Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Структура миелина и современные методы исследования 11
1.2 Метод спектроскопии комбинационного рассеяния.
1.2.1 Основы метода I. Классическая теория 16
1.2.2 Особенности спектров КР липидов в диапазоне 2800–3000 см-1 23
1.2.3 Спектральные свойства каротиноидов в составе модельных мембранных систем и биологических объектов. 26
1.3 Основы количественной теории ориентационной упорядоченности молекул и методы ее исследования. 29
1.3.1 Основные методы, используемые для исследования молекулярной ориентации. 29
1.3.2 Использование ПКР для исследования ориентационной упорядоченности молекул в составе биологических объектов. 31
1.3.3 Основы поляризационной КР спектроскопии 32
1.4 Использование оптических свойств биологических объектов как инструмента для их исследования 37
1.4.1 Оптические методы исследования свойств нервных волокон 39
1.4.2 Эффект шепчущей галереи. Качественное описание 40
1.4.3 Использование эффекта шепчущей галереи в биологических исследованиях. 42
1.5 Устройство пуринергической сигнализации в нервной системе. 43
1.5.1 Основные компоненты пуринергической системы 44
1.5.2 Пуринергическая сигнализация и внутриклеточный кальций з
1.5.3 Пуринергическая сигнализация и электрическая активность возбудимых клеток. 48
1.5.4 Пуринергическая сигнализация и ноцицепция. 50
1.5.5 Пуринергическая сигнализация в глиальных клетках. 51
1.5.6 Взаимосвязь пуринергической и простаноидной систем регуляции. 52
Глава 2. Материалы и методы 54
2.1 Растворы и реактивы. Приготовление препаратов 54
2.1.1 Используемые реактивы. 54
2.1.2 Процедура препаровки экспериментальных животных . 54
2.1.3 Приготовление препарата нервного волокна для оптических измерений. 55
2.1.4 Фиксация нервного волокна для масс-спектрометрии. 55
2.1.5 Приготовление липидных пленок для модельных экспериментов. 55
2.2 Методы исследования 56
2.2.1 Микроспектроскопия КР. 56
2.2.2 Лазерная интерференционная микроскопия. 57
2.2.3 Масс-спектрометрия. 58
2.2.4 Регистрация потенциалов действия. 61
2.2.5 Статистическая обработка результатов. 61
Глава 3. Результаты исследования и обсуждение 67
3.1 Особенности КР спектроскопии одиночных нервных волокон. 67
3.1.1 Интерпретация спектров КР миелина нервных волокон. 67
3.1.2 Выделение полос каротиноидов и липидов из спектра КР миелина. 73
3.1.3 Фокусировка лазера на нервном волокне . 76
3.1.4 Время экспозиции и фотовыцветание 78
3.1.5 Пространственное распределение интенсивностей основных полос спектра КР миелина в различных областях нервного волокна 79
3.2 Исследование микрогетерогенностей интернодальной области миелина. 82
3.2.1 Особенности распространения монохроматического света в нервных волокнах и модельных системах 82
3.2.2 Исследование микрогетерогенностей миелина с помощью КР спектроскопии 88
3.2.3 Лазерная интерференционная микроскопия и микрогетерогенности миелина 92
3.2.4 Возможные области применения метода. 94
3.3 Исследование ориентационной упорядоченности каротиноидов и липидов в мембранах миелина 96
3.3.1 Особенности измерений спектров КР. 96
3.3.2 Анизотропия спектров КР миелина. 97
3.3.3 Исследование молекулярной ориентации с помощью спектроскопии КР. Расчет коэффициентов упорядоченности и построение ОФР 98
3.3.4 Двумерная визуализация миелина нервных волокон с помощью конфокальной КР микроспектроскопии 111
3.3.5 Выбор оптимальных условий измерения спектров КР миелина, используя поляризованный возбуждающий свет. 114
3.3.6 Расчет коэффициентов упорядоченности и основных отношений интенсивностей полос спектра КР миелина при различных воздействиях на нервное волокно 116
3.4 Использование метода КР микроспектроскопии для исследования влияния пуринергической сигнализации на функциональное состояние мембран миелина. 121
3.4.1 Экспериментальный протокол измерений 124
3.4.2 Результаты КР спектроскопии. Влияние АТФ и аденозина на свойства мембран миелина 125
3.4.3 Результаты масс-спектрометрии. Влияние АТФ и аденозина на химический состав мембран миелина 130
3.4.4 Модельные эксперименты для исследования матричного эффекта. 132
3.4.5 Сравнение результатов МС спектрометрии и КР спектроскопии на мембранах миелина с экстрагированным холестерином. 135
3.4.6 Возможный механизм перестройки мембран миелина под
действием АТФ и аденозина. 135
Выводы 147
Список рисунков
- Использование оптических свойств биологических объектов как инструмента для их исследования
- Процедура препаровки экспериментальных животных
- Фокусировка лазера на нервном волокне
- Расчет коэффициентов упорядоченности и основных отношений интенсивностей полос спектра КР миелина при различных воздействиях на нервное волокно
Введение к работе
Актуальность темы. Важным направлением современной биофизики является исследование изменений структуры и свойств миелина при проведении нервным волокном потенциалов действия (ПД). Известно, что миелин содержит большое количество липидов и шунтирует распространение мембранных токов из перехвата Ранвье (ПР) в паранодальную область волокна. В связи с этим миелину отводится важная роль в реализации сальтаторно-го механизма и обеспечении высокой скорости проведения ПД [Tasaki 1994]. Однако, и при проведении нервным волокном серии ПД или активации ряда рецепторов меняется как морфология миелина, так и содержание в нем некоторых ионов (калий и кальций), а также упорядоченность мембранных фосфолипидов [Harden et al., 1994, Maksimov et al., 1996].
Приоритетами в данной области являются работы, в которых использовали спектроскопию комбинационного рассеяния (КР) для исследования состояния некоторых липидов миелина нервных волокон [Larsson 1973], а также работы, в которых с помощью КР исследовали изменения состояния ли-пидов миелина при проведении серии ПД [Szalontai et al., 1977; Maximov et al., 1985; Rodionova et al., 2009; Bibinesvilli et al., 2011].
Однако, использование микроскопии показало, что при регистрации КР от различных отделов одиночного миелинового нервного волокна (миелин, перехват Ранвье, шванновская клетка (ШК)) исследователь сталкивается с целым рядом существенных проблем, требующих детального изучения.
Во-первых, размер фокального объема (объем пространства, в пределах которого регистрируется КР) становится сравнимым с размером самого объекта: если различные отделы волокна отличаются по спектру КР, то необходимо однозначным образом задать координаты измерения.
Во-вторых, наличие в миелине нервного волокна «природной метки» — молекул каротиноидов представляет собой не только научный интерес [Rodionova et al., 2009], но и возможность для создания новой методологии тестирования состояния липидного бислоя мембран миелина. Важно, что в зависимости от химической структуры молекулы каротиноидов, они могут быть различным образом ориентированы в липидных мембранах [Gruszecki et al., 2005]: некоторые каротиноиды могут располагаться перпендикулярно к плоскости бислоя за счет взаимодействия концевых полярных групп с
полярными головами фосфолипидов, другие (неполярные каротиноиды) могут быть ориентированы как перпендикулярно, так и параллельно бислою мембран миелина. Все это позволит разработать новый метод исследования состояния биологической мембраны.
В-третьих, ориентация молекул каротиноидов в липидном бислое может по-разному влиять на упорядоченность «хвостов» жирных кислот мембранных липидов и, наоборот, что регулирует электрическое сопротивление миелина и скорость проведения ПД [Gruszecki et al., 2005]. В связи с этим нами было проведено исследование роли локальной ориентации молекул ка-ротиноидов и жирных кислот липидов в мембранах миелина при изменении функционального состояния нервного волокна (активация пуринергических рецепторов ШК).
Целью данной работы была разработка методологии исследования изменений локализации, ориентации и конформации молекул липидов и ка-ротиноидов в миелине в покое и при изменении функционального состояния нервного волокна.
В связи с целью исследования было необходимо решить следующие задачи:
-
Разработать методологию регистрации спектров КР от одиночных миелиновых нервных волокон (фокусировка, поляризации лазера, разделение сигналов КР и флуоресценции).
-
Зарегистрировать КР спектры в различных областях нервного волокна (перехват Ранвье, паранодальная и интернодальная области).
-
Разработать методологию регистрации и количественной оценки упорядоченности молекул каротиноидов и липидов в бислоях миелина.
-
Исследовать изменения локализации, ориентации и конформации молекул каротиноидов и липидов в миелине нервного волокна в норме и при изменении функционального состояния нервного волокна (действие экстраклеточного АТФ и аденозина).
Основные положения, выносимые на защиту: 1. Молекулы каротиноидов миелина находятся в упорядоченном состоянии и ориентированы преимущественно перпендикулярно к по-
верхности, а «хвосты» жирных кислот мембранных липидов — в среднем под углом 30 к нормали к поверхности мембраны.
-
Степень упорядоченности и насыщенности жирных кислот липидов варьирует в пределах интернодальной области миелина нервного волокна.
-
Активация пуринергических рецепторов, вызывает изменение содержания холестерина и фосфатидилхолина (ФХ), а также упорядоченности и степени насыщенности «хвостов» жирных кислот ли-пидов в мембранах миелина.
Научная новизна:
-
Впервые разработана методология и проведен количественный анализ ориентации молекул каротиноидов и липидов миелина нервных волокон с помощью метода КР и доказано, что молекулы кароти-ноидов ориентированы преимущественно перпендикулярно, а «хвосты» жирных кислот в среднем под углом 30 к нормали к поверхности мембраны.
-
Впервые обнаружено явление распространения монохроматического излучения внутри миелина и предложен способ его использования для исследования упорядоченности липидов в различных участках вдоль миелина.
-
Доказано, что интернодальная область нервного волокна представляет собой совокупность участков миелина, обладающих различной степенью упорядоченности и насыщенности «хвостов» жирных кислот мембранных липидов.
-
Разработан комплексный подход (КР спектроскопии и масс-спектрометрии) исследования миелина и доказано, что холестерин накапливается в мембранах миелина в ответ на активацию 2 пу-ринергических рецепторов.
Практическая значимость В диссертации систематизированы экспериментальные подходы и реализована методология регистрации спектров КР для исследования миелина в нативных нервных волокнах. Доказана существенная роль локализации фокуса и направления плоскости поляризации лазера при измерении КР, а применение поляризованной спектроскопии КР существенно повышает эффективность исследования и интерпретации ре-5
зультатов. Впервые обнаружена способность миелина осуществлять распространение монохроматического света аналогично кольцевому микрорезонатору, и предложен метод использования данного эффекта для тестирования упорядоченности липидов вдоль поверхности миелина.
Получены результаты, свидетельствующие о том, что изменение упорядоченности липидов и химического состава миелина может быть вызвано активацией Р2 пуринергических рецепторов. Доказано, что комплексное использование методов КР спектроскопии и масс-спектрометрии позволяет выявить не только изменения упорядоченности и конформации липидов и каротиноидов, но и изменения химического состава мембран миелина. Полученные данные указывают на то, что сопротивление миелина и, соответственно, скорость проведения ПД по аксону могут зависеть от ориентации и упорядоченности некоторых мембранных липидов миелина.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на: семинарах кафедры биофизики биологического факультета МГУ, Российских и международных конференциях: «Ломоносов–2011», «Метрология в нанотехнологиях» и «GLIA Bilbao 2015».
Публикации. Основные результаты по теме диссертации изложены в 6-ти печатных изданиях, 4 из которых изданы в журналах, рекомендованных ВАК [1–4], 2 — в тезисах докладов [5;6].
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и двух приложений. Полный объем диссертации составляет 172 страницы текста с 38 рисунками и 4 таблицами. Список литературы содержит 151 наименований.
Использование оптических свойств биологических объектов как инструмента для их исследования
Спектроскопия КР представляет собой распространенный метод исследования самых разнообразных объектов от неорганических материалов до живых клеток [25]. Данный метод позволяет исследовать колебательные энергетические спектры молекул, и благодаря тому, что они напрямую связаны с типом химических связей, становится возможным производить анализ химической структуры объекта. В последующих главах мы кратко рассмотрим под 16 ходы к теоретическому описанию явления КР, которые нам будет необходимы при последующей интерпретации экспериментальных данных.
Явление комбинационного рассеяния (КР) состоит в изменении длины волны света при его рассеянии на веществе. Существует несколько моделей позволяющих описать явление КР, и оценить, чем определяется интенсивность полос КР в спектре. Начнем рассмотрение с классической модели Рэлеевского рассеяния. Наиболее простую модель можно получить, рассматривая колеблющийся диполь Герца (модель излучающего диполя в вакууме). Известно, что полная интенсивность, излучаемая во всех направлениях электрическим диполем, представляется уравнением [26]: где —частота излучения, 0—смещение заряда от положения равновесия, —заряд. Допустим, что свет (напряженность электрического поля волны 0) рассеивается колеблющимся электроном атома (массой ), смещение которого (0) выразим из уравнения движения для гармонического осциллятора [26]:
При выводе данной формулы не учитывались затухание для электронного колебания и наличие многих собственных частот у атома. Как следует из ур. 1.3, полная интенсивность рассеяного света пропорциональна 4-ой степени его частоты и квадрату падающего на атом электрического поля. Аналогичная зависимость будет характерна и для процесса комбинационного рассеяния. Приведем краткое феноменологическое описание явления КР. Представим ур. 1.1 в следующем виде (интегрирование по всем направлениям не производилось): дР UJ р 2л — = Trsin 0 (1.4) (У 127ГЄ0С"5 где = (6,ф)—пространственный угол, с которого собирается сигнал, р2 — квадрат модуля дипольного момента. Световая волна, взаимодействующая с молекулой, поляризует ее и приводит в движение электроны. В результате молекула становится новым источником излучения той же частоты, что и исходная световая волна (Рэлеевское рассеяние). В случае КР происходит взаимодействие световой волны с колебанием молекулы, что приводит к излучению на других частотах. Для малых интенсивностей возбуждающего света, можно считать, что индуцируемый дипольный момент пропорционален электрической компоненте поля: р = a(ujLiUJl/) E (1.5) UJL — частота падающего, UJV — рассеяного света. Коэффициент пропорциональности а — поляризуемость молекулы.
Важно отметить, что при выводе данной формулы мы не учитывали ряд важных факторов. Во-первых, в общем случае вещество, рассеивающее свет, анизотропно, т.е. вектор индуцированного дипольного момента может быть не сонаправлен с вектором электрического поля световой волны. В таком случае а является тензором второго ранга (представляется матрицей 3x3). Рх \ І «11 «12 «13 \ / І- х \ Ру = «21 «22 «23 У (1.6) Pz «31 «32 «33 z В дальнейшем будет рассмотрена упрощенная изотропная модель, где поляризуемость постоянна.
Во-вторых, для конденсированных сред важно различать локальное поле, действующее на отдельные молекулы вещества, и среднее поле (макроскопическое) соответствующее электрическому полю световой волны. Эти поля различаются из-за возникновения поляризационных зарядов в веществе, чье поле также влияет на соседние молекулы. Существует несколько моделей пересчета макроскопического поля в локальное. Введем коэффициент пересчета, описан 18 ный в [26]: Р = LM4a(ujL,ujl/)E т і пм2 + м4 = т, где пм— показатель преломления вещества. Если поместить излучающий диполь из вакуума в среду с показателем преломления пм, то согласно [26] интенсивность излучения диполя можно представить в виде: дР UJ HMVLM р2 2Л — = sin 0 (1.7) Из этого уравнения видно, что интенсивность рассеяния для молекул будет выше в растворе, чем в воздухе.
В третьих, необходимо найти способ количественного описания собственных колебаний молекулы в рамках данной теории. В этом описании мы также будем следовать подходу, описанному в [26]. Представим, что излучение будет взаимодействовать только с определенным колебанием молекулы нормальной модой к с координатой Qi . Нормальным колебанием можно назвать молекулярное движение, при котором колебания атомов (функциональных групп) в составе молекулы происходят с одинаковой частотой. Нормальные координаты связаны с естественными (длины конкретных связей, величины углов) линейным преобразованием. Причем коэффициенты при различных естественных координатах отражают долю участия данной связи (или угла) в нормальном колебании. Иногда один из коэффициентов может быть велик по отношению к остальным. В этом случае можно допустить, что нормальное колебание обусловлено колебанием определенной связи (или валентного угла) молекулы. В противном случае говорят, что колебания различных частей молекулы смешиваются в данном нормальном колебании.
Процедура препаровки экспериментальных животных
Пуринергическая сигнализация (ПС) появилась на ранних этапах эволюции и с тех пор является важнейшим звеном межклеточной коммуникации. Особый интерес к ПС возник после открытия нейромедиаторной функции АТФ. Позднее было выяснено, что АТФ играет роль нейротрансмиттера и котранс-миттера в большинстве нервов в составе периферической и центральной нервной системы (ПНС и ЦНС) [78]. Было показано, что разнообразные типы пури-нергических рецепторов распространены в ЦНС и ПНС как на нейронах, так и на глиальных клетках. Широкое разнообразие процессов в живой клетке происходит с участием ПС. К ним относятся как быстрые (проявляются непосредственно сразу после активации рецепторов, порядка мс), так и долговременные процессы (действие разворачивается на более длительных временах, порядка жизни самой клетки). Первая группа включает нейротрансмиссию, секрецию, воспалительные реакции и генерацию болевых сигналов и другие. Ко второй группе можно отнести процессы развития, пролиферации, регенерации, заживление ран, хронические воспаления, старение и другие [79]. Одной из основных функций ПС в нервной системе является объединение нейронов, глии и клеток кровеносных сосудов в единую взаимодействующую систему клеток. Подобные взаимодействия определяют направление процессов развития нервной системы. Кроме этого, действие АТФ также связывают с процессами нейродегенерации, миелинизации, воспаления и канцерогенеза [79].
Действие пуриновых нуклеотидов и нуклеозидов на клетку обусловлено наличием на ее поверхности специальных рецепторов. Пуринорецепторы разделяют в первую очередь на Р1 и Р2 типы. Лигандом для Р1 рецепторов служит аденозин. Все рецепторы этого типа являются G-белок связанными и имеют семь трансмембранных доменов. На настоящее время различают A1, A2A, A2B и A3 аденозиновые рецепторы [78]. В ЦНС аденозин выполняет большое количество функций, включающих в себя модуляцию активности нейронов и Шван-новских клеток, нейроглиальные взаимодействия и процессы развития нейро-нальных клеток. Кроме того, аденозин играет важную роль в контроле за врожденным и адаптивным иммунитетом [78]. Лигандами для Р2 рецепторов являются АТФ или АДФ. Данный тип рецепторов разделяют на два семейства: Р2X и Р2Y. Первое семейство включает в себя лиганд-зависимые ионные каналы, второе объединяет G-белок связывающие рецепторы [79]. К семейству P2X рецепторов относятся лигандактивируемые каналы, проницаемые для ионов Na+ , K+ и Ca2+ . P2X рецепторы представляют собой тримеры, образованные индивидуальными субъединицами, кодируемые семью различными генами (P2X1– P2X7). Особенностью Р2X рецепторов является их способность объединяться в гомо- и гетеромерные кластеры, состоящие из рецепторов разных видов [79]. Го-момерный P2X7 рецептор активируется 100–1000 мкМ АТФ, в то время как для других рецепторов эта концентрация составляет порядка 110 мкМ [79]. Все типы P2X рецепторов экспрессируются в нервных клетках. Периферические нейроны (сенсорные и автономные) преимущественно экспрессируют P2X3 и P2X2/3 рецепторы, которые опосредуют болевую и термочувствительность [78]. Пост-синаптические P2X рецепторы могут взаимодействовать с различными ионо-тропными рецепторами, включающими GABA и NMDA рецепторы [78].
Все P2Y рецепторы имеют структуру, характерную для G-белок связывающих рецепторов. Их условно разделяют на две группы. К первой относятся P2Y1 , P2Y2 , P2Y4 , P2Y6 и P2Y11 рецепторы, активирующие фосфолипазу С и инозитол трифосфат-зависимый кальциевый выброс из ЭПР. Ко второй группе относят P2Y12 , P2Y13 и P2Y14 рецепторы, связанные с G-белком, ин-гибирующим аденилатциклазу и модулирующим активность ионных каналов [78].
Молекула АТФ является ключевым звеном пуринергической сигнализации. Содержание АТФ сильно варьирует в зависимости от типа клетки. Например, опухолевые клетки и эпителиальные клетки хрусталика глаза содержат высокие количества внутриклеточного АТФ. Для нейронов, например, характерна концентрация АТФ порядка 25 мМ в цитоплазме и более высокие до 100 мМ в синаптических везикулах [79]. Первоначально считалось, что появление АТФ во внеклеточном пространстве связано исключительно с его выбросом из поврежденных или мертвых клеток. К настоящему моменту времени накоплены данные, подтверждающие, что увеличение уровня экстраклеточного АТФ может быть связано с его выбросом из здоровых клеток, что имеет важное физиологическое значение. АТФ выделяется из нейронов центральной и периферической нервной систем. Кроме того, многие другие типы клеток могут выделять АТФ во внеклеточное пространство под воздействием механических деформаций [80], осмотическому набуханию и влиянию химических агентов [79]. Рецепторы к АТФ были обнаружены на ноцицептивных волокнах, что делает АТФ вероятным связующим звеном между повреждающим воздействием и болевым импульсом. Для регуляции количества выделяемого клетками АТФ, в большинстве тканей существуют специальные ферменты, расщепляющие экстраклеточные нуклеотиды. Их активный центр находится наружной поверхности плазматических мембран клеток. Такие ферменты называются эктонуклеоти-дазами (ЭНД). Их разделяют на два семейства: ENTPD, гидролизующих нук-леозид 5 -три- и дифосфаты, и E-NPP, расщепляющие фосфодиэфирные связи нуклеотидов и нуклеиновых кислот, а также пирофосфатные связи нуклеоти-дов. Например, под действием E-NPP возможно отщепление двух фосфорных остатков от АТФ с образованием АМФ и преобразование цАМФ в АМФ [79].
Grafe и соавт. исследовали кинетику выброса АТФ из спинных корешков при механическом воздействии. Параллельно с этим регистрировались экстраклеточные потенциалы действия (ПД). Было показано, что механическое воздействие (сдавливание) приводило к увеличению экстраклеточного АТФ и одновременно к уменьшению амплитуды ПД [81]. Возбуждающий стимул продолжительностью 0.1 мс приводил к активации А-волокон нерва. Была выявлена корреляция между экстраклеточной концентрацией АТФ и уменьшением амплитуды ПД. Grafe и соавт. также обнаружили, что вызванный механическим воздействием повышенный уровень АТФ возвращался к первоначальному всего за несколько минут. Также авторы предположили, что за это время АТФ может активировать аксональные P2X рецепторы. В процессе расщепления АТФ образующийся аденозин связывается с А2 аденозиновыми рецепторами. Быстрый гидролиз АТФ может быть связан как с диффузией АТФ в омывающий раствор, так и с активностью ЭНД. С помощью специфических ингибиторов ЭНД был изучен их вклад в расщепление АТФ. Для спинных корешков введение ингибитора приводило к слабому изменению скорости гидролиза [81]. Данные Grafe и соавт. указывают на то, что используемые ингибиторы преимущественно связываются с ЭНД семейства E-NPP. Считается, что выделение АТФ из клетки может происходить посредством экзоцитоза (везикулярных пузырьков из нервных клеток), ABC-транспортеров, коннексиновых каналов и, возможно, потенциалзависимых анионных и P2X7 рецептор связанных каналов [79]. За счет своей активности ЭН могут регулировать синаптическую активность, контролируя количество АТФ и аденозина.
Фокусировка лазера на нервном волокне
Измерения были проведены на автоматическом интерференционном мик-ропрофилометре МИА-1, собранном на базе МИИ-4 интерферометра Линника (ЛОМО, Санкт-Петербург, Россия.). Объекты освещались неполяризованным светом от светодиодного лазера длиной волны 650 нм и мощностью 5 мВт. Мощность излучения на исследуемых клетках составляла не более 3 мВт. Фокусировка осуществлялась посредством 30Х объектива с численной апертурой NA = 0.65. Регистрация изображений производилась с помощью черно-белой 12-ти битной ПЗС видеокамеры VS-415U (NPK Videoscan, Russia), с матрицей размером 6.5 х 4.83 мм.
Исходный лазерный луч разделяется на два, один из которых (опыт) проходит через объект, другой (контроль) — через буферный раствор, после чего они интерферируют на детекторе. Не смотря на то, что оба луча проходят одинаковые расстояния, более высокий показатель преломления клетки приводит к фазовому сдвигу между ними, из которого и рассчитывается оптическая разность хода (ОРХ), которая в простейшем приближении функцией высоты и показателя преломления объекта. Пусть показатели преломления буферного раствора и объекта равны щ и п соответственно. Тогда ОРХ выражается как (п — По) , где z — толщина объекта. В случае если показатель преломления является функцией пространственных координат ОРХ может быть рассчитана следующим образом: ОРХ = / n(z)dz Z\ где Z2 — Z\ = z. В экспериментах были измерены фазовые изображения нервных волокон, таким образом, что в пределах поля изображения (190 250 мкм) находились основные морфологические области нервного волокна, включая ПР, парано-дальную и интернодальную области. Разрешение получаемых изображений составляло 512 512 пикселей.
Масс-спектрометрия (МС) представляет собой метод исследования химического состава объекта. Современные МС технологии позволяют получать информацию о химической природе микроскопических объектов и исследовать их структуру с высоким пространственным разрешением [93]. Существует два основных класса методов МС микрокартированию (получению пространственной информации об объекте). Первый, называемый MALDI, заключается в помещении объекта в специальный матрикс и дальнейшим сканированием поверхности лазером (часто используются пульсирующие лазеры), при котором происходит абляция поверхности, и образующиеся ионы детектируются и анализируются. Для получения достаточного уровня сигнала лазерное излучение фокусируется до пятна размером порядка 10 мкм, что и определяет пространственное разрешение метода.
К альтернативному методу МС, также широко используемому для анализа биологических объектов является SIMS, основанный на бомбардировке поверхности объекта ионами. Данный метод также является сканирующим (ионный пучок сканирует поверхность объекта) и в некоторых случаях позволяет достигать латерального разрешения в сотни нанометров [93]. SIMS позволяет исследовать распределение состава определенного химического компонента в интересующих регионах сложных биологических объектов.
Основной разновидностью SIMS, который был использован в рамках данной работы, является TOF-SIMS. Первичный ионный пучок ускоряется до необходимых энергий и затем фокусируется на интересующую область объекта. Взаимодействие первичного пучка с объектом определяется типом ионов, их энергией, а также молекулярным окружением интересующих молекул на поверхности объекта. Для биологических исследований в настоящее время активно используются крупные кластеры ионов, такие как +3 , 5+ или 6+0. Массивные ионы в составе первичного пучка при столкновении с поверхностью объекта позволяют образовать более тяжелые вторичные ионы, представляющие особый интерес для биологических исследований. Одним из главных ограничений данного подхода является то, что большинство десорбирующихся с поверхности образца молекул являются нейтральными и не могут быть детектированы. Для решения данной проблемы может быть использована постионизация, приводящая к появлению заряда на молекуле. Недостатком является дальнейшая ее фрагментация, усложняющая процесс идентификации.
Схематическая диаграмма устройства TOF-SIMS представлена на рис. 2.1. В TOF-SIMS первичный ионный пучок используется в пульсирующем режиме. Испускаемые с образца вторичные ионы ускоряются электрическим полям до одинакового значения кинетической энергии, благодаря чему скорость отдельных ионов определяется отношением массы к заряду. Тогда измеряя время необходимое каждому иону для того, чтобы достичь детектора, можно определить данное соотношение с высокой точностью. Чувствительность в диапазоне масс определяется временем генерации вторичного пучка (эквивалентно — длительностью импульса первичного) и длиной трека иона.
Для измерения масс-спектров в данной работе была использована установка IONOF ToF-SIMS 5 масс-спектрометр с пульсирующим сфокусированным первычным потоком 30 кэВ Bi+3 ионов. Первичный ионный ток составлял 0.5 пА, что соответсвует ионной плотности 2.51011 ионов/см2. Перед попаданием в детектор вторичные ионы были ускорены до 10 кэВ. Площадь поверхности, с которой происходила регистрация сигнала составляла 500 500 мкм2 (128 128 пикселей). Все спектры были измерены в областях положительных и отрицательных ионов. Выход ионов был рассчитан как отношение интенсивности спектрального пика к общему числу ионов.
Расчет коэффициентов упорядоченности и основных отношений интенсивностей полос спектра КР миелина при различных воздействиях на нервное волокно
Сама по себе липидная мембрана представляет собой фазу с одноосной симметрией. С другой стороны мембраны миелина изгибаются внутри ФО. Рассмотрим ситуацию, изображенную на рис. 3.17(а:4 ) и рис. 3.17(б) с идеально упорядоченными (в = 0) по отношению к мембране молекулами (обозначены серыми стрелками). Ожидаемый вид ОФР представляет собой дельта-функцию Дирака с центром в в = 0. Однако, вследствие искривления мембраны внутри ФО, молекулы представляются ориентированными в пределах угла /3. Из рис. 3.17(а,б) видно, что с увеличением этого угла проекция Z-компоненты электрического поля на направления ДМП молекулы уменьшается. Чтобы учесть данный эффект мы можем рассмотреть эквивалентную систему, где мембрана миелина не изогнута, но в то же время направление поляризации возбуждающего света изменяется в пределах угла /3 внутри ФО как схематически показано на рис. 3.17(в). Данные подход позволяет использовать такой же вид ТП и изменить только положения поляризатора и анализатора.
Интенсивность полосы спектра КР в зависимости от угла /3 может быть выражена следующим образом: где ЄІ((3) и ej((3) являются компонентами векторами электрического поля для различных ориентаций поляризатора и анализатора. Значение амплитуды сигнала включено в константу к. Для света поляризованного по осям Z или У, ЄІ((3) и ej((3) принимают следующий вид: е(/3) = ( sin/3 0 cos/З) , еу(Р) = ( 0 1 0 ) (3.4) Для света, поляризованного по оси Y рассмотрение кривизны мембраны не требуется, так как нервное волокно симметрично относительно этой оси. В качестве примера ниже приведено выражение для интенсивности полосы КР при возбуждении светом, поляризованным по оси Z и анализатором, ориентированным по оси Y: { /0\ \ hy(P) = к \ ( sin/3 0 cos/3) А 1 (3.5) где константа к включает в себя интенсивность лазера и а2.
Данное выражение позволяет рассчитать значение регистрируемой интенсивности для конкретного угла /3, поэтому для того чтобы рассчитать экспериментальный сигнал, исходящий из всего ФО (Jij), необходимо сложить все интенсивности, полученные для различных /3: Г ft Jij = / Iij(/3)d/3 (3.6) —(З Для того, чтобы рассчитать максимально возможный угол /3, вносящий наибольшую погрешность в измерения, мы предполагаем, что максимальный сигнал возникает в случае, когда лазерный пучок касается поверхности аксона (самого внутреннего слоя миелина). В данному случае можно нарисовать прямую, проходящую через точку Z = г, где г—радиус аксона и рассчитать угол, под которым данная прямая пересекает наружную поверхность миелина. В данном рассуждении мы также допустили, что высота ФО ( 10 мкм) соизмерима с диаметром нервного волокна и имеет одинаковую интенсивность возбуждающего света по всему объему (рис. 3.17(а)).
Описанный выше ТП А зависит от трех пространственных углов в, ф и ф. Так как мы рассматриваем одноосную систему (мембрану) то различные углы ф равновероятны, благодаря чему мы можем произвести усреднение. Аналогичным образом, ввиду допущения об аксиальной симметрии каротиноидов и липидов, мы можем также усреднить компоненты ТП по углу ф. Таким образом, можно выразить среднюю интенсивность полосы КР ((Jij)) как функцию (cos2 в) и (cos4 в). Последние могут быть использованы для расчета параметров упорядоченности (Р2) и (РА). В итоге экспериментально измеряемая величина (Jij) может быть представлена в виде линейной функции от параметров упорядоченности: (Jzy) = к (а((3)(Р2) + b(f3)(P ) + с((3)) , (3.7) где а, Ъ и с являются функциями /3 и следовательно могут быть независимо посчитаны. Измеряя компоненты (Jzz), (JZy) и (Jyy), можно составить систему из трех уравнений с тремя неизвестными (к, (PQ) и (РА)) и получить решение, на основе которого построить искомую ОФР.
Строго говоря, подобные экспериментальные данные позволяют получить только два первых члена в разложении ОФР. В некоторых случая данная функция может принимать отрицательные значения не имеющие физического смысла. В случае высокой степени упорядоченности молекул, члены разложения с индексом 4 вносят значительный вклад в ОФР и следовательно ими нельзя пренебречь [53]. Одним из возможных подходов к решению данной проблемы является использование наиболее вероятной ОФР использую подход, описанный Labarthet и соавт., а также Tanaka и Young [65, 53].
Ориентация каротиноидов в биомембранах зависит от их химической структуры и состава мембраны. К сожалению, к настоящему времени не известна химическая структура каротиноидов в составе нервных волокон. В то же время химических анализ состава миелина нервов травяной лягушки был исследован в работах Smith и Curtis [117]. Основную часть миелина составляют липиды, асимметрично распределенные в бислое [118, 119]. К остальной части относятся разнообразные структурные белки. Сложность структуры миелина не дает возможности произвести исследования ориентации каротиноидов в модельных системах (плоских слоев или липосом). Поэтому наиболее подходящим методом исследования являются измерения ОФР с миелина нативных нервных волокон.
Для каждого набора из 4-х спектров КР (рис. 3.16) коэффициенты упорядоченности могут быть рассчитаны, которые используются для построения ОФР. На рис. 3.18 искомые ОФР каротиноидов и липидов построены в полярных координатах. Нулевой угол соответствует направлению, перпендикулярному мембране. ОФР, построенная с использованием средних значений параметров упорядоченности показана в виде сплошной линии. Серым фоном обозначен диапазон изменения ОФР при варьировании параметров упорядоченности в пределах СОС. Видно, что каротиноиды расположены преимущественно перпендикулярно к поверхности бислоев. Отметим, что говоря об ориентации мы подразумеваем угол между ДМП молекулы (в случае каротиноидов) и осью ЛСК. Другими словами построенная ОФР описывает вероятность нахождения молекулы каротиноида с углом между ДМП и нормалью к мембране. Анализируя полученные данных мы можем предположить, что возможны два различных типа ОФР для каротиноидов в составе мембран миелина: