Моделирование механизмов формирования пространственно-временных паттернов вазореактивности Неганова Анастасия Юрьевна

Содержание к диссертации

Введение

1 Методика эксперимента с использованием лазерной спекл-визуализации 21

1.1 Мониторинг ритмов в лазерных суррогатных и реальных спекл данных 22

1.1.1 Лазерная спекл-визуализация в мониторинге ритмической активности 22

1.1.2 Материалы и методы 23

1.1.3 Результаты 25

1.2 Мониторинг и анализ индивидуальных реакций сосудов сети сетчатки крысы с использованием лазерной спекл-визуализации 36

1.2.1 Материалы и методы 37

1.2.2 Анализ данных 38

1.3 Мониторинг и анализ динамических паттернов в сосудах сети сетчатки крысы с использованием лазерной спекл-визуализации 42

1.3.1 Материалы и методы 42

1.3.2 Анализ данных 43

1.4 Итоги по главе 45

2 Управление электрической активностью и пространственная синхрониза ция колебаний в клетках гладкой мускулатуры сосуда. Функциональные модели клеток гладкой мускулатуры (КГМ) сосудистой стенки 48

2.1 Математическое моделирование эндотелий-зависимой релаксации клетки глад кой мускулатуры 49

2.1.1 Математическая модель 49

2.1.2 Результаты 52

2.2 От возбудимости к спонтанным колебаниям: изучение вазомоции 54

2.2.1 Математическая модель 54

2.2.2 Результаты 58

2.3 Обсуждение результатов и выводы по главе 64

3 Функциональные модели эндотелиальных клеточных структур сосудистой стенки. Распространяющаяся вазодилатация 68

3.1 Рабочая гипотеза модельного исследования

3.2 Минималистичный вариант математической модели КЭ 70

3.3 Теоретический анализ условий реализации бистабильности 72

3.4 Передача гиперполяризующего импульса вдоль по цепочке КЭ 77

3.5 Расширенная модель КЭ 81

3.6 Результаты вычислительного эксперимента 83

3.7 Итоги изучения гиперполяризационного механизма 86

3.8 Моделирование деполяризационного механизма 87

3.9 Модель КЭ согласно деполяризационному механизму 88

3.10 Результаты вычислительного эксперимента

3.10.1 Реакция модели одиночной КЭ на деполяризацию 93

3.10.2 Распространение сигнала по бифуркации сосудов 96

3.11 Обсуждение результатов и выводы по главе 98

4 Динамические паттерны вазореактивности микроциркуляторнои сети (эксперимент и моделирование) 101

4.1 Лазерный спекл анализ сосудистой динамики сетчатки 102

4.1.1 Ответы сосудистой сети 102

4.2 Вазомоция в сетчатке крысы, оцененная при помощи лазерной спекл визуали

4.2.1 Валидация ритмической активности 106

4.2.2 Детектирование вазомоторной активности 109

4.3 Динамические характеристики микрососудистых сетей с градиентом миоген ного ответа 113

4.3.1 Математическая модель 114

4.3.2 Свойства сосудистой сети: результаты вычислительных экспериментов 121

4.4 Обсуждение результатов и выводы по главе 128

Заключение 134

4.4.1 Заключение 134

Список литературы 1

• Мониторинг и анализ индивидуальных реакций сосудов сети сетчатки крысы с использованием лазерной спекл-визуализации
• От возбудимости к спонтанным колебаниям: изучение вазомоции
• Результаты вычислительного эксперимента
• Вазомоция в сетчатке крысы, оцененная при помощи лазерной спекл визуали

Введение к работе

Актуальность темы.

Функционирование сосудистой системы опосредовано потоком крови по васкулярной сети, который, в свою очередь, формируют два основных фактора: (1) собственно поток крови, ее накачка сердцем и протекание по всем разделам сосудов, и (2) - текущие свойства этих сосудов, точнее - текущие изменения сосудистого тонуса, которые в значительной степени определяют физиологические реакции организма как на локальном, так и, через нейрогенный и гуморальный механизмы регуляции, на системном уровне (А. Камкин, 2004). Данное диссертационное исследование сфокусировано на втором факторе, а именно - на анализе и моделировании типичных динамических паттернов изменения состояния сосудистой стенки.

В локальном представлении, динамика состояния сосуда проявляет себя как изменение сосудистого тонуса, который играет роль универсального ответа на различные регуляторные факторы. В то же время, различия в механизмах активации и степени вовлеченности клеток двух основных "активных "клеточных слоев сосуда - эндотелия и гладкой мускулатуры - могут привести и приводят к различным пространственным картинам вазореак-тивности в ответ на различные вазоконстрикторные и вазодилатационные стимулы. Показательный пример - эффект функциональной гиперемии, когда локальная дилатация или констрикция могут распространяться на значительное расстояние вверх по потоку от вызвавшего их стимула (B.R. Duling, 1970).

По современным представлениям, изменение состояния сосудистой стенки есть результат кооперативного действия двух активных и одного пассивного слоев стенки сосуда, включая процессы внутри- и межслоевой синхронизации электрической активности. Известен эффект пространственной синхронизации активности клеток гладкой мускулатуры (КГМ) сосудов, как внутриклеточной, так и межклеточной (J.C. Brings Jacobsen, 2007; М. Bindschadler, 2001). Показано, что клетки эндотелия образуют электрический синтициум, обеспечивающий хорошее проведение электрического сигнала вдоль сосуда.

Важно отметить, что на уровне резистивных сосудов, имеющих относительно небольшие размеры, адекватным модельным представлением являются скорее дискретные массивы активных единиц, нежели непрерывная активная среда. Например, при длине отдельно взятой клетки эндотелиального слоя артериального сосуда порядка 100 микрон и коэффициента их перекрытия по длине около 50%, получаем всего лишь 20 клеток на 1 миллиметр

длины сосуда, то есть, от 3-4 до 30 клеток на одну артериолу, при ее длине от 0.25 до 1.5 мм (R. Steiner, 1992).

За последние десятилетия накоплено значительное количество экспериментальных данных по различным аспектам как внутриклеточной динамики в слоях сосудистой стенки, так и по взаимодействию между этими слоями. Показано, что связь между клетками гладкой мускулатуры и клетками эндотелия примерно в 600 раз сильнее, чем между собой. Выявлены эффекты кооперативной динамики (синхронизации) клеточной активности, формирующие реакцию сегмента сосуда как целого. Однако, комплексное понимание закономерностей функционирования такой системы как ансамбля взаимодействующих дискретных активных элементов, находится лишь в стадии формирования. В еще большей степени это относится к эффектам, вовлекающим значительные фрагменты васкулярного дерева.

Помимо экспериментального изучения сетей микроциркуляции, для выяснения всего комплекса взаимодействий механизмов внутри сосудистой стенки необходимы модельные исследования особенностей работы конкретных механизмов, влияющих на тонус сосудов. В последние десятилетия математическое моделирование стало мощным инструментом для достижения более глубокого понимания физиологических процессов, определяющих регуляцию кровотока в сосудистых сетях. Комбинированное описание механики сосудистой стенки и структуры сосудистой сети, делающее возможным последующее моделирование системы, позволяет выявить динамические свойства таких сетей, что гораздо более значимо, чем просто характеристика их равновесных состояний.

Все вышесказанное обуславливает высокую актуальность научной задачи, заключающейся в разработке и исследовании вычислительных моделей, адекватно отражающих основные динамические характеристики функционирования локальных и системных механизмов управления сосудистым тонусом. Будучи максимально упрощенными, но при сохранении функционального соответствия физиологическим механизмам, такие модели призваны обеспечить базу для количественного моделирования относительно крупных сегментов сосудистой системы и обеспечить возможность предсказательного вычислительного эксперимента как «мостика», связывающего измеримые в эксперименте характеристики авторегуляции кровотока с одной стороны, и изменения в функционировании клеточных слоев стенки сосуда, с другой. В русле такого подхода и выполнено данное диссертационное исследование.

Разработанность темы

Известно, что широкий диапазон факторов влияет на тонус сосудистой стенки. К числу этих факторов, относится вторичный мессенджер /Рзэ

рост концентрации которого ведет к сокращению клеток гладкой мускулатуры (J. Keener, 1998). Другим фактором, влиящим на тонус сосуда, согласно имеющимся экспериментальным данным, является циклический гуанозин монофосфат (цГМФ), который оказывает разнонаправленные действия на процессы происходящие в КГМ. Два основных результата его действия это: 1) понижение концентрации Са²⁺ во внутриклеточной среде, 2) снижение чувствительности к Са²⁺ сократительного механизма. Оба эти эффекта в конечном итоге приводят к расслаблению КГМ (J. Yang, 2005; J.A. Carvajal, 2000; Т.М. Lincoln, 2001; К.A. Lucas, 2000). Наряду с экспериментальным изучением, взаимодействие внутриклеточных механизмов, оказывающих влияние на тонус сусудов, пытаются понять с помощью математического моделирования (J. Keener, 1998; G. Houart, 1999).

Вазомоция - ритмические изменения диаметра (и тонуса) небольших кровеносных сосудов, так же часто становится объектом исследований. Такой тип пространственной синхронизации кальциевых колебаний, ее природа и характеристики, неоднократно становились объектом экспериментальных (A. Colantuoni, 1984; К. Fujii, 1990; J.С. Jacobsen, 2007; Н. Gustafsson, 1993; Н. Peng, 2001) и теоретических работ (Т. Hofer, 2001; J. Sneyd, 1995; М. Bindschadler, 2001; М. Koenigsberger, 2005; D. Parthimos, 2007; J.С. Jacobsen, 2007). Основные результаты исследования вазомоции были суммированы в обзорных статьях (С. Aalkaer 2005, 2011).

Известно, что большая часть процессов происходящих в КГМ, так или иначе связана с функционированием слоя клеток эндотелия, выстилающего сосудистую стенку изнутри. К числу таких процессов относится распространяющаяся вазодилатация (РВД) -изменения в диаметре кровеносного сосуда, которые распространяются как вверх, так и вниз по направлению тока крови, и могут достигать других сосудов (F. Gustafsson, 1999; P. Bagher, 2011; С.Е. Hill, 2012; S.S. Segal, 1991; G.G. Emerson, 2001,2002; С. de Wit, 2000; X.F. Figueroa, 2003,2007; K.A. Dora, 2003). Первые наблюдения такого удаленного действия локальной стимуляции сосудов были сделаны около 90 лет назад, (A. Krogh, 1922), однако детальное изучение эффекта РВД началось значительно позднее, в 1970-х годах (B.R. Duling, 1970). РВД, как полагают, играет центральную роль в обеспечении эффективности локальной регуляции кровотока (P. Bagher, 2011). Результаты экспериментальных исследований указывают на электрический механизм явления РВД (G.G. Emerson, 2002; R.J. Stevens, 2000; Т. Tsuchiya, 1990). Сам механизм РВД до сих пор остается не до конца изученым. Вопрос, касающийся возможных механизмов формирования РВД был затронут в ряде экспериментальных и обзорных работ (X.F. Figueroa, 2007; R.J. Rivers, 1997; G.J. Crane, 2004; С.Е. Hill, 2012). Методы ма-

тематического моделирования также были неоднократно использованы для исследования возможных механизмов РВД (G.D. Hirst, 1978; G.J. Crane, 2004; Н.К. Diep, 2005; В.О. Hald, 2012). Однако, эти модельные исследования не дали к настоящему моменту ясного ответа на вопрос о возможных механизмах регенеративного характера РВД.

Для полноценного изучения результата взаимодействия сложного комплекса внутри- и межклеточных механизмов, необходим переход от экспериментальных и теоретических методов исследования клеток и небольших сегментов сосудов к исследованию целых сетей сосудов. Одним из наиболее привлекательных объектов исследования в данном случае становится сеть микроциркуляции сетчатки.

Лазерная спекл визуализация (laser speckle imaging, LSI) может быть успешно применена к множеству биомедицинских систем (D.A. Boas, 2010, D. Briers, 2013; К. Basak, 2012; Т. Durduran, 2004; А.К. Dunn, 2005; A.R. Brazlie, 2014; D.D. Postnov, 2015). Этот метод имеет ярко выраженное преимущество перед другими техниками для мониторинга кровотока, т.к. этот метод является несканирующим, относится к классу методов полного поля, при этом обладает высоким пространственным и временным разрешением. С момента первого применения этого метода к изучению сетчатки (A.F. Fercher, 1981), были исследованы различные аспекты кровотока сетчатки и офтальмологические проблемы (A.I. Srienc, 2010; J. Flammer, 2002; G. Watanabe, 2008; Т. Sugiyama, 2010).

Было показано, что миогенный ответ (P. Jeppesen, 2007) и вазомоция (A. Hessellund 2003, 2006) вовлечены в контроль кровотока в сетчатке. Множество работ подтвердили, что нарушение вазомоции играет особую роль в патогенезе различных заболеваний, таких как хроническая венозная недостаточность (М. Stiicker, 2003), сахарный диабет (К.В. Stansberry, 1996), а также глазных заболеваний как диабетическая ретинопатия (Т. Век, 2013), а также макулопатия (A. Colantuoni, 1984). Насколько известно автору, на данный момент нет in vivo исследований спонтанной и индуцированной вазомоции цельной сосудистой сети сетчатки крысы.

Было опубликовано множество математических реализаций миоген-ного ответа (J. Yang, 2003; В.Е. Carlson, 2005; J.С. Jacobsen, 2008) и его градиента в сосудистых сетях (A.J. Cornelissen, 2000). Тем не менее, насколько нам известно, динамическое поведение на коротких временах сосудистой сети сетчатки с градиентом миогенного ответа не становилось прежде объектом исследований.

Подводя итоги приведенного выше краткого обзора степени разработанности темы диссертационного исследования, к настоящему момен-

ту накоплено много важных экспериментальных фактов о локальных и пространственно-протяженных путях регуляции сосудистого тонуса, установлены основные закономерности. В то же время, налицо некоторое отставание в осмыслении этой суммы знаний в плане типичных динамических закономерностей и их связи с физиологическими механизмами. Это - именно то, что могут дать модельные исследования различного уровня, от одиночных клеток до крупных фрагментов васкулярных сетей.

Целью диссертационной работы являлось теоретическое

и модельное исследование динамических механизмов формирования пространственно-временных паттернов вазореактивности.

В контексте данной работы,

_ _ПОд теоретическим исследованием понимается формулирование и верификация гипотез, объясняющих экспериментально обнаруженные (в т.ч. другими авторами) типы реакции сосудов на языке теории динамических систем (на основе понятий об обратных связях, автоколебаниях, синхронизации, возбудимой динамике и мультистабильности);

- под модельным исследованием понимается проведение вычислительных экспериментов с использованием разработанных математических моделей с целью проверки и уточнения гипотезы, на основе которой разрабатывалась модель.

Для достижения поставленной цели, в ходе диссертационного исследования решались следующие задачи:

1. Разработка и верификация функциональных математических моделей основных процессов, отвечающих за формирование пространственно -временных паттернов авторегуляции сосудистого тонуса.

2. Исследование динамических характеристик эффекта внутриклеточной и межклеточной пространственной синхронизации кальциевой динамики в клетках гладкой мускулатуры сосудистой стенки.

3. Исследование динамических характеристик и механизмов явления эндотелий-опосредованной распростараняющейся вазодилатации.

4. Разработка экспериментальных и модельных методов анализа динамики регуляции кровотока в ретинальной сети микроциркуляции.

Методология работы

Методология данного диссертационного исследования заключалась, главным образом, в разработке как функциональных, так и количественных математических моделей, с помощью которых, в ходе проведения различных вычислительных экспериментов, исследовались конкретные физиологические механизмы или явления, характерные для сетей кровеносных сосудов. Анализ полученных результатов и закономерностей выявил необходи-

мость изучения динамических свойств паттернов вазореактивности при помощи экспериментов на живых объектах, а также необходимость в расширении математических моделей отдельных клеток или небольших сегментов сосудов до модели сети сосудов.

Каждый этап диссертационного исследования, как и соответствующая ему глава диссертационной работы включали:

1) изучение доступной научной литературы в данной области и иссле-
довние степени изученности данного вопроса, постановка конкретной целей и
задач; 2) разработку функциональной или количественной модели, соответ
ствующей поставленным целям и задачам; 3) проведение вычислительных
экспериментов, изучение динамического поведения моделей и анализ полу
ченных результатов.

Для целенаправленного изучения динамических свойств паттернов вазореактивности в целой сосудистой сети живого объекта был проведен ряд физиологических экспериментов на сетчатке крысы. Таким образом, для проведения части диссертационного исследования, которому посвящена Глава 1 диссертационной работы, помимо пункта 1), были выполнены следующие этапы исследования:

2. Разработка протокола экспериментов, соответствующих поставленным задачам, непосредственное проведение серии экспериментов на животных. Изучение динамических свойств паттернов вазореактивности сосудистой сети in vivo.

3. разработка количественной математической модели сети сосудов, с целью дополнительной интерпретации экспериментально полученных данных. Изучение динамического поведения модели и анализ результатов, полученных при проведении вычислительных экспериментов.

Научная новизна

Ряд результатов, полученных в ходе выполнения диссертационной работы, обладает существенной научной новизной. А именно:

1. Установлены динамические сценарии и типичные паттерны перехода к пространственно-синхронизованным внутриклеточным колебаниям концентрации кальция в присутствии и под воздействием флуктуации, включая режимы спонтанных переключений паттернов и режим кластерной синхронизации.

2. Показано, что наличие градиента концентрации циклического гуа-нозинмонофосфата в многоклеточной плоскостной структуре клеток гладкой мускулатуры сосуда приводит к генерации супра-клеточных волновых структур при сохранении режима цельноклеточных осцилляции в каждой отдельной клетке.

3. Выдвинута и обоснована гипотеза о бистабильном механизме без-декрементной передачи электрического импульса по эпдотелиальпому слою сосудистой стенки, что открывает возможность разработки нового подхода к пониманию явления распространяющейся вазодилатации.

4. В задаче о прохождении вазоактивного сигнала через бифуркацию сосудов, показана возможность градиентной активации (суммирование вкладов сосудов) за счет анизотропии эндотелпального слоя.

5. Экспериментально исследованы динамические паттерны вазореак-тивности сетчатки анестезированной крысы in vivo, в частности, детектирована спонтанная и индуцированная препаратами SNAP и U-46619 вазомоция, изучена вариабельность индивидуальных рекций сосудов целой сети на системное введение таких препаротов как ангиотензин II, ацетилхолин и изменение уровня общей анестезии.

6. В модельном исследовании сети сосудов сетчатки продемонстрирована возможная защитная роль градиента миогенного ответа, выявлена роль асимметричности структуры сети сосудов в регуляции кровотока.

Теоретическая и практическая значимость работы Теоретическая значимость выполненной работы заключается в том, что на основе модельной интерпретации экспериментальных фактов выдвинуты и обоснованы гипотезы о динамических механизмах основных процессов регуляции активности клеток гладкой мускулатуры и эндотелия артериальных сосудов, что обеспечивает связующее звено между детальными моделями клеточных механизмов регуляции с одной стороны, и генерализованными общефизическими моделями активных непрерывных и дискретных сред, с другой стороны. Как результат, облегчается "миграция"научных задач и методов исследования между указанными областями знания.

В целом, результаты диссертационного исследования вносят вклад в обоснование необходимости применения математических и экспериментальных методов к исследованию динамических паттернов в цельной микрососудистой сети, а не для изолированных сосудов, что, в частности, обусловлено установленной в ходе экспериментов вариабельностью как вазоактивных динамических паттернов присущих сосуду, так и реакции индивидуальных сосудов на системные стимулы.

Практическая значимость работы заключается в разработке набора вычислительно эффективных, физиологически адекватных математических моделей, облегчающих реализацию многомасштабного (от клетки к фрагментам микроциркуляторной сети) вычислительного эксперимента в целях предсказательного анализа клеточной динамики по данным оптических и иных методов регистрации параметров кровотока.

Положения и результаты, выносимые на защиту:

Положение 1

Модель возбудимой активной среды класса реакции-диффузии, дополненная глобальной переменной, обеспечивающей пространственную связь по типу среднего поля, адекватно воспроизводит определяющие характеристики явления перехода между режимом бегущих волн и режимом цельно-клеточных колебаний концентрации кальция в клетке гладкой мускулатуры сосудистой стенки. При этом, наличие флуктуации окружения способно индуцировать новый режим частично-цельно-клеточной синхронизации и спонтанные переходы между этим режимом и режимом бегущих волн.

Результат 1

Минимизированная математическая модель пространственной кальциевой динамики в одиночной клетке гладкой мускулатуры сосуда, воспроизводящая синхронизующий эффект ионных механизмов регуляции мембранного потенциала.

Положение 2

Гипотеза о бистабильном механизме передачи гиперполяризующего импульса по эндотелиальному слою сосудистой стенки адекватно объясняет пространственно-временные паттерны динамики, наблюдаемые при рапро-страняющейся вазодилатации.

Результат 2

Минимизированная количественная математическая модель электрической активности эндотелиального клеточного слоя, основанная на гипотезе об определяющей роли бистабильной динамики в механизме распространения вазодидатирующего стимула при функциональной гиперемии.

Положение 3

Индивидуальные сосуды ретинальной микроциркуляторной сети, происходящие из одной точки ветвления могут показывать разные по силе и характеру реакции на одно и то же системное воздействие сосудосужающими и сосудорасширяющими веществами, а также демонстрировать осциллирующие изменения относительной скорости кровотока в сосудах на разных частотах.

Результат 3

Математическая модель микрососудистой сети сетчатки, нацеленная на изучение роли градиента миогенного ответа в регулировании кровотока в микрососудистой сети сетчатки, включая генерацию топологии сети по экспериментальным данным, а также модельное описание механики сосудистой стенки.

Степень достоверности и апробация результатов: По результатам диссертационного исследования опубликованы 10 статей в российских и зарубежных журналах, в том числе 6 - в зарубежных научных журналах, индексируемых библиографическими базами данных "Web of Science "и/или "Scopus и журналах из списка ВАК, зарегистрировано 4 результата интеллектуальной деятельности (Программы ЭВМ). Результаты исследований по теме диссертации использованы в ходе выполнения НИР "Эндотелий"(проект при поддержке Минобрнауки, НИР 3.1340.2014/К, конкурсная часть госзадания) , а также были доложены в ходе ряда научных конференций в том числе: "Saratov Fall Meeting - SFM 2011, 2012, 2013, 2014"(г. Саратов), "Ежегодная всероссийская научная школа-семинар «Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине - 2011, 2012» "BMI-day 2014, 2015"(Копенгаген, Дания), а также студенческих конференциях и семинарах СГУ.

Личный вклад. Структура диссертационной работы, цели, а также конкретные задачи были сформулированы и поставлены автором диссертационной работы совместно с научным руководителем. Разработка математических моделей и анализ полученных результатов проводились автором совместно с соавторами соответствующих главам публикаций. Вычислительные эксперименты были выполнены непосредственно автором диссертационной работы. Протоколы экспериментов на сетчатке крысы были разработаны автором диссертационной работы совместно с соавторами публикаций по Главе 1. Серия экспериментов, а также анализ результатов полученных при помощи лазерной спекл-визуализации проводились совместно с к. ф.-м. н. Постновым

д.д.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из вводной части, четырех глав, заключения, списка сокращений и списка литературы. Объем работы составляет 146 страниц текста, включает 46 иллюстраций, 7 таблиц. В список литературы включено 153 источника.

Мониторинг и анализ индивидуальных реакций сосудов сети сетчатки крысы с использованием лазерной спекл-визуализации

Экспериментальные LSI данные с кровотоком почки крысы были предоставлены Н.-Х, Холстейн-Раслоу и Ольгой Сосновцевой из Университета Копенгагена. Физиологическая интерпретация, а также экперимент с животным описаны в [89]. Измерения были сделаны при использовании спекл контрастного визуализатора "moorFLPI"(Moor Instruments, Великобритания) при высоком пространственном разрешении. Сырые спекл данные были усреднены во временном домене по 25 кадрам для того, чтобы вычислить отдельный кадр со кроростью потока. Итоговые данные содержат 2640 кадров с разрешением 760 х 568 пикселей каждый. Итоговая частота выборки составила 1 кадр в секунду, при полном времени записи 44 минуты. Так как мы сфокусированы на частотном диапазоне ниже 0.03 Гц, такое значение частоты выборки дает более чем 30 точек на 1 период. Это означает, что временной домен усреднения сырых данных не ограничивает наши вычисления. Анализ данных

Данные могут быть рассмотрены как 3D массив и имеют форму d(x,y,l), где индексы х и у обозначают позицию пикселя внутри кадра, а / это дискретное время (номер кадра). Текущее время t = ті, где г это интервал временной выборки,

Общепринятое дискретное оконное преобразование Фурье (ОПФ или windowed Fourier transform, WTF) одномерных данных может быть описано следующим уравнением [90]: N-1 S{m,l) = {d{n)g{n-m)e п=0 2тг N ), где д(п — га) это окно Фурье. Так как мы используем квадратное окно g(t) = 1 [90], и поскольку на самом деле мы имеем двумерный массив одномерных оконных преобразований Фурье, Уравнение 1.1 принимает вид: {d{x,y,n)e- ), S(x,y,k,l) = (k+l)N-l Y Лт..1,.п\е-№ n=k-N где к обозначает номер окна, а N это номер точки в каждом окне. Текущие значения частоты вычисляются как / = 1/(2NT). Каждое значение к соответствует временному интервалу t Є (kNr,(k + l)iW). Так как экспериментальные данные являются результатом случайного процесса, в этой статье мы используем спектр мощности полученный из комплексного результата преобразования Фурье, как \S\2, где означает модуль комплексной величины.

Спектр мощности всех данных получен путем усреднения IS !2 по Nk окнам данных: Nk \S(x,y,l)\2 = — У \S(x,y,k,l)\2. (1.3) МкЇҐ0 Непрерывное Вейвлет преобразование (wavelet transform, WT) основанное на Вейвлете Морле используется в следующей форме: N-1 ,к-1л2 к-l ( 5 ) W(x,y,a,l J CI d{x,y,l)el2nh \а\ к=0 УА1 где / это номер образца, ко - параметр, а - параметр масштабирования. Как и выше, текущее время t = ті, в то время как частота может быть оценена как / « 1/ат для к 1. Подобно оконномуФурье преобразованию, Вейвлет спектр мощности вычисляется как Vl 2, Как Фурье, так и Вейвлет спектры мощности могут быть усреднены по какой-то части кадра или по всему кадру: №0М) = N х,уёА \S(x,y,k,l)\2,\W\2A(a,l) = N х,уёА \S(x,y,a,l)\2, :i.5) где А обозначает какою-то область меньшую или равную целому кадру, a N это число пикселей внутри А.

В данной статье мы используем пространственно-усредненные спектры, расчитанные по формулам 1,5, при этом локализация измерения обеспечивается выбором А в диапазоне от 1 до 431680. Таким образом, в тексте и в подписях к рисункам ниже мы опускаем нижний индекс А, но всегда указываем размер А в подписях к рисункам,

Обработка данных на графическом процессоре

Системы основанные на графических процессорах могут значительно ускорить обработку изображений. Тем не менее, конкретная реализация вычислительных схем может значительно влиять на итоговый результат, А именно, неоптимальная обработка массова данных может свести на нет преимущества параллельных вычислений, В рассматриваемом случае, традиционная организация LSI данных в виде последовательности кадров очень подходит для вычислений спекл контраста/потока в реальном времени, но не является оптимальной для анализа ритмов, так как требуется обмен данными между оперативной памятью компьютера и памятью графического устройства.

Для того чтобы избежать потерю производительности по выше изложенным причинам, мы помещаем все данные, которые должны быть обработаны в память устройства (6 Гб для NVIDIA Tesla С2075) один раз для каждого прогона программы 1,1, Затем, как пространственные, так и временные домены выбираются для анализа интерактивно и только результирующие данные поступают обратно в память компьютера.

В соответствии с нашими тестами произведенными на алгоритмах, что мы используем, вычисления на графическом устройстве используя такие устройства NVIDIA как GeForce Titan, GeForce 650М, Tesla C2075 обеспечивают более, чем 200-кратное ускорение в сравнении с вычислениями на центральном процессоре (1-ядерный) Intel Core І7-3970Х, Например, 1300 кадров размером 500 х 400 пикселей каждый может быть обработан простым (не самым быстрым) алгоритмом Вейвлет преобразования за 20 секунд,

В то время как применение оконного Фурье преобразования или Вейвлет преобразования к одномерным данным является простым, полное преобразование трехмерных LSI данных дает четырехмерный массив результатов, которые довольно трудно анализировать. Для того чтобы сохранить анализ достаточно простым, мы используем следующую схему:

От возбудимости к спонтанным колебаниям: изучение вазомоции

Эксперименты были проведены на Спрег-Доули крысах мужского пола в весом 270-330 г, поставленных фирмой Taconic (Лилле Скенсвед, Дания), Экспериментальный протокол был одобрен Датской Национальной Инспекцией по Экспериментам над животными (Danish National Animal Experiments Inspectorate), и был составлен в соответствии с руководством Американского Физиологического Общества (American Physiological Society).

ИК лазерный модуль (LDM785, 785 нм, 20 мВт, Thorlabs, Ньютон, Нью Джерси) был использован в качестве источника лазерного луча. Для того чтобы доставить лазерный луч в глаз крысы был использован эндоскоп (5 мм в диаметре, 11.5 см в длину, Karl Storz 67260АА, Тутлинген, Германия). Изображения записывались при помощи CMOS камеры (асАІЗОО-60gmNIR, Basler, Аренсбург, Германия) со следующими настройками: скорость записи - 50 кадров в секунду, разрешение - 800 х 800 пикселей, время экспозиции - 10 мс.

До того как приступить к хирургии, крыса была анестезирована при помощи 5% изо-флурана, а затем, во время хирургии, концентрация анестетика была снижена до 2%. Два полиэтиленовых кататера были вставлены в левую яременную вену для введения препаратов, и один кататер был вставлен в правую сонную артерию для мониторинга кровяного давления. Была проведена трахеостомия, после чего анестезирующий газ подавался через трубку вставленную в трахею. После хирургии крыса была положена на подогревающийся операционный столик, где затем проводился остаток всех экспериментов. Механическая вентиляция легких производилась при помощи респиратора для небольших животных (60 вдохов в минуту). Для того чтобы предотвратить движения глаз, крыса была парализована при помощи постоянного введения галламина в концентрации 0.33 мг/кг в минуту в изотоническом растворе со скоростью введения 20 мкл/мин. До начала эксперимента для расширения зрачка на поверхность глаза наносился раствор атропина. Полное описание экспериментальной процедуры приведено в работе [97].

Экспериментальный протокол включает начальный 35-минутный контрольный период, во время которого в организм животного подается изотонический раствор (вместо препарата), вводящийся со скоростью 20 мкл/мин. В последствии этот период использовался для детектирования спонтанной вазомоции, а также в качестве источника базисных значений Контроль 35 мин I.V. инфузия NaCI 20 мкл/мин I.V. инфузия аналога Тромбоксана Azz I.V. инфузия IN II 13 III I 30 мин 30 мин Рисунок 1,11: Схематическое представление экспериментальной установки (левая панель) и экспериментального протокола (правая панель). Экспериментальная установка включает эндоскоп (1), лазерный модуль (2), и CMOS камеру (3). Крыса была анестезирована и парализована. Экспериментальный протокол включает внутривенную инфузию U-46619 и SNAP. для оценки ответа на введение препаратов. Контрольный период сменялся 30 минутным системным внутривенным введением U-46619 в концентрации 1 мг/(кг-мин) и последующим внутривенным введением SNAP в концентрации 85 нмоль/(кг-мин) при скорости введения 20 мкл/мин. Временная ось, иллюстрирующая экспериментальную процедуру, представлена на Рисунке 1.11. В соответствии с результатами предыдущих работ [65,66] введение U-46619 вызывает вазомоцию в изолированных артериолах сетчатки свиньи. Что касается SNAP, донора оксида азота, его влияние на вазомоцию представляется противоречивым. С одной стороны, высокая концентрация цГМФ, чье производство следует за повышением концентрации N0, способствует синхронизации выхода кальция из внутриклеточных хранилищ клеток сосудистой стенки, и как следствие, способствует инициации вазомоции [15]. С другой стороны, синтаза оксида азота блокирует усиление вазомоции [16,98]. Другие наблюдения показали снижение частоты вазомоции изолированных артериол сетчатки свиньи под влиянием цГМФ [66].

Для получения относительной скорости спеклов, записанные при помощи метода лазерной спекл визуализации сырые данные были обработаны посредством пространственного лазерного спекл контрастного анализа [99]: где J и с это среднее значение и стандартная девиация интенсивности спеклов, высчитанная по 25 пикселям в окне 5x5 пикселей. Движущееся окно покрывало все изображение с шагом 1 пиксель. Результирующее SV изображение имело тот же размер изображения в пикселях, что и сырые данные. Для валидации ритмической активности детектируемой в SV данных мы сравнили вариации кровяного давления с активностью, наблюдаемой в SV(x,y) наборе данных размером 800 х 800 пикселей, записанном со скоростью 50 кадров в секунду. Так как анализ такого значительного по объему набора данных очень затратен с вычислительной точки зрения (каждый набор данных имеем объем более, чем 300 Гб), данные были уменьшены в объеме путем усреднения по 25 последовательным кадрам. Это привело к SV(x,y) набору данных размером 800 х 800 пикселей каждый кадр, с частотой 2 кадра в секунду.

Результаты вычислительного эксперимента

Многие математические модели отражают специфические свойства объекта или явления, в то время как другие модели скорее сфокусированы на учете только основных свойств, для того чтобы исследовать общий механизм для широкого класса систем [105]. В данном разделе главы мы представляем модель вазомоции последнего класса. Данная модель представляет собой двух-модовый осциллятор с двумя каналами пространственной связи: взаимодействие через относительно медленную диффузионную связь, которое приводит к волновой динамике, а также взаимодействие основанное на быстрых изменениях мембранного потенциала, которые распространяются практически мгновенно на значительные расстояния. Модель воспроизводит наблюдаемую экспериментально кальциевую динамику индивидуальной клетки гладкой мускулатуры, которая может под воздействием усиленной активности деполяризующего цГМФ-чувствительного кальций-зависящего хлоридного канала в плазматической мембране, изменить динамический режим и привести к распространению синхронизации среди большой популяции клеток. Используя данную модель, мы обсуждаем результирующие динамические паттерны с точки зрения осцилляции, волн и синхронизации.

Модель включает основные компоненты представленные на Рис. 2.3а. В своей работе [106] Aalkjaer и Nilsson ввели понятия "цитозольный осциллятор" и "мембранный осциллятор" для Результаты вычислительного эксперимента, имитирующего увеличение активности АТФазы мембраны саркоплазматического ретикулума: - временные реализации переменной Z при различных значениях параметра cG -, - зависимости амплитуды (сплошная линия) и частоты колебаний / (пунктирная линия) концентрации цитоплазматического Са2+ от параметра cG i. По вертикальной оси справа отложены значения частоты, по вертикальной оси слева - амплитуды (a) Основные сигнальные пути вовлеченные в электро-химическую активность клетки гладкой мускулатуры, Са/рз представляет 1Р$ чувствительный Са2+ канал, расположенный на саркоплазматической мембране, Сацуц - саркоплазматический рианодин-чувствительный Са2+ канал, SERCA - Са2+-АТФ-аза саркоплазматического ретикулума, Кса - Са2+-чувствительный калиевый канал, Са - потенциал-чувствительный Са2+ канал (Са2+ канал L-типа), ClcGMp,ca - зависящий от концентрации цГМФ Са2+-зависящий хлоридный канал. На панеле (b) схематически представлены основные компоненты включенные в функциональную модель. Стрелки обозначают взаимодействие между динамическими переменными, того, чтобы описать вклад и функциональную роль различных сигнальных механизмов, Цитозольный осциллятор описывает кальциевый обмен между цитозолью и внутриклеточным хранилищем кальция. Мембранный осциллятор описывает цикличные трансмембранные токи ионов. Несмотря на очевидную физиологическую мотивацию, такой подход является несколько проблематичным с динамической точки зрения, поскольку два осциллятора включают одну и ту же динамическую переменную (концетрация кальция в цитоплазме), и потому, не могут быть независимыми. Отсюда, мы представляем систему как "двухмодовый осциллятор", где каждая мода связана с определенной группой сигнальных механизмов,

Функциональное описание системы (Рис. 2.3Ь) включает кальциевую подсистему (переменные с и CSR) демонстрирующую возбудимую и самоподдерживающуюся динамику и мембранный потенциал (переменная v) регулируемый различными ионными токами (переменные х, у и z). Упомянутые выше компоненты могут быть описаны следующими уравнениями: где J\ это поток кальция через плазматическую мембрану, 1г = k\J\ - соответствующий ему электрический ток, J2 обозначает кальциевый обмен между цитоплазмой и саркоплазматическим ретикулумом. Цитозольная динамика кальция (члены J\ и J2) основана на одно-резервуарной модели [100]. Кальций-зависящий член /3 включает в себя цГМФ-чувствительный кальций-зависимый ток хлора и потенциал-чувствительый кальций-зависимый калиевый ток. Потенциал-зависимый член /4 состоит из одного деполяризующего и одного гиперполяризующего не-кальциевого тока.

Для цельно-клеточной модели, необходимо принять во внимание, что: 1) цитоплазмати-ческий кальций диффундирует внутри клетки, 2) мембранный потенциал клетки это единая переменная, вычисляемая простым усреднением всех локальных Vi, таким образом, является средней по полю переменной для цельно-клеточной модели. Для того чтобы учесть взаимодействие клеток, необходимо добавить член описывающий взаимодействие через щелевые контакты. Результирующий набор уравнений выглядит следующим образом:

Мы предполагаем, что концентрация [IPз] достаточно велика для того, чтобы вызвать кальций-индуцированный выход кальция (CICR) в цитоплазму. Тем не менее, если дссмр слишком мало, мембрана будет гиперполяризована до уровня, когда концентрация [Са2+] слишком мала для того чтобы способствовать CICR. Детальное описание допущений и аппроксимаций для такой записи модели может быть найдено в работе [107]. В уравнении 2.20 внутриклеточная диффузия кальция описывается членом D пь(сэ с) гДе J счетчик по пЪ En числу соседних точек по отношению к данной пространственной точке. Член N обозначает юй . ВСІ сумму по всем N элементарным точкам, которые принадлежат данной клетке. Все величины в скобках понимаются как локальные, в данной пространственной точке клетки. Jgap и 1дар принимаются равными нулю для всех точек внутри клетки, за исключением тех, которые располагаются вблизи щелевых контактов. В этих точках JyapA=-JyapB=lc{cB -сА),& также IyapA=-IyaPB=lv{vB - vA), где 7с отвечает за поток кальция кальция через щелевые контакты, а 7и представляет собой проводимость щелевого контакта. Индексы А и В относятся к точкам соединенным щелевым контактом. дссмр используется как конктрольный параметр. Для обеспечения гетерогенности системы в уравнение 2.20 был добавлен Гауссов белый шум с интенсивностью W. Детальное описание параметров приведено в Таблице 2.2.

Вазомоция в сетчатке крысы, оцененная при помощи лазерной спекл визуали

С целью проверки результатов анализ предложенной модифицированной модели КЭ была выполнена серия вычислительных экспериментов с использованием массива из 60 моделей одиночной КЭ, связанных посредством Igj. Набор управляющих параметров соответствовал описанному выше в разделе 3.2, в то время как параметры к, т, тх, и длительность гиперполяризующего импульса Atimp изменялись с целью отследить изменения в режиме распространения волны,

Результаты вычисления показаны на рисунках 3.9 и 3.10 в форме диаграмм в цветовой кодировке (в градациях серого), где горизонтальная ось соответствует времени, а вертикальная - номеру ячейки. Цифрами обозначены характерные состояния модельной среды. На рисунке 3.9, (а), (Ь): Карты режимов для случая медленной дополнительной активации тока утечки: на плоскости параметров (тх,т) при к = 0 и Atimp = 10 (а), а также на плоскости параметров (rx,Attmp = 10) при к = 0 и т = 0.4. Синий и красный цвета соответствуют элементам, находящимся в нормальном и исходном состоянии, соответственно. На вставках, время отложено по горизонтали, а номер элемента - по вертикали. На рисунке 3.10, (а) и (Ь) показаны карты режимов в случае медленной инактивации гиперполяризующего тока: на плоскости параметров (тх,т) при к = 0 Atimp = 10 (а), а также на плоскости параметров (rx,Attmp = 10) при к = 0 и т = 0.4 (Ь). Вставки иллюстрируют характер распространения волны, наблюдаемый в конкретном сегменте диаграммы.

Анализ показанных на рисунках результатов показывает, что режим, соответствующий нижней области панелей (а) обоих рисунков соответствует обнулению как к, так и т и, по сути, показывает динамику, которая уже наблюдалась для исходного варианта модели. В частности, Н-фронт успешно распространяется, тогда как инициированный при после Atimp It-фронт останавливается на 2-м или 3-м элементах. Такой тип поведения наблюдаестя вплоть до достижения некоторого критического значения к или т 0.33. Какой динамический (b)

Результаты вычислительного эксперимента по распространению гиперполяризующего импульса по одномерному массиву моделей КЭ согласно 3.25 - 3.26. паттерн будет наблюдаться при больших значениях параметров, зависит от величины тх, которая устанавливает, насколько медленно развивается адаптация,

Если тх 4, то рост как к, так и m блокирует распространение Н-фронта на некотором, зависимом от параметров, расстоянии от начальной точки, и в некоторых случаях может даже начать движение вспять (верхняя вставка на панели (а) рисунке 3.10). Этот эффект, как представляется, может быть объяснен на основе того факта, что адаптация не только способствует продвижению R-фронта, но и затрудняет распространение Н-фронта, если развивается достаточно быстро, чтобы его опередить. Это то, что имеет место в области (1) на всех диаграммах.

Область (2) соответствует успешному распространению как Н-, так и R- фронта. Именно этот случай соответствует реализации регенеративной передачи вдоль цепочки гиперполя-ризующего импульса вне прямой зависимости от его длительности в месте инициализации. Заметим, так как скорости распространения Н- и R- фронтов в общем случае различны, исходная длительность гиперполяризующего стимула Atimp не сохраняется при его продвижении вдоль цепи. На вставках к обоим рисункам, панели (а), R-фронт движется заметно быстрее, и потому длительность нахождения конкретной КЭ в гиперполяризованном состоянии уменьшается с удалением от начальной точки.

Небольшая область (4) показывает особый случай, когда R-фронт догоняет Н-фронт и анниглирует с ним, тем самым прекращая распространение гиперполяризации. Обращает на себя внимание плоская верхушка "языка" гиперполяризации, которая говорит о том, что Н-полностью останавливается перед слиянием с R-фронтом.

Также стоит отметить, что панели (Ь) обоих рисунков показывают, что совпадение величин Atimp и тх препятствует распространению R-фронта, как минимум для выбранных значений кат. Этот эффект требует дальнейшего изучения.

В итоге, описанные выше результаты вычислительного эксперимента полностью подтвердили предсказания, сделанные на основе теоретического анализа динамики модели.

По итогам проведенного модельного и теоретического исследования был показано, что изучаемый динамический механизм как минимум не противоречит известным фактам о физиологии КЭ. Как удалось показать, минималистичная модель одиночной КЭ, содержащая всего лишь два ионных тока, а именно, гиперполяризующий ток калия с определенным типом нелинейности (по типу KIR-тока) и ток утечки, достаточно, чтобы воспроизвести динамику, соответствующую доступным экспериментальным данным [120] и [121].

Для того, чтобы протестировать механизм, предложенный в [38], мы объединили 60 индивидуальных моделей КЭ в одномерный массив. Как было установлено, предложенная минималистичная модель не в состоянии поддерживать пространственное распространение импульса гиперполяризации, так как условия для распространения фронтов переключения в разные состояния взаимно противоречивы (несовместны). На основании этого результата, нами была предложена модификация модели путем добавления процесса медленной адаптации одного из ионных токов, что обеспечивает смещение порога переключения таким образом, чтобы облегчить обратный переход. Результаты численного эксперимента полностью подтвердиили теоретические расчета и предположения, на основе которых была модифицирована модель,

Следует, однако заметить, что упомянутая выше модификация модели была выполнена по соображениям динамики и нуждается в подтверждении средствами экспериментальной физиологии, В то же время, добавленные в модель свойства динамики носят достаточно общий характер и могут быть реализованы в результате действия самых различных физиологических механизмов,

По константам скорости распространения, мы наблюдали скорость распространения как для Н-,так и для R- фронтов порядка 50 элементов за 10 миллисекунд. Принимая эффективную (с учетом перекрытия и мест расположения щелевых контактов) длину одной КЭ как 40/лп, мы оцениваем предсказанную моделью скорость распространения волны гиперполяризации как 20mm в секунду, что хорошо соответствует экспериментальным данным, С учетом этого, в абсолютных величинах характеристическое время процесса медленной адаптации должно составлять не менее чем 5-10 миллисекунд, что представляется вполне реалистичным,