2.3 Определение параметров модели 51
2.4 Обработка результатов вычислений
2.4.1 Нахождение скоростей роста и разборки микротрубочки 54
2.4.2 Нахождение времени катастрофы 54
2.4.3 Переход от ускоренной к реалистичной константе гидролиза
2.5 Численная характеристика конфигурации конца микротрубочки 56
2.6 Упрощенная модель эволюции микротрубочки 59
ГЛАВА 3. Результаты 60
3.1 Сравнение результатов моделирования с имеющимися экспериментальными данными 60
3.2 Феномен «старения» в модели 63
3.2.1 Неэкспоненциальное распределение времен жизни микротрубочек 63
3.3 Существующие в литературе гипотезы, направленные на объяснение
«старения» 67
3.3.1 Модель накопления необратимых дефектов 67
3.3.2 Отсутствие медленных изменений конформации конца микротрубочки 70 3.4 Влияние конфигурации конца микротрубочки на ее стабильность 74
3.4.1 Метастабильное состояние микротрубочки в отсутствии ГТФ-колпачка 74
3.4.2 Влияние искривленных олигомеров на переход к катастрофе 78
3.4.3 Связь между процессом «старения» и накоплением искривленных протофиламентов 81
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 85
4.1 Броуновская динамика в моделировании микротрубочки 85
4.2 Катастрофы как результат флуктуаций в состоянии конца микротрубочки 86
4.3 В основе механизма катастрофы лежат короткоживущие обратимые молекулярные события на конце микротрубочки 88
Заключение 93
Выводы 94
Благодарности 95
Список сокращений и условных обозначений 95
Список литературы 96
- Строение и свойства микротрубочек
- Продольные и поперечные взаимодействия
- Неэкспоненциальное распределение времен жизни микротрубочек
- основе механизма катастрофы лежат короткоживущие обратимые молекулярные события на конце микротрубочки
Введение к работе
Актуальность темы. Микротрубочки – это клеточные филаменты, состоящие из белка тубулина. Они присутствуют в большинстве типов клеток. Энергия, запасенная в процессе роста в виде механического напряжения в стенке микротрубочки, используется для разделения и перемещения хромосом в митозе. Во время интерфазы микротрубочки необходимы для внутриклеточного транспорта, используются в нейронах и аксонемах жгутиковых. Механические упругие свойства микротрубочки нужны для организации цитоплазматического скелета и поддержания позиции ядра и органелл. Микротрубочки обладают свойством динамической нестабильности – способностью спонтанно переключаться между фазами медленного роста и быстрого укорочения. Переход от роста к разборке принято называть катастрофой, а обратный переход от разборки к полимеризации – спасением. Динамическая нестабильность микротрубочек крайне важна для целого ряда клеточных функций. Например, для работы веретена деления, так как позволяет концам попеременно растущих и укорачивающихся микротрубочек эффективно обследовать пространство внутри клетки и таким образом прикрепляться к хромосомам. Это свойство также необходимо для быстрой реорганизации цитоскелета движущейся клетки. Важный аспект динамической нестабильности микротрубочек – увеличение частоты катастроф с увеличением времени роста, – получил название «старение». Динамическая нестабильность была открыта три десятилетия назад, но все еще непонятно, какие молекулярные механизмы лежат в основе этого процесса. Также остается невыясненным, какие изменения в микротрубочке отвечают за процесс «старения».
Цель и задачи исследования
Цель работы - создание молекулярно-динамической модели микротрубочки и анализ с ее помощью механизма катастрофы и процесса «старения» микротрубочки.
Задачи исследования:
1. Построить новую модель микротрубочки, основанную на молекулярно-
механическом алгоритме броуновской динамики и включающую
присоединение ГТФ-димеров тубулина, гидролиз ГТФ, разрыв связей между субъединицами под действием тепловых флуктуаций.
-
Проверить возможность воспроизведения с помощью этой модели в рамках одного набора параметров основных экспериментальных данных, характеризующих микротрубочку, включая феномен «старения» микротрубочки.
-
Предложить на молекулярном уровне объяснение механизмов возникновения катастрофы и «старения» микротрубочки.
Научная новизна
-
Была разработана принципиально новая молекулярно-механическая модель микротрубочки, включающая присоединение субъединиц из раствора, гидролиз ГТФ, разрыв связей и диссоциацию субъединиц.
-
Впервые описание взаимодействие субъединиц и разрыв связей в модели определяется решением уравнения броуновской динамики и происходит под действием термодинамических флуктуаций и напряжений в стенке микротрубочки. Это значит, что подобное рассмотрение динамики данного полимера впервые позволяет одновременно учесть всевозможное многообразие возникающих конфигураций на конце растущей и укорачивающейся микротрубочки и силовые взаимодействия между субъединицами.
-
С помощью разработанной модели были проанализированы существующие гипотезы молекулярного механизма возникновения катастроф: медленно нарастающее увеличение заостренности конца микротрубочки и возникновение необратимых дефектов в процессе роста полимера.
-
Было изучено влияние отгибающихся протофиламентов на конце микротрубочки на ее стабильность. Впервые была проанализирована связь между отсутствием отгибающихся протофиламентов и возникновением временно стабильного состояния микротрубочки.
-
С помощью упрощенной кинетической модели была исследована возможность описания «старения» микротрубочки как обратимого перехода между множественными состояниями.
Научно-практическая значимость работы
Понимание механизма динамической нестабильности микротрубочки и в частности возникновения катастроф является одним из ключевых условий понимания функционирования митотического веретена деления. Созданная нами модель является принципиально новым шагом в описании динамической нестабильности микротрубочки. Эта модель является основой для будущего изучения механизма влияния микротрубочко-связывающих белков и низкомолекулярных веществ на частоту возникновения катастроф. Благодаря явному учету силовых взаимодействий внутри микротрубочки, эта модель может служить для дальнейшего изучения взаимодействия динамической микротрубочки с кинетохором и процесса митотического деления клетки. Понимание же процессов, происходящих во время митоза, может помочь в понимании причин их нарушения в патологически измененных клетках, например раковых, и служить основой для разработки новых методик лечения.
Положения, выносимые на защиту
-
Построена новая молекулярно-механическая модель микротрубочки с использованием формализма броуновской динамики, впервые одновременно включающая в себя полимеризацию, гидролиз, тепловые флуктуации и способность воспроизведения катастроф.
-
С помощью полученной математической модели были впервые непротиворечиво описаны основные свойства микротрубочек в рамках одного набора параметров, включая феномен «старения» микротрубочек.
-
Было продемонстрировано, что феномен «старения» микротрубочек может быть объяснен появлением обратимых изменений с характерным временем жизни в 100 и более раз меньшим времени возникновения катастроф.
-
Было показано, что образование отгибающихся протофиламентов на конце микротрубочки может являться дестабилизирующим молекулярным явлением, лежащим в основе катастроф и «старения» микротрубочки.
Личный вклад диссертанта
Компьютерный алгоритм, реализующий динамику микротрубочки, был создан автором лично.
Все вычисления на суперкомпьютерном комплексе были сделаны автором лично.
Калибровка потенциалов молекулярно-механической модели сделана автором лично.
Верификация результатов молекулярно-механической модели проведена автором лично.
Обработка результатов вычислений проведена автором лично.
Упрощенная кинетическая модель катастроф была создана совместно с Никитой Борисовичем Гудимчуком.
Анализ результатов проводился Атауллахановым Фазоилом Иноятовичем, автором, Никитой Борисовичем Гудимчуком, Екатериной Леонидовной Грищук.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных и региональных конференциях и школах:
-
“Gordon Research Conference on Muscle and Molecular Motors” (США, 2014),
-
“Международная летняя суперкомпьютерная академия” (Москва, июль 2014),
-
“ FEBS-EMBO Conference” (Париж, Франция, август 2014),
-
“Международная конференция по системной биологии”(г. Пущино, Московская область, октябрь 2014),
-
“10th European biophysics congress” (Дрезден, Германия, июль 2015, приз за лучший доклад с постером).
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в
рецензируемых научных журналах, входящих в перечень ВАК и 5 публикаций в сборниках тезисов докладов и конференций.
Cтруктура диссертации. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 – обзора литературы, главы 2 – описания материалов и методов, главы 3 – результатов, главы 4 – обсуждения результатов), выводов, заключения, а также списка сокращений и библиографического указателя, включающего 127 источников.
Строение и свойства микротрубочек
Полярность микротрубочки также определяет направление движения таких моторных белков, как например кинезины [12], которые перемещаются в строго определенном направлении вдоль микротрубочки и используют для перемещения энергию гидролиза АТФ. Другое интересное структурное свойство микротрубочки – спиральность. Протофиламенты связаны друг с другом таким образом, что один виток по окружности микротрубочки происходит со сдвигом в 3 мономера (Рис. 3Б). Область между этими протофиламентами называется швом, на котором в решетке микротрубочки происходит поперечное взаимодействие между - и - мономерами [13].
Описанный тип решетки микротрубочки называется B-решетка, когда везде кроме шва поперечно взаимодействуют мономеры одного типа: -, -. В самых ранних работах однако предполагалось, что укладка димеров в стенке микротрубочки происходит по принципу А-решетки, когда поперечные взаимодействия во всей микротрубочке - и - [14], а также нет шва. Однако с помощью изображений высокого разрешения микротрубочек, покрытых моторными белками, было установлено, что микротрубочка имеет тип В-решетки со швом [15–18].
Рост микротрубочки происходит благодаря присоединению к ее концу молекул тубулина. Каждый мономер тубулина в присоединенном димере связан с молекулой ГТФ. Однако вскоре после присоединения молекула ГТФ, связанная с -мономером, гидролизуется и преобразуется в ГДФ [19,20], в то время как вторая молекула ГТФ в -тубулине никогда не испытывает гидролиз [21]. Димеры тубулина в растворе практически не обладают ГТФазной активностью [22]. Продольно связанные ГТФ-димеры (те, в которых оба нуклеотида – ГТФ) стремятся образовать прямую линейную структуру, в то время как ГДФ-димеры (содержащие ГДФ в -субъединице) имеют радиус кривизны 20 нм [23,24]. За счет постоянного присоединения ГТФ-димеров к концу микротрубочки и последующего их гидролиза происходит удлинение микротрубочки с сохранением на ее конце слоя димеров, не успевших еще гидролизовать молекулу ГТФ. Поскольку ГТФ-димеры стремятся принять прямую конформацию на растущем конце микротрубочки, этот опоясывающий трубочку слой не дает выгнуться наружу нижележащим ГДФ-димерам и таким образом предохраняет микротрубочку от разборки. Слой ГТФ-димеров на конце растущей микротрубочки принято называть ГТФ-колпачком [25]. 1.2.2 Динамическая нестабильность
При наблюдении за ростом микротрубочек было сделано важное открытие, что они могут спонтанно переключаться между фазами медленного роста и быстрой деполимеризации. Это свойство получило название «динамическая нестабильность» [26]. Удивительным является тот факт, что такие переключения происходят при постоянной концентрации тубулина и прочих неизменных экспериментальных условиях. Исторически сложилась следующая терминология: переход от медленного роста к укорочению принято называть «катастрофой», а обратный переход от укорочения к росту – «спасением» (Рис. 4).
Динамическая нестабильность энергетически очень затратна для клетки, так как непрерывно расходует энергию гидролиза ГТФ. Однако крайняя консервативность данного механизма среди живых существ предполагает его важное биологическое значение для клетки [25]. Например, во время митоза постоянный рост и укорочение микротрубочек веретена деления позволяет митотическому веретену эффективно исследовать пространство внутри клетки, находить и связываться с кинетохорами хромосом. Кроме того, во время деления важной задачей является абсолютно правильное разделение генетичекого материала: сестринские хроматиды каждой хромосомы должны быть разделены между новыми клетками. А для этого каждая хроматида должна быть прикреплена перед делением хромосомы к микротрубочкам только из одного полюса, иначе правильного деления не произойдет [27] и возникнувшая «ошибка» приведет к гибели клетки или образованию раковой клетки [2,3,28]. Для образования правильного закрепления микротрубочек с хромосомами используется динамическая нестабильность, в результате которой неправильно закрепленные микротрубочки испытывают катастрофу и затем начинают расти заново [27,29]. Другой пример – переключение микротрубочек между фазами роста и разборки во время движения клетки позволяет ей проводить быструю реорганизацию цитоскелета, в то время как в противном случае смена пространственной организации цитоскелета была бы очень медленной и проблематичной [30]. Рис. 4. Фазы динамической нестабильности микротрубочки. А. Схема переключения между ростом и укорочением (адаптирован из [4]). Б. График зависимости длины микротрубочки от времени иллюстрирует последовательно сменяющие друг друга фазы роста и укорочения микротрубочки. Два набора точек соответствуют относительным приращениям с двух концов микротрубочки. Наблюдение сделано методом микроскопии темного поля (рисунок адаптирован из Horio and Hotani, 1986 [9]).
На сегодняшний день нет четкого представления о том, каков молекулярный механизм катастроф и спасений микротрубочки. Однако известно, что ключевую роль в механизме динамической нестабильности играет способность тубулина гидролизовать связанную с ним молекулу ГТФ и испытывать при этом конформационные изменения [23,24]. Действительно, микротрубочки, полимеризованные в присутствии негидролизуемого аналога ГТФ, непрерывно растут и не испытывают катастроф [31]. Микротрубочка, составленная из ГДФ-димеров, является крайне нестабильной и терпит разборку. В пользу последнего утверждения говорят опыты с разрезанием микротрубочки сфокусированным ультрафиолетовым лазером или тонкой иглой [32,33], в которых удалялся ГТФ-колпачок и микротрубочки немедленно разбирались со стороны плюс-конца. Данные эксперименты привели к модели катастрофы как случайной потере стабилизирующего ГТФ-колпачка.
Микротрубочки выполняют в митозе ключевую роль по развитию силы, необходимой для перемещения хромосом [13,34–38]. Сила может развиваться не только во время разборки микротрубочки [37,39], но и во время полимеризации [40,41]. Эта способность микротрубочек необходима для функционирования веретена деления и всего процесса митоза в целом.
Катастрофы как одно из ключевых свойств микротрубочки интенсивно изучались экспериментально и теоретически в течение последних нескольких лет [9,26,42]. С помощью анализа времени и длины роста микротрубочки с момента начала фазы роста до момента наступления катастрофы было установлено, что вероятность перехода микротрубочки от роста к разборке увеличивается по мере роста микротрубочки [43]. То есть более «молодые» (для которых время с момента начала роста меньше) микротрубочки с меньшей вероятностью склонны испытать катастрофу, чем более «старые». Этот феномен был назван «старением»[44]. Микротрубочки выращивались в проточной камере и регистрировалось изменение их длины в зависимости от времени. Эксперимент был проведен с использованием флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения [45,46] и с помощью дифференциальной интерференционно-контрастной микроскопии (контраста Номарского). Обработка производилась с помощью построения специальных изображений – кимограмм. Для построения кимограммы брались изображения одной длины вдоль фиксированной линии, проходящей через наблюдаемую микротрубочку в различные моменты времени, захватывая участки поля в стороны от концов микротрубочки. Далее эти линии располагались одна под другой и формировали двумерную картину зависимости длины микротрубочки от времени. Поскольку микротрубочка до наступления катастрофы медленно растет, а потом очень быстро укорачивается, то типичная кимограмма одного события катастрофы будет иметь вид как на Рис. 5. Далее по таким кимограммам измерялись времена жизни микротрубочек – время с момента начала роста до наступления катастрофы.
Продольные и поперечные взаимодействия
Дальнейшие исследования динамики отдельных микротрубочек привели к появлению экспериментальных работ, в которых были попытки оценить размер ГТФ-колпачка и свойства полярности микротрубочки. Это в свою очередь привело к предположению о индуцированном механизме гидролиза [78–81]. Бейли и соавторами была предложена другая модель, с индуцированным правилом гидролиза, в которой ГТФ-тубулины находились строго лишь в терминальном слое независимо от концентрации тубулина в растворе (Рис. 12Б), а присоединение нового ГТФ-димера немедленно приводило к гидролизу ГТФ в димере, к которому он присоединился. Эта модель успешно описала опыты с разбавлением растворимого тубулина и слабую зависимость частот катастроф микротрубочек от концентрации тубулина.
Кинетические модели Хилла и Бейли однако имели один общий недостаток – в них не учитывалась конформация конца микротрубочки, а значит они не могли описать структурные данные, соответствующие различным фазам роста микротрубочки.
Попытка сделать качественный учет конфигурации конца была сделана в работе ВанБюрена 2002 года [87]. Эта модель является существенным шагом вперед по сравнению с предыдущими моделями и по сути стала переходной моделью к последующим механистическим способам описания динамики микротрубочки. Она уже содержит полностью современное представление о решетке микротрубочки – решетка Б типа, трехзаходная левозакрученная спираль. Каждой связи в данной модели сопоставлена энергия, зависящая от нуклеотидного состава димеров, участвующих во взаимодействии. То есть вероятность диссоциации димера зависит от того, гидролизован ли ГТФ в его составе, и от количества связей. При этом димер мог присоединяться к любому протофиламенту вне зависимости от того, приведет ли это к образованию поперечной связи (Рис. 12В).
Что интересно, данная модель не может описать динамику микротрубочки при введении правила индуцированного гидролиза ГТФ, так как при одиночном слое ГТФ-димеров на конце микротрубочки эта модель не описывает устойчивую фазу роста, и в результате ней необходимо использовать механизм случайного гидролиза. При этом константа гидролиза, откалиброванная по экспериментально измеренной частоте наступления катастроф [103], соответствовала размеру ГТФ-колпачка 55 димеров со стандартным отклонением 12 димеров, что находится в согласии с экспериментальными данными о размере ГТФ-колпачка [56,59,61,62].
Дополнительным шагом в понимании влияния структурных особенностей микротрубочки на ее динамику было то, что в работе ВанБюрена 2002 года [87] авторы попытались объяснить вклад изогнутых протофиламентов на конце микротрубочки в ее динамическую нестабильность. В расчетах было получено, что модель не описывает устойчивую фазу разборки. Вместо этого разбирающаяся микротрубочка быстро возвращается в состояние удлинения. Из этого было сделано предположение, что формирование раскрывающегося венчика на конце микротрубочки необходимо для поддержания фазы разборки. Поскольку растрескивающаяся микротрубочка имеет на конце закручивающиеся протофиламенты, то вновь присоединившиеся к ним ГТФ-димеры уже не будут оказывать стабилизирующее действие, так как не будут способны образовать поперечные связи (Рис. 13). Учесть напрямую механику образования раскрывающегося венчика в кинетической модели нельзя, поэтому было введено искусственное ограничение, уменьшающее стабилизирующие свойства терминальных ГТФ-димеров.
Влияние структурных изменений на конце микротрубочки на разборку. Слева – кинетическая модель, не учитывающая вклад отгибающихся протофиламентов при разборке микротрубочки. Справа – эффект образования венчика протофиламентов уменьшает стабилизирующие свойства ГТФ-димеров [87].
Дальнейшим усовершенствованием кинетического подхода к описанию микротрубочки было рассмотрение раздельного разрыва сначала поперечной, а потом продольной связи в работе Марголина 2012 года [76] (Рис. 12Г). Это правило дает возможность описания различия в структурах растущего и укорачивающегося конца микротрубочки.
Таким образом, от первых моделей Хилла до современных моделей изменялось понимание геометрии микротрубочки, правил присоединения и отсоединения димеров, правил гидролиза.
Дальнейшее развитие кинетических подходов возможно в кооперировании их с более сложными механическими моделями, что позволит упростить и ускорить процедуру расчетов, основываясь на извлеченных из механических моделей константах.
Одной из первых работ, описывающих механику микротрубочки на уровне взаимодействия отдельных димеров, была модель ВанБюрена 2005 года [42,88], по сути усовершенствование предыдущей работы этой же группы – ВанБюрена 2002 года [87]. В ней поперечные и продольные взаимодействия между димерами описывались с помощью квадратичных потенциалов Гука, которые при некотором заданном значении расстояния переходили в константу, исходя из значения максимальной по модулю энергии связи для данного взаимодействия.
Каждый мономер имеет три независимых координаты: два угла поворота и , а также длина D. Углы и задают равновесное ненапряженное на изгиб направление вектора мономера (Рис. 14). Угол соответствует изгибанию наружу протофиламента таким образом, что для закручивающихся на конце микротрубочки ГДФ-димеров =22, а для прямых ГТФ-протофиламентов =0. Равновесный угол для обоих состояний 0.
Неэкспоненциальное распределение времен жизни микротрубочек
Стохастические переходы микротрубочки от роста к укорочению достаточно редки: 0,001-0,005 с-1 [103,44]. Даже с использованием суперкомпьютеров и параллельного программирования на сегодняшний день не представляется возможным исследовать поведение молекулярно-динамической модели на достаточно больших промежутках времени, чтобы наблюдать катастрофы. Для того, чтобы преодолеть это техническое ограничение, было ускорено наступление таких событий в модели путем увеличения скорости гидролиза ГТФ Khydrol. В случае, когда этот параметр был увеличен в 6-18 раз, катастрофы в модели наблюдались на временах, уже доступных для вычислений (Рис. 26). Конфигурации микротрубочки с момента начала роста (0 с) до наступления катастрофы (7,5 с) и резкого укорочения. Зеленым цветом показаны ГДФ-димеры, светло-красным и коричневым – ГТФ. Бордовый участок микротрубочки внизу показывает стабильную ГТФ-негидролизуемую затравку. Концентрация тубулина 10 мкМ, константа гидролиза 9,0 с-1. Вначале микротрубочка растет с преимущественно тупым концом и время от времени появляются отгибающиеся протофиламенты. Когда их становится 10-13, наступает катастрофа и микротрубочка переходит в состояние укорочения, в 10 раз более быстрого, чем рост.
Времена жизни микротрубочки – это время с момента начала фазы роста до наступления катастрофы. Полученные с помощью ускоренных констант гидролиза времена жизни были затем пересчитаны для реалистичной константы путем нормировки (см. параграф 2.4.3 и Рис. 19). Подобный пересчет был основан на том свойстве, что частота катастроф в модели обратно пропорциональна скорости гидролиза на исследуемом диапазоне времен (Рис. 27А). Более того, нормированные распределения времен жизни микротрубочки, полученные с различными константами гидролиза, совпадали при наложении (Рис. 19В). Б.
Время жизни микротрубочки (среднее ± стандартное отклонение) в зависимости от константы гидролиза Khydrol. Сплошная линия – аппроксимация гиперболой. График построен на основании N = 551 события катастрофы. Для анализа катастроф было использовано значение Khydrol = 9 с-1. Б. Зависимость частоты катастроф от концентрации растворимого тубулина (среднее ± ошибка среднего, N=232). Для сравнения с экспериментальными данными времена жизни микротрубочки были перенормированы (см. параграф 2.4.3).
С использованием данного подхода было обнаружено, что частоты катастроф в модели зависели в незначительной степени от концентрации тубулина, что находится в соответствии с большей частью экспериментальных данных (Рис. 27Б).
Делая расчеты с константой гидролиза Khydrol = 9 с-1, мы зарегистрировали в общей сложности 113 событий катастроф и соответствующие им времена жизни микротрубочек, которые затем были пересчитаны для реалистичной константы гидролиза. Удивительным результатом было то, что в данной модели распределения времен жизни микротрубочки были не экспоненциальными, а имели четко выраженные максимумы, отстоящие от нуля (Рис. 28A). Распределение времен жизни микротрубочки в модели при концентрации тубулина 10 мкМ, N=113. Б. Зависимость частоты катастроф от времени для 10 мкМ тубулина. Экспериментальные значения взяты из [123]. Значения на графике (и теоретические, и экспериментальные) были посчитаны по формуле , где – интегральная функция распределения времени жизни микротрубочки, а – дифференциальная функция распределения. Стандартные отклонения теоретических значений на графике были оценены методом «bootstrapping» [124,125], в котором из набора данных в распределении делается n выборок и оценивается стандартное отклонение для каждого диапазона (бина) гистограммы (n = 100).
Частота катастроф возрастала со временем с характерным временным параметром 160 секунд, совпадая с экспериментальными данными (Рис. 28Б).
В модели увеличение концентрации тубулина имело больший эффект на распределение длин микротрубочки перед катастрофой, чем на времена жизни (Рис. 29), как и было показано в эксперименте [44].
Таким образом, динамика микротрубочек в расчетах описывает экспериментальные данные по частотам катастроф и их концентрационным зависимостям.
Одна из существующих моделей, пытающаяся объяснить процесс старения, постулирует необратимое накопление изменений в стенке микротрубочки, приводящее к постепенной дестабилизации с каждым новым таким изменением или «дефектом». При этом дефекты согласно этому предположению необратимы: однажды возникнув, они уже не исчезают до самой катастрофы (Рис. 8А, [48]). Чтобы ответить на вопрос, возникают ли подобные дефекты в стенке микротрубочки в модели, были визуально исследованы конфигурации микротрубочек и никаких видимых отклонений либо накапливающихся изменений обнаружено не было. Те полимеры, которые испытывали катастрофы, имели конфигурации стенки микротрубочек визуально не отличающиеся от стабильно растущих микротрубочек, не было обнаружено ни пропущенных в стенке димеров, ни каких-либо других отклонений. В дополнение к визуальному анализу мы сделали серию расчетов, в которых динамика рассчитывалась только для фиксированного количества слоев димеров на самом конце растущего полимера. Эти слои начинали отсчитываться в направлении удаления от конца микротрубочки, начиная от ближайшего к концу слоя, не содержащего разорванных поперечных связей. Те же димеры, которые были ниже этих слоев, были «неактивны» и не получали ни тепловых приращений, ни изменений в координатах вследствие взаимодействия с другими димерами в микротрубочке. По мере роста микротрубочки окно «активных» димеров смещалось вслед за концом удлиняющегося полимера (Рис. ЗОА).
Схематическое изображение схемы расчета, при котором различное количество слоев димеров микротрубочки было исключено из динамики (полупрозрачная часть микротрубочки). Количество слоев отмерялось от ближайшего к концу слоя, не содержащего разорванных поперечных связей, при этом все димеры над этим слоем были подвижны. Б. Параметры динамической нестабильности при различных значениях количества слоев подвижных димеров. Каждая колонка отображает среднее значение ± ошибка среднего, полученные на основании 9-14 полимеризующихся микротрубочек, 7-16 деполимеризующихся и 53-70 микротрубочек, испытавших катастрофу.
основе механизма катастрофы лежат короткоживущие обратимые молекулярные события на конце микротрубочки
В представленной модели микротрубочки демонстрируют феномен «старения» – медленного увеличения частоты катастроф от времени, так же, как это наблюдается в эксперименте [43,44]. При анализе модели было выявлено, что «старение» не обусловлено ни накоплением необратимых дефектов, ни нарастающим изменением конфигурации на протяжении всего времени роста микротрубочки. Также анализ показал, что катастрофа в модели является результатом стохастического обратимого (а не детерменированного) процесса: действительно, микротрубочки при повторении расчета с момента, кода они ранее испытали катастрофу, вновь переходят к укорочению лишь в 90% случаев (Рис. 31А). Данные результаты создают некий кажущийся парадокс: конец микротрубочки как будто имеет «память» о предыдущем состоянии, и эта память длится несколько минут (Рис. 28), в то время как характерные времена элементарных процессов, связанных с динамикой микротрубочки, значительно короче. Например, частота обмена субъединиц на конце микротрубочки как в модели, так и в эксперименте, имеет характерный временной масштаб порядка миллисекунды [103,44]. Тот же по порядку величины временной масштаб соответствует времени разрыва связи между молекулами тубулина. Далее, хотя время гидролиза молекулы ГТФ в тубулине порядка секунд, оно все еще значительно быстрее, чем характерное время «старения» микротрубочки. Таким образом, в рассматриваемой системе все процессы протекают с характерным временем на 2 и более порядков быстрее, чем происходит «старение». Таким образом, причина медленного увеличения частоты катастроф со временем остается неясной.
В данной работе было показано, что более сложные комплексные события, состоящие из элементарных быстрых событий, могут иметь характерные времена, значительно превышающие по длительности времена элементарных событий. Это утверждение выглядит интуитивно неочевидным и для того, чтобы его проиллюстрировать, была создана сильно упрощенная модель катастрофы микротрубочки.
В более простой схематической модели микротрубочка может обратимо переходить между N состояниями, где начало расчета соответствует состоянию 1 и катастрофа происходит по достижении состояния с максимально возможным номером N (Рис. 45А, 2.6 Упрощенная модель эволюции микротрубочки).
Экспериментальное распределение времени жизни микротрубочек [44] и аппроксимации с помощью упрощенной кинетической схемы с 3 наборами параметров. Бесконечно большое время обратного перехода для N=3 состояний соответствует гипотезе о трех необратимых дефектах (Рис. 8А). Для N 3 наилучшая аппроксимация достигается когда отношение tb/tf лежит в диапазоне 1.0 -1.3, то есть при обратимых событиях, исчезающих почти так же часто, как они возникают.
Каждый переход от состояния n к состоянию n+1 добавляет некое свойство, которое дестабилизирует микротрубочку. Когда в данной схеме есть всего один возможный переход и N = 1, катастрофа является процессом, происходящим за один шаг или, другими словами, одностадийным процессом, а распределение времен жизни микротрубочки имеет экспоненциальное распределение. Когда N = 3 и время обратного перехода бесконечно большое, данная схема дает результат, соответствующий предложенной ранее модели 3 необратимых дефектов, «запоминаемых» в микротрубочке [48]. Распределение времен жизни микротрубочки при этом имеет форму распределения с пиком и аппроксимирует экспериментальное распределение (Рис. 45). Но подобная аппроксимация может быть получена и без условия необратимости событий и при различных N, при этом характерное время таких переходов будет сильно меньше характерного времени старения и будет убывать с увеличением N как 1/N2 (Рис. 46).
Время перехода tf как функция полного количества состояний N в системе, при котором аппроксимация простой моделью описывает экспериментальное распределение времени жизни микротрубочек (см. Рис. 45А-Б). Черная кривая – аппроксимация функцией Y=A/N2. Б. Кинетика изменения заселенности отдельных состояний в процессе эволюции системы, начиная с момента времени t=0 и состояния n=0 для параметров N=13, tf = 12.5 с, tb = 20с. Заселенность состояний n =8 – 12 медленно растет со временем.
Таким образом, неэкспоненциальное распределение времен жизни микротрубочки может быть объяснено множественными быстрыми обратимыми переходами, происходящими на конце микротрубочки. Хотя неочевидно как данные дестабилизирующие события можно описать в терминах единообразных простых переходов, но в рамках данной работы было показано, что частота образования в популяции растущих микротрубочек искривленных протофиламентов на конце полимеров возрастает с характерным временем, совпадающим с характерным временем увеличения частоты катастроф, то есть старением (Рис. 43).
Итак, увеличение количества искривленных протофиламентов предшествовало катастрофе, а кинетика частоты обнаружения в популяции микротрубочек полимеров с 10 и более искривленными протофиламентами на конце имеет кинетику как у зависимости частоты катастроф от времени. Поэтому мы предполагаем, что молекулярную основу процесса старения микротрубочки представляют связанные с образованием изогнутых протофиламентов короткоживущие обратимые изменения.
В заключение, наши результаты демонстрируют важность влияния конфигураций, связанных с образованием искривленных протофиламентов на конце микротрубочки на динамику исследуемого биополимера. Это исследование должно помочь анализу механизма действия различных белковых и низкомолекулярных веществ, которые влияют на динамическое поведение микротрубочки.
Согласно результатам данной работы, взаимодействующие с микротрубочкой белки, которые стабилизируют и увеличивают длину искривленных протофиламентов у растущих микротрубочек, должны способствовать возникновению катастрофы. При этом те воздействия, которые наоборот уменьшают время существования изогнутых олигомеров, должны уменьшать вероятность возникновения катастрофы. Далее, увеличение частоты ГТФ-гидролиза и как следствие увеличение частоты появления искривленных протофиламентов может иметь независимый дестабилизирующий эффект, как было предложено в недавнем исследовании [127]. Таким образом, дальнейшее развитие молекулярно-динамических моделей микротрубочки будет способствовать детальному исследованию механизмов влияния низкомолекулярных соединений и белков на динамику микротрубочки. ЗАКЛЮЧЕНИЕ