Содержание к диссертации
Введение
II. Литературный обзор. 7
II.1. Периферический вкусовой аппарат 7
II.1.1. Организация периферического вкусового органа 7
II.1.2. Вкусовые клетки I типа 8
II.1.3. Вкусовые клетки II типа II.1.3. Вкусовые клетки III типа 9
II.1.4. Серотонин как первичный медиатор вкусовой почки. 10
II.2. Потенциал зависимые Са2+-каналы 11
II.2.1. Классификация и номенклатура ПЗ Са2+-каналов 12
II.2.2. Строение ПЗ Са2+-каналов 14
II.2.3. Пресинаптические ПЗ Ca2+-каналы
II.2.3.1. ПЗ вход Ca2+ и секреция нейротрансмиттера 16
II.2.3.2. Регуляция пресинаптических ПЗ Ca2+ каналов 17
II.3. Гептаспиральный рецептор CASR. 24
II.3.1. Модуляция ионных каналов при участии CASR 26
II.4. Ca2+-активируемые Cl- -каналы 26
II.4.1. Семейство Ca2+-активируемыех Cl- -каналов Ano 27
II.4.2. Ano 1 и Ano 2 28
III Материалы и методы. 31
III.1. Выделение вкусовых клеток. 31
III.2. Электрофизиология. 32
III.3. Мониторинг внутриклеточного кальция (Ca-imaging). 33
III.4 Фотолиз химических групп (uncaging) 34
III.5. Биосенсор серотонина. 34
IV. Результаты и их обсуждение . 36
IV.1. Потенциал зависимые Са2+-каналы вкусовых клеток типа III. 36
IV.2. Кальциевые сигналы, инициируемые ПЗ входом Са2+, во вкусовых клетках типа III 42
IV.4. Возможный механизм регуляции ПЗ Са2+-токов внеклеточным Са2+ 48
IV.5 Са2+-активируемые Cl--каналы вкусовых клеток 53
IV.5.1. Исследование Ano1 и Ano2 в гетерологической системе 54
IV.6 Распределение Са2+-активируемых Cl- токов в популяции вкусовых клеток 64
V. Заключение. 73
VI. Выводы 75
VII. Список литературы. 76
- Организация периферического вкусового органа
- Регуляция пресинаптических ПЗ Ca2+ каналов
- Мониторинг внутриклеточного кальция (Ca-imaging).
- Возможный механизм регуляции ПЗ Са2+-токов внеклеточным Са2+
Организация периферического вкусового органа
Морфологически клетки II типа характеризуются более светлой цитоплазмой, чем у клеток I типа. Клеточная группа II включает, по меньшей мере, три субпопуляции клеток каждая из которых специализируется в распознавании либо сладких, либо горьких вкусовых веществ, либо вкусовых стимулов категории умами (некоторые аминокислоты, пептиды, нуклеотиды). Клетки соответствующей субпопуляции экспрессируют гены вкусовых гептаспиральных рецепторов (G-protein-coupled receptors), составляющие два семейства T1R и T2R. Семейство T1R включает три рецептора T1R11R3, которые формируют во вкусовых клетках один гетродимерный рецептор сладкого (T1R2+T1R3) и один гетродимерный рецептор умами (T1R1+T1R3) (Shigemura, Ninomiya, 2016). Семейство T2R включает горько-чувствующие рецепторы, которые никогда не коэкспрессируются с T2R рецепторами (Nelson et al., 2001).
В клетках II типа функциональны ПЗ Na+- и K+- каналы (Medler et al, 2003;. Romanov, Kolesnikov, 2006) и поэтому они электрически возбудимы (Yoshida et al, 2006). Трансдукция сладких, горьких и умами веществ включает активацию T1R или T2R рецепторов, которые, стимулируют G-белок-зависимую активацию PLC2, генерацию IP3, стимуляцию IP3 рецепторов с последующим высвобождением Сa2+ из внутриклеточных депо, который, в свою очередь, активирует Са2+-зависимые катионные каналы TRPM5. Это вызывает деполяризацию клеток II типа, генерацию потенциала действия, высвобождение афферентного нейротрансмиттера АТР через АТР-проницаемые ионные каналы CALHM1 и стимуляцию ионотропных пуринерецепторов P2X2/P2X3 на нервных окончаниях афферентного вкусового нерва (Finger et al., 2005: Romanov et al., 2007, Taruno et al., 2013; Shigemura, Ninomiya, 2016).
Клетки типа III являются промежуточными клетками по ультраструктурным критериям, их ядра аналогичны ядрам темных клеток, но протоплазма клеток светлее, чем у темных клеток. Клетки III типа имеют идентифицируемые синаптические контакты с вкусовыми нервами, предполагается, что они являются кисло-чувствующими клетками, т.к. они экспрессируют несколько типов ионных каналов, в частности Pkd2L1/Pkd1L3 гетеромер, активность которых зависит от внеклеточного рН и которые рассматриваются в качестве кандидатов на роль кисло-чувствующего рецептора. Так, с генетически модифицированные мыши, вкусовые почки которых лишены Pkd2L1-положительных клеток, не способны ощущать кислым стимулы (Shigemura, Ninomiya, 2016). В качестве других кандидатов на роль кислых рецепторов также предлагались протон-активируемые ионные каналы (Ugawa et al., 2003; Richter et al., 2004) и цикло-нуклеотид зависимые К+ каналы HCN типа (Lindeman, 2001, Chandrashekar et al., 2009). Кроме того, слабые кислоты также могут активировать кисло-чувствующие клетки, проникая через клеточную мембрану и подкисляя цитозоль, что приводит к закрытию К+ каналов покоя и деполяризации мембраны (Lin et al., 2004; Richter et al., 2004). Такое разнообразие механизмов чувствительности к кислому свидетельствует о сложности механизмов вкусовой трансдукции.
Клетки III типа электрически возбудимы и способны генерировать потенциалы действия (Yoshida et al, 2006), поскольку они обладают функциональными ПЗ Na+, K+ и Ca2+ каналами (Medler et al., 2003; Romanov, Kolesnikov, 2006).
Серотонин является первым нейротрансмиттером, идентифицированным в периферическом вкусовом органе. Присутствие моноаминов во вкусовых почках было обнаружено у лягушек, кроликов, и рыб (Nada and Hirata,1977). Иммунореактивность к серотонину продемонстрирована для вкусовых клеток обезьян, кроликов, мышей и крыс (Kim and Roper, 1995). Клетки III типа содержат серотонин и фермент его синтеза AACD (Aromatic L-amino acid decarboxylase) (Yee et al., 2001; DeFazio et al., 2006). Функциональные исследования с использованием биосенсоров серотонина показали, что он высвобождается из вкусовых почек в ответ на вкусовой стимул (Huang et al., 2005). Также показано, что в содержащих серотонин вкусовых клетках функционирует транспортер серотонина SERT (sodium-dependent serotonin transporter) (Ren et al., 1999). Следовательно, серотонин может использоваться как нейротрансмиттор между вкусовыми клетками III типа и вкусовыми нервами.
Гептаспиральный рецептор серотонина 5-HT1a экспрессируется в субпопуляции вкусовых клеток, не содержащих сам серотонин (Kaya et al., 2004), а аппликация агонистов 5-HT1a рецептора ингибирует Ca2+-активированный K+ и ПЗ Na+ токи (Herness and Chen, 2000). Эти результаты свидетельствуют о том, что серотонин может выполнять функцию паракринного модулятора клеток вкусовой почки. Еще один рецептор серотонина, 5-HT3 идентифицирован в нервных окончаниях вкусового нерва (Kaya et al., 2004), на основании чего считалось, что серотонин, высвобождаемый клетками типа III, мог бы передавать сенсорный сигнал к вкусовому нерву. Однако, поведенческие тесты не выявили изменения вкусовой чувствительности у мышей, с нокаутированным геном 5-HT3a (Finger et al., 2005). Таким образом, рольсеротонина как афферентного нейротрансмиттера сомнительно, хотя он может быть ко-трансмиттером, а также может служить паракринным фактором, модулирующим активность вкусовых клеток типа II (Chaudhari, Roper, 2010).
Регуляция пресинаптических ПЗ Ca2+ каналов
Семейство аноктаминов включает 10 представителей (Ano1 – Ano10), у которых отсутствует гомология с другими известными ионными каналами (Kunzellmann, 2011). В основу названия семейства аноктаминов (anoctamin) положена игра слов: «AN» – от сокращенного анион-селективные каналы с восемью – «ОСТ» трансмембранными областями. В 2008 сразу три группы независимо друг от друга опубликовали результаты, указывающие на то, что Ano1 отвечает требованиям, позволяющим рассматривать его как кандидата на роль Ca2+-активируемого Cl--канала (Caputo et al., 2008, Yang et al., 2008; Schroeder et al., 2008). Члены семейства Ano обладают широким спектром функций. Так, например, Ano6 сначала был описан как Ca2+-активируемый Cl--канал, активирующийся в процессе апоптоза и набухания клеток (Schreiber et al., 2010; Martins et al., 2011), затем как Ca2+-активируемый белок, осуществляющий транслокацию фосфолипидов между двумя сторонами плазматической мембраны (Suzuki et al. 2010) и впоследствии как неселективный катионный канал, проницаемый для Ca2+ (Yang et al., 2012).
Белки семейства Ano присутствуют во всех тканях, обычно 4 – 7 вариантов Ano присутствуют в каждом клеточном типе (Schreiber et al., 2010). В нашей лаборатории было установлено, что во вкусовом эпителии мыши присутствуют Ano 1, Ano 2, Ano7, Ano9 и Ano10 (Cherkashin et al., 2016). Рисунок 2. Предполагаемая молекулярная организация Ano (Kunzellmann, 2011) Ano функционирует как гомо-, а возможно и гетеродимер. Необычным свойством для ионных каналов является то, что две предполагаемые поры расположены в близко к липофильному окружению плазматической мембраны.
Ano1 и Ano2 формируют Ca2+-активируемые Cl--каналы для которых характерно сильная потенциал-зависимость, проявляющаяся в форме выходного выпрямления вольт-амперной характеристики и медленной активации в ответ на деполяризацию мембраны времени активацией (Pedemonte, Galietta, 2014). Ano1 был описан как Ca2+-активируемый Cl--канал малой проводимости, который демонстрирует биофизические и фармакологические свойства, соответствующие свойствам эндогенных Ca2+-активируемых Cl--каналов, обнаруженных во многих различных тканях (Yang et al., 2008; Schroeder et al., 2008; Caputo et al., 2010). Было выяснено, что Ano1 имеет 10 трансмембранных доменов (Kunzellmann, 2011).
В целом селективность Ano каналов описывается рядом I- Br- Cl- F-, который, однако, может меняться. Так, установлено, что селективность Ano1 к меняется HCO3- при повышении концентрации внутриклеточного Ca2+., вероятно, при участии кальмодулина (Kunzellmann, 2011). Для Ano2 также был обнаружен зависимый от времени сдвиг анионной селективности.
Одно из важнейших отличий между Ano1 и Ano2 каналами – чувствительность к Ca2+. У Ano2 она примерно на порядок ниже, чем у Ano1. Для активации Ano2 в гетерологической системе экспрессии требуются концентрации Ca2+ 1 мкМ (Pifferi et al., 2009; Stephan et al., 2009), тогда как Ano1 активируется при концентрациях 0.1 – 0.3 мкМ, в зависимости от сплайс-варианта (Ferrera et al., 2009). Скорее всего, Ano1 каналы присутствуют в эпителиальных клетках в постоянно активном состоянии, участвуя в непрерывной транспортной активности. Однако в обонятельных нейронах активация Ano2 может происходить лишь при повышении уровня Ca2+ в процессе внутриклеточной сигнализации (Rasche et al., 2010).
Хотя активация Ano1 требует повышения концентрации внутриклеточного Ca2+, этот процесс зависит от мембранного потенциала, так что при сильной деполяризации канал может переходить в открытое состояние даже в отсутствие Са2+ (Xiao et al., 2011). В физиологических условиях Ano1 функционирует при отрицательных мембранных потенциалах, которые требуют повышения внутриклеточного Ca2+ более чем на несколько мкМ. Помимо непосредственной активации Ano1 ионами Ca2+, его активность может модулироваться взаимодействием с цитоскелетом (2). Ряд фактов свидетельствует о том, что внутриклеточный АТФ потенциирует активность Ano-каналов, хотя до сих пор остается неясным обусловлена ли АТФ-зависимость фосфорилированием (Pedemonte, Galietta, 2014). Вопрос о вкладе в регуляцию Ano кальмодулина также остается дискуссионным (Kunzellmann, 2011).
Ano2 канал имеет функциональное значение в сенсорных системах. К настоящему времени установлено, что Ano2 экспрессирован в обонятельных нейронах (Sagheddu et al., 2010) и вомероназальных нейронах, отвечающих за детекцию феромонов (Dibattista et al, 2012), а также в сетчатке (Stohr et al, 2009). Предполагается, что в сетчатке Ano2 участвует в формировании хлорных каналов в синаптических терминалях фоторецепторных клеток.
В обонятельную трансдукцию вовлечены два типа каналов: катионные каналы, активируемые циклическими нуклеотидами, и хлорные каналы, активируемые Ca2+. Взаимодействие пахучего стимула с обонятельными рецепторами приводит к активации сигнального каскада, опосредованного G-белками, и приводящего в итоге к синтезу вторичного посредника цАМФ, контролирующего открытие цАМФ-активируемых катионных каналов. Открытие этих каналов приводит к входу экстраклеточного Ca2+ и деполяризации мембраны обонятельного нейрона. Повышение концентрации Ca2+ в цитоплазме способствует активации Ca2+-чувствительных хлорных каналов, выходу ионов хлора из клетки и дальнейшей деполяризации мембраны, что приводит, в конечном счете, к генерации потенциала действия. Молекулярная идентификация цАМФ-зависимых обонятельных каналов, открытых в 1987 году Накамурой и Голдом (Nakamura, Gold, 1987) была осуществлена в 1990 году. У мышей с нокаутом гена, кодирующего цАМФ-зависимый обонятельный канал, пропадала чувствительность к запахам (Dhallan et al, 1990). Что касается второго канала, вовлеченного в трансдукцию обонятельного стимула, а именно, Ca2+ зависимого хлорного канала, то его функциональная идентификация в обонятельных нейронах была осуществлена в 1991 году (Kleene, Gesteland) c применением методов электрофизиологии. И только через 20 лет была установлена природа молекул, ответственных за Ca2+ зависимый хлорный ток (Stephan et al, 2009). В 2009 были получены доказательства, что Ano2 может участвовать в формировании хлорного канала, вовлеченного в трансдукцию обонятельных сигналов (Stephan et al, 2009).
Мониторинг внутриклеточного кальция (Ca-imaging).
Семейство аноктаминов включает 10 представителей (Ano1 – Ano10), у которых отсутствует гомология с другими известными ионными каналами (Kunzellmann, 2011). В основу названия семейства аноктаминов (anoctamin) положена игра слов: «AN» – от сокращенного анион-селективные каналы с восемью – «ОСТ» трансмембранными областями. В 2008 сразу три группы независимо друг от друга опубликовали результаты, указывающие на то, что Ano1 отвечает требованиям, позволяющим рассматривать его как кандидата на роль Ca2+-активируемого Cl--канала (Caputo et al., 2008, Yang et al., 2008; Schroeder et al., 2008). Члены семейства Ano обладают широким спектром функций. Так, например, Ano6 сначала был описан как Ca2+-активируемый Cl--канал, активирующийся в процессе апоптоза и набухания клеток (Schreiber et al., 2010; Martins et al., 2011), затем как Ca2+-активируемый белок, осуществляющий транслокацию фосфолипидов между двумя сторонами плазматической мембраны (Suzuki et al. 2010) и впоследствии как неселективный катионный канал, проницаемый для Ca2+ (Yang et al., 2012).
Белки семейства Ano присутствуют во всех тканях, обычно 4 – 7 вариантов Ano присутствуют в каждом клеточном типе (Schreiber et al., 2010). В нашей лаборатории было установлено, что во вкусовом эпителии мыши присутствуют Ano 1, Ano 2, Ano7, Ano9 и Ano10 (Cherkashin et al., 2016). Рисунок 2. Предполагаемая молекулярная организация Ano (Kunzellmann, 2011) Ano функционирует как гомо-, а возможно и гетеродимер. Необычным свойством для ионных каналов является то, что две предполагаемые поры расположены в близко к липофильному окружению плазматической мембраны.
Ano1 и Ano2 формируют Ca2+-активируемые Cl--каналы для которых характерно сильная потенциал-зависимость, проявляющаяся в форме выходного выпрямления вольт-амперной характеристики и медленной активации в ответ на деполяризацию мембраны времени активацией (Pedemonte, Galietta, 2014). Ano1 был описан как Ca2+-активируемый Cl--канал малой проводимости, который демонстрирует биофизические и фармакологические свойства, соответствующие свойствам эндогенных Ca2+-активируемых Cl--каналов, обнаруженных во многих различных тканях (Yang et al., 2008; Schroeder et al., 2008; Caputo et al., 2010). Было выяснено, что Ano1 имеет 10 трансмембранных доменов (Kunzellmann, 2011).
В целом селективность Ano каналов описывается рядом I- Br- Cl- F-, который, однако, может меняться. Так, установлено, что селективность Ano1 к меняется HCO3- при повышении концентрации внутриклеточного Ca2+., вероятно, при участии кальмодулина (Kunzellmann, 2011). Для Ano2 также был обнаружен зависимый от времени сдвиг анионной селективности.
Одно из важнейших отличий между Ano1 и Ano2 каналами – чувствительность к Ca2+. У Ano2 она примерно на порядок ниже, чем у Ano1. Для активации Ano2 в гетерологической системе экспрессии требуются концентрации Ca2+ 1 мкМ (Pifferi et al., 2009; Stephan et al., 2009), тогда как Ano1 активируется при концентрациях 0.1 – 0.3 мкМ, в зависимости от сплайс-варианта (Ferrera et al., 2009). Скорее всего, Ano1 каналы присутствуют в эпителиальных клетках в постоянно активном состоянии, участвуя в непрерывной транспортной активности. Однако в обонятельных нейронах активация Ano2 может происходить лишь при повышении уровня Ca2+ в процессе внутриклеточной сигнализации (Rasche et al., 2010).
Хотя активация Ano1 требует повышения концентрации внутриклеточного Ca2+, этот процесс зависит от мембранного потенциала, так что при сильной деполяризации канал может переходить в открытое состояние даже в отсутствие Са2+ (Xiao et al., 2011). В физиологических условиях Ano1 функционирует при отрицательных мембранных потенциалах, которые требуют повышения внутриклеточного Ca2+ более чем на несколько мкМ. Помимо непосредственной активации Ano1 ионами Ca2+, его активность может модулироваться взаимодействием с цитоскелетом (2). Ряд фактов свидетельствует о том, что внутриклеточный АТФ потенциирует активность Ano-каналов, хотя до сих пор остается неясным обусловлена ли АТФ-зависимость фосфорилированием (Pedemonte, Galietta, 2014). Вопрос о вкладе в регуляцию Ano кальмодулина также остается дискуссионным (Kunzellmann, 2011).
Ano2 канал имеет функциональное значение в сенсорных системах. К настоящему времени установлено, что Ano2 экспрессирован в обонятельных нейронах (Sagheddu et al., 2010) и вомероназальных нейронах, отвечающих за детекцию феромонов (Dibattista et al, 2012), а также в сетчатке (Stohr et al, 2009). Предполагается, что в сетчатке Ano2 участвует в формировании хлорных каналов в синаптических терминалях фоторецепторных клеток.
В обонятельную трансдукцию вовлечены два типа каналов: катионные каналы, активируемые циклическими нуклеотидами, и хлорные каналы, активируемые Ca2+. Взаимодействие пахучего стимула с обонятельными рецепторами приводит к активации сигнального каскада, опосредованного G-белками, и приводящего в итоге к синтезу вторичного посредника цАМФ, контролирующего открытие цАМФ-активируемых катионных каналов. Открытие этих каналов приводит к входу экстраклеточного Ca2+ и деполяризации мембраны обонятельного нейрона. Повышение концентрации Ca2+ в цитоплазме способствует активации Ca2+-чувствительных хлорных каналов, выходу ионов хлора из клетки и дальнейшей деполяризации мембраны, что приводит, в конечном счете, к генерации потенциала действия. Молекулярная идентификация цАМФ-зависимых обонятельных каналов, открытых в 1987 году Накамурой и Голдом (Nakamura, Gold, 1987) была осуществлена в 1990 году. У мышей с нокаутом гена, кодирующего цАМФ-зависимый обонятельный канал, пропадала чувствительность к запахам (Dhallan et al, 1990). Что касается второго канала, вовлеченного в трансдукцию обонятельного стимула, а именно, Ca2+ зависимого хлорного канала, то его функциональная идентификация в обонятельных нейронах была осуществлена в 1991 году (Kleene, Gesteland) c применением методов электрофизиологии. И только через 20 лет была установлена природа молекул, ответственных за Ca2+ зависимый хлорный ток (Stephan et al, 2009). В 2009 были получены доказательства, что Ano2 может участвовать в формировании хлорного канала, вовлеченного в трансдукцию обонятельных сигналов (Stephan et al, 2009).
Возможный механизм регуляции ПЗ Са2+-токов внеклеточным Са2+
Этот вывод подтверждался изменениями иономицин-индуцируемых токов, вызванными эквимолярной замены NaCl на NaMeSO3 (n=3) (Рис. 23a). Для генерации вольт-амперных характеристик клетки поляризовались пилообразным напряжением (1 мВ/мс) в пределах от -80 до 50 мВ. В контроле клетки показывали почти линейные вольт-амперные кривые с наклоном 90 – 150 пСм (Рис. 23a, б, кривая 1). В присутствии 5 мкМ иономицина проводимость плазмолеммы заметно возрастала до 4 – 6 пСм (Рис. 23а, б, кривая 2). Когда NaCl в наружном растворе заменялся на NaMeSO3, потенциал реверсии интегрального тока сдвигался на 27 – 30 мВ вправо (Рис. 23а, б, кривая 3), указавая на анионную природу Са2+-зависимых токов. В согласии с этим выводом анионный блокатор 9-AC подавлял иономицин-индуцированный ток потенциал-зависимым образом (Рис. 23а, б, кривая 4).
Представленные данные свидетельствовали о том, что CaCC функциональны в клетках типа I. Чтобы оценить вклад Ano-каналов в Са2+ активируемые анионные токи, анализировалась их чувствительность к T16
Оказалось, что иономицин-индуцированные токи не подавлялись при аппликации 10 мкМ T16, в отличие от 9-AC (n=4) (Рис. 23б). Следует, однако, отметить, что в соответствии с литературными данными эффекты T16 могут развиваться медленно и проявляются при предынкубации Ano1 положительных клеток в присутствии этого блокатора в течение нескольких минут (De La Fuente et al., 2008). В силу этого, нами рассматривалась вероятность, что эффекты T16 на вкусовых клетках развивались медленно и были неочевидны на фоне инактивации Са2+-активируемых Cl--токов (Рис. 23а, в). В ряде случаеы клетки типа I предварительно инкубировались в присутствии 10 мкМ Т16 в течение 2 мин перед стимуляцией. В трех клетках токи покоя были достаточно стабильны при -50 мВ в присутствии 10 мкМ T16. При аппликации иономицина (1 мкМ) эти клетки отвечали входящими токами величиной 40-60 пА. Эти ответы эффективно подавлялись ингибитором Ca2+-активируемых Cl--каналов CaCCinh-A01 (100 мкМ) (Рис. 23г), что указывает на то, что CaCC были активны в присутствии Т16. Учитывая эффективное ингибирование рекомбинантного Ano1 в присутствии 10 мкМ Т16 (Рис. 21а-в), представляется маловероятным, что во вкусовых клетках этот анионный канал полностью нечувствителен к специфическому ингибитору. Таким образом, отсутствие детектируемых ингибирующих эффектов Т16 на Са2+-активируемые Cl--токи (Рис. 23в, г) свидетельствует о том, что Ano1 либо не функционален во вкусовых клетках типа I, либо не играет существенной роли в переносе анионных токов Са2+-зависимым образом.
Вкусовые клетки типа II. При анализе клеток типа II было необходимо учесть, что они экспрессируют неселективные каналы CALHM1 (calcium homeostasis modulator 1), которые переносят большой (2 – 4 нА) выходящий ток при положительных потенциалах (Taruno et al., 2013). Так как эти токи были нестабильны при последовательной деполяризации, надежная идентификация относительно небольшой Са2+-зависимой компоненты интегрального тока была невозможна. Между тем, CALHM1 каналы демонстрируют сильное выходное выпрямление (Ma et al., 2012), обеспечивая возможность обнаружения Са2+-зависимых токов при отрицательных потенциалах. Следуя этой логике, мы не генерировали вольт-амперные характеристики в клетках II типа и регистрировали лишь токи покоя в контроле и при инициации внутриклеточных Са2+-сигналов иономицином или путем высвобождающей Са2+ из NP-EGTA, фотолиз которого инициировался импульсами ультрафиолета. Поскольку клетки типа II экспрессируют Са2+-активируемый катионный канал TRPM5 (Zhang et al., 2007), мы ожидали, что увеличение концентрации Са2+ в цитозоле должно активировать как минимум TRPM5-зависимые токи. Если Ano1 и/или Ano2 функциональны в клетках II типа, они могли бы внести свой вклад в электрические ответы клеток на повышение внутриклеточного Са2+. Оказалось, что УФ-импульсы (4 с) вызвали токи величиной 500 – 800 пА в 8 из 13 клеток типа II, которые показывали стабильные токи покоя при -70 мВ (Рис. 24а). Специфический блокатор TRPM5 каналов TPPO (100 мкМ) (Palmer et al., 2010) ожидаемо подавлял эти Са2+-индуцируемые токи, причем практически полностью (Рис. 24а), свидетельствуя о преимущественном вкладе TRPM5. Эти данные свидетельствовали о том, что либо CaCC не были функциональны в клетках типа II, либо их вклад в Са2+-зависимый ток был слишком мал, чтобы быть достоверно детектируемым на фоне большого тока, опосредованного TRPM5. Чтобы проверить вторую возможность, мы провели следующие эксперименты. Клетки типа II предварительно инкубировались в присутствии 100 мкM TPPO в течение 30 с, чтобы ингибировать активность TRPM5, а затем стимулировались 5 мкМ иономицина в присутствии блокатора TRPM5. При таком протоколе вкусовые клетки (n=5) отвечали на стимуляцию генерацией небольшого входящего тока порядка 30 – 50 пА, который блокировался 1 мМ 9-AC (Рис. 24б).
Следует отметить, что анионный блокатор 9-АС практически не влиял на TRPM5-опосредованные токи (n=3) (Рис. 24в). Поэтому чувствительность к 9-AC остаточных токов, регистрировавшихся в условиях блокады TRPM5 (Рис. 24б), не может быть объяснена тем, что TRPM5 каналы были неполностью заблокированны в присутствии 100 мкM TPPO, в то время как добавление 9-AC вызвало полное их их ингибирование. Таким образом, представленные результаты (Рис. 24а-г) можно рассматривать как убедительное свидетельство того, что CACC функциональны во вкусовых клетках типа II. Интересно, что электрические ответы клеток на иономицин, регистрировавшиеся в присутствии TPPO, полностью подавлялись в присутствии 10 мкМ T16 в 4 клетках из 7 исследовавшихся (Рис. 24г), в то время как ответы 3 оставшихся были T16-нечувствительны, но ингибировались 100 мкМ CaCinh-A01 (не показано). Эти данные позволяют прийти к заключению, что Ano1 ответственнен за генерацию Са2+-активируемых анионных токов примерно в половине клеток типа II, в то время как оставшаяся субпопуляция этих клеток использует САСС иного типа, скорее всего, Ano2.