Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1. Колебательная спектроскопия 15
1.1.1. Комбинационное рассеяние света 16
1.1.2. Общие принципы комбинационного рассеяния света 17
1.1.3. Резонансное комбинационное рассеяние света 19
1.1.4. Метод когерентного антистоксового рассеяние света - КАРС 20
1.2. Инфракрасная спектроскопия 21
1.2.1.Общие принципы инфракрасной спектроскопии 21
1.2.2. ИК-спектроскопия в исследовании полипептидов и белков 22
1.3. Техника эксперимента ИК-спектрометрии поглощения 25
1.3.1. Дисперсионные ИК-спектрофотометры 25
1.3.2. Техника ИК-Фурье спектроскопия 26
1.4. Аналитический потенциал ИК-Фурье спектроскопии в исследовании биологических молекул 27
1.5. Другие методы исследования биологических молекул, использующие ИК-спектры 28
1.5.1. Метод нарушенного полного внутреннего отражения 30
1.6. Эмиссионная ИК-Фурье спектроскопия 31
1.6.1. Термостимулированная ИК-эмиссионная спектроскопия 31
1.6.2. Тепловая инфракрасная эмиссионная спектроскопия и диагностика вещества 34
1.6.3. Техника эксперимента эмиссионной ИК-спектрометрии 36
1.7. Нелинейная спектроскопия в диагностике вещества 38
1.8. Основная концепция нелинейной оптики 38
1.8.1. Модели гармонического осциллятора 39
1.9. Биофизическая модель бактериородопсин 50
1.9.1. Интермедиаты и фототцикл бактериородопсина 51
1.9.2. Применение ИК - Фурье спектроскопии в исследовании механизма функционирования бактериородопсина 52
1.9.3. Применение ИК-Фурье спектроскопии в исследовании вторичной структуры БР 55
1.9.4. Дифференциальная ИК-Фурье спектроскопия 56
1.9.5. Низкотемпературная дифференциальная ИК-Фурье спектроскопия 57
1.10. Методы отнесения полос в дифференциальном спектре 59
1.10.1. полосы хромофора 60
1.10.2. полосы, обусловленные колебаниями боковых аминокислотных остатков 60
1.10.3. Изотопные замещения 61
1.10.4. Генетические замещения 61
1.10.5. ИК-Фурье спектроскопия о роли карбоксильных остатков в фотоцикле бактериородопсина 62
1.10.6. ИК-Фурье спектроскопия в определении активного центра БР 64
1.10.7. ИК-Фурье спектроскопия в определении роли триптофанов 65
1.10.8. ИК-Фурье спектроскопия в определении роли пролиновых остатков 66
1.10.9. Дифференциальная ИК-Фурье спектр-я в определении роли молекул внутренней воды 66
1.11. Динамическая спектроскопия в исследовании возбужденных состояний бактриородопсина 70
1.11.1. Линейные методы:флэш-фотолиз и комбинационное рассеяние света с высоким временным разрешением 70
1.11.2. Нелинейные методы в исследовании бактериородопсина 73
1.11.2.1. Динамическая спектроскопия КАРС 73
1.11.2.2. ИК-спектросокпия «возбуждения –зонлирования» с использованием короткоимпульсных ИК-лазеров 74
1.12. Проблемы первичной фотофизики бактериородопсина 76
1.12.1. Нерешенные вопросы бактериородопсина/ ИКФС/ мотивация данной работы/ возникшие проблемы с связи с феноменом стимулированного ИК-излучения 77
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 78
2.1. Объекты исследования 78
2.2. Приготовление пурпурных и апомембран бактериородопсина 79
2.2.1. Приготовление пленок исследуемых образцов 79
2.2.2. Приготовление растворов аминокислот 81
2.3. Приборы и техника эксперимента 81
2.3.1. Резонансная спектроскопия комбинационного рассеяния света 82
2.3.2. ИК-Фурье спектроскопия 82
2.3.2.1.ИК-Фурье спектроскопия поглощения 83
2.3.2.2. Эмиссионная ИК-Фурье спектроскопия 84
2.3.2.3. Временное разрешение в эмиссионной спектрометрии 84
2.4. Анализ результатов 85
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 86
3.1. Исследование энергетических и спектральных параметров ИК-эмиссии образца БР, возбуждаемого широкополосным видимым светом умеренной мощности 89
3.2. Исследование ИК-эмиссии ретиналя в условиях резонанса и вне резонанса с полосой электронного поглощения 93
3.3. Исследование ИК-эмиссии ретиналя в условиях колебательного возбуждения низко энергетичными ИК-квантами 101
3.4. Исследование спектральных характеристик ИК-эмиссионного отклика родамина 6Ж 103
3.5. Исследование спектральных характеристик и излучающих состояний в спектрах ИК -эмиссии бактериородопсина 108
3.5.1. Определение колебания хромофора в спектрах эмиссии бактериородопсина 110
3.5.2. Исследование колебаний опсина в спектрах ИК-эмиссии бактериородпсина 114
3.5.3. Изучение излучательных свойств образцов аминокислот 116
3.5.3.1. Исследование спектрального поведения L-лизина монохлорида при селективном колебательном возбуждении отдельных репортерных групп 119
3.5.3.2. Исследование действия видимого света на аминокислоты 122 127
3.6. Исследование природы ИК – эмиссионного отклика исследуемых образцов
3.7. Исследование энергетических характеристик ИК-эмиссионного отклика. Квадратичная зависимость ИК-эмиссионного сигнала от мощности дейсвующего света. 130
3.8. Исследование когерентных свойств стимулированного видимым светом ИК-излучения 135
3.9. Изучение возможности получения временного разрешения при использовании ИКЭС 138
ГЛАВА 4. Изучение возможностей практического применения икэс на разных образцах 148
4.1. Применение ИКЭС для изучения свойств плазматических мембран бактерий 149
4.2. Потенциальная возможность применения ИКЭС для изучения целостных тканей растений 153
4.3. Изучение свойств вязкой нефти 159
4.4. Изучение возможности создания на новом принципе устройства для регистрации спектров ИК-эмиссии 160
Заключение 162
Выводы 164
Список литературы 16 6
Cписок работ автора 216
Благодарности 224
- ИК-спектроскопия в исследовании полипептидов и белков
- ИК-Фурье спектроскопия о роли карбоксильных остатков в фотоцикле бактериородопсина
- Эмиссионная ИК-Фурье спектроскопия
- Исследование спектрального поведения L-лизина монохлорида при селективном колебательном возбуждении отдельных репортерных групп
ИК-спектроскопия в исследовании полипептидов и белков
В КР спектроскопии образец облучается монохроматическим (лазерным) видимым светом. Классическая теория основана на трёх положениях: молекулы рассеивают свет вследствие колебаний дипольного момента молекулы, индуцируемого полем падающей световой волны; падающий видимый свет рассеивается в основном электронной оболочкой молекулы (т. к. ядра атомов, образующие "скелет" системы, смещаются в поле световой волны незначительно); комбинационное рассеяние света возникает в результате электронно-колебательного взаимодействия в молекуле (взаимное расположение ядер определяет то внутреннем поле, в котором находится электронное облако). Основные принципы, на которых строится классическая и квантовая теория комбинационного рассеяния света изложены в большом числе оригинальных работ и монографий [Плачек, 1935; Брандмюлер, Мозер, 1964; Фабелинский, 1965; Сущинский, 1966] .
Кратко: под действием световой волны электроны в молекуле смещаются, и она приобретает дипольный момент р = 80аД (1.0) где Е - напряженность электрического поля световой волны, а - поляризуемость, связанная со строением молекулы и характеризует способность электронов в молекуле смещаться относительно ядер. Электрическое поле Е осциллирует с частотой V0 падающего света Е = EQCOS (27TV0t) (11) и заставляет индуцированный дипольный момент также осциллировать с такой же частотой. Согласно классической теории осцилляции диполя будут излучать энергию. Следовательно, свет с частотой V0 распространяется во всех направлениях (за исключением направлений параллельных диполю). Классическая теория дает величину интенсивности рассеянного света 1= 16 7Г4/3 c3 (v4p20), (1.2) где р0 - амплитуда наведенного дипольного момента. Тепловые колебания различных молекул не согласованы друг с другом и имеют случайную фазу. Молекулы, поляризуемость которых отличается от средней поляризуемости, распределены по объему вещества случайным образом. Это приводит к флуктуациям показателя преломления, и, соответственно, нарушению оптической однородности среды. И, как следствие - к рассеянию света.
Бльшая часть рассеянного образцом излучения будет иметь ту же частоту, что и падающая - процесс известен как Рэлеевское рассеяние. Тем не менее, некоторое количество излучения, рассеянного образцом, примерно один фотон из миллиона (0.0001 %) - будет иметь частоту, смещенную по отношению к частоте исходного излучения лазера. Комбинационное рассеяние света может понято классически, как обусловленное модуляцией света электронной плотности и, соответственно, р0 молекулярной поляризуемости вследствие колебаний ядер.
Сложные колебательные движения атомов, образующих молекулу, можно представить как суперпозицию простых гармонических колебаний, которые называются нормальными колебаниями. Каждое гармоническое колебание совершается с определенной амплитудой и частотой QI по закону. Qi = Q0i cos (QIt), (1.3) где Q0i - амплитуда i-ого нормального колебания. Оно совершается так, как если бы в системе не происходило никаких других колебаний. Частоты нормальных колебаний молекул лежат в инфракрасной области спектра. Нормальное колебание (в нем участвуют все атомы данной молекулы) описывается одной переменной QI - нормальной координатой. Молекула, состоящая из N0 атомов, имеет 3 N0 - 6 нормальных колебаний. Если в молекуле возбуждено нормальное колебание с номером / , то поляризуемость а в этом случае уже не будет постоянной величиной и может быть представлена суммой а = а0 + (da/dQi) Q, + … (1.4) Напряженность поля монохроматической волны может быть представлена в виде Е = Е0 cos cot, где Ео- амплитуда, а со - частота световой волны, то р=г0аЕ=р=г0а E0 cos Ш + e0E0 oi (da./dQl) cos((j) +Ц) t+ Е0Е02т (da/dQl) cos(& -Ц) t. (1.5)
Периодически изменяющийся со временем электрический диполь сам является источником электромагнитного излучения, а частота излучаемых им волн равна частоте колебаний диполя. Сложное изменение дипольного момента молекулы со временем в соответствии с соотношением (1.5) приводит к возникновению несмещенного по частоте рассеянного (рэлеевского) излучения. Два других колебания приводят к возникновению рассеянных волн с частотами со ± Q, , волн комбинационного рассеяния света.
Эдсол [Edsall, 1936] был пионером по применению спектральных исследований для изучения ионизации водных растовров аминокислот как функции рН, используя в 1936 году метод КР.
На раннем этапе возможности метода обыкновенного комбинационного рассеяния света ограничивались прозрачными и бесцветными веществами. Тогда важно было найти способ получения спектров непрозрачных веществ. Эффект резонансного усиления рассеяния света был открыт П.П. Шорыгиным [Шорыгин, 1973] при изучении спектров КР окрашенных соединений. При приближении возбуждающей линии к области собственного электронного поглощения вещества наблюдается значительно более сильное увеличение интенсивности рассеянного света по сравнению с нерезонансными условиями. Эффект гигантского усиления сигнала КР обусловлен тем, что интенсивность отдельных линий КР пропорциональна помимо вероятности виртуального поглощения еще и показателю поглощения, отвечающего длине волны возбуждающего света. Как хорошо известно, поляризуемость (а) молекул связана с показателем преломления среды (n) посредством соотношения n2 = 1 + Na (1.6), где N - число частиц в единице объема. Изменения поляризуемости могут наступить, если изменяется конфигурация отдельных частей, составляющих молекулу. Например, атомы в молекулах непрерывно совершают сложные колебания, связанные с хаотическим тепловым движением. При этих движениях облегчается или затрудняется смещение электронов, т.е. меняется их поляризуемость. В этом случае можно усилить сигнал отдельных компонентов в сложной смеси, что успешно используется при исследовании хромофор-содержащих белков (спектр резонансного комбинационного рассеяния света (РКРС) обусловлен только хромофором) [Callender, 1977; Carey, 1978]. В исследовании бактериородопсина и других ретиальсодержащих белков РКРС стал идеальным средством для исследования структуры хромофора в его физиологическом окружении. Спектр РКРС содержит богатую информацию об изомерной форме и конформации полиеновой цепи ретиналя, о концевых группах хромофора и его окружения, а также о взаимодействии хромофора с белком или раствором [Braiman, Mathies, 1980; Braiman, Mathies, 1982; Hildebrandt, Stockburger, 1984].
Среди современных методов колебательной спектроскопии, в которых достигнуты значительные успехи, выделяется спектроскопия когерентного антистоксова рассеяния света, или как ее часто называют, КАРС-спектроскопия [Ахманов, 1979; Ахманов, Коротеев, 1981; Фишман, 2001]. Именно в антистоксовой области спектра отсутствует мешающая проведению экспериментов с помощью метода РКРС люминесценция веществ, и наиболее ярко проявляются колебательные моды молекул. Суть этого метода состоит в том, что молекула одновременно облучается двумя лазерами с частотами излучения со 1 и cos, а рассеяние наблюдается на частоте 2co1 - Ю2: обычно одна из частот фиксируется, а другая перестраивается, и линии КАРС появляются при условиях равенства 2co1—СО2 частотам внутримолекулярных переходов. Рассеяние на согласованных по фазе (когерентно возбуждённых колебаниях, т.е. в генерационном режиме) приводит к значительному росту интенсивности рассеянного света, которое по оценкам может составлять до 1% от интенсивности возбуждающих волн [Сущинский, 1966].
ИК-Фурье спектроскопия о роли карбоксильных остатков в фотоцикле бактериородопсина
Описанную схему принято называть схемой активной спектроскопии рассеяния света. Рассеянный сигнал, получаемый в схеме активной спектроскопии, как в стоксовой, так и в антистоксовой области, существенно превышает уровень сигнала, получаемого в спектроскопии спонтанного КР. Важной особенностью когерентного варианта активной спектроскопии оказывается то обстоятельство, что здесь в отличие от спонтанного КР индикатриса рассеяния существенно анизотропна. Действительно, сфазированные двумя мощными волнами молекулярные колебания представляют собой осциллирующую решетку, характеризуемую волновым вектором q = k 1 – k 2 где k 1 и k 2 волновые векторы с частотами 1 и 2 .Максимум рассеяния пробного луча в стоксову область будет наблюдаться когда фазы всех волн согласованны между собой k – k c = q = k 1 – k 2 Максимум антистоксова рассеяния будет определяться другими условиями k a – k = q = k 1 – k 2 . Направления k, k c, k 1 ,k 2, вдоль которых выполняются эти условия, принято называть направлениями фазового синхронизма. В остальных же направлениях когерентное рассеяние мало. Когерентность - это войство, присущее вынужденному излучению. В результате рассеянное на когерентных молекулярных колебаниях излучение представляет собой хорошо пространственно коллимированный, практически полностью когерентный пучок, интенсивность которого составляет приблизительно 1% интенсивности пробного пучка.
При смешивании двух световых волн образуются биения на разностных частотах, включая комбинации, соотевтсвующие обретонным колебаниям молекул. Так, максимальная разностостная частотая для видимого света будет равна 12500 см -1. Биения на этой частоте смогут резонансно возбудить напрямую 12 обертон колебательной моды, например, 1041 см-1 [ Pilling et al., 2013].
При фокусировке на образец света широкого спектрального диапазона, следует ожидать появление вторичного излучения в ИК – области спектра (ИК – эмиссия), которое будет обусловлено когерентными и некогерентными молекулярными колебаниями [ ] de Martini, 1966]. Когерентные молекулярные колебания будут давать отчетливые максимумы в спектре ИК – эмиссии, когда когерентные биения на разностных частотах возбуждающего света, будут равны частотам молекулярных колебаний. Можно предположить, что некогерентное излучение от источника света будет приводить к появлению фоновой ИК – эмиссии без отчетливых максимумов.
Вторичное фоновое излучение это отклик некогерентных молекулярных колебаний на некогерентное световое возбуждение. Как было отмечено ранее, длина когерентности для ксеноновой лампы несколько микрон и из этой области образца будет регистрироваться когерентная, а значит сфазированная ИК – эмиссия в направлениях, которые определены условиями фазового синхронизма. Когерентное ИК – излучение, обусловленное когерентным бигармоническим световым возбуждением - нелинейный процесс и для когерентной части ИК – эмиссии зависимость интеграла от мощности должна быть квадратичной. Фоновое излучение может быть частично сфазированным, если существуют межмолекулярные взаимодействия с областями вне микронной области когерентности.
В обычном КР вследствие электронно – ядерного взаимодействия часть энергии расходуется на спонтанное возбуждение колебательных состояний молекул (стоксов сдвиг). Потенциально, процесс КР может сопровождаться обратными переходами с возбужденных на равновесные колебательные уровней, что может стать причиной появления ИК – эмиссией. Вопрос о возможности регистрации ИК – эмиссии при комбинационном заселении горячих колебательных состояний молекул сводиться к светосиле ИК – Фурье спектрометра и чувствительности низкотемпературных приемников ИК – излучения, а так же к возможности создания заметной величины инверсной заселенности за счет спонтанного комбинационного рассеяния. Можно, сделать предположение, что если на некоторый объем образца во время излучения им стоксов попадает и возбуждающий свет, то возникнут биения на резонансной частоте колебательного перехода. Эти биения подействуют на молекулярные колебания, как резонансная возбуждающая сила. Возникшие при этом молекулярные колебания будут когерентными и сфазированными.
Нелинейные оптические явления наблюдали задолго до появления лазеров, например, они проявлялись при наблюдении явления двулечепреломления, обусловленного неодинаковой зависимостью показателя преломления для одной и той же частоты в одном и том же материале [ Wenjang, 1993; Yoon et al., 2012; Yuyuama t al., 2012; Pilling et al., 2013]. Поэтому не удивительно, что оптические материалы имеют свойства, которые зависят от электрического поля и именно через зависимость свойств веществ от электромагнитного поля становится известным, что они имеют оптическую нелинейность.
В общем виде явления, наблюдаемые в стационарных условиях могут быть описаны тензором диэлектрической поляризации [Ахманов, Хохлов, 1964; Ахманов, 1978] . Сложные тензорные коэффициенты у членов разложения высоких порядков называются нелинейными восприимчивостями. Они являются характеристиками реальных материалов и не только. Они отражают наличие множественных взаимодействий – на уровне квадруполей, октуполей и т.д.
Нелинейные материалы способны изменить характеристики не только внешнего излучения. В результате изменившихся характеристик внешнего излучения могут измениться и свойства самой нелинейной среды [Прохоров, 1983; Масалов и Чижикова, 2011] .
В современной оптике выделяют два наиболее крупных класса нелинейных механизмов: механизмы с нелинейным электронным откликом и механизмы с откликом ядер атомов и молекул [Масалов и Чижикова, 2011]. Для электронных нелинейностей характерен негармонический отклик электронов вещества на воздействие гармонического светового поля и как правило наблюдается при очень высоких мощностях света. В этом классе электронных нелинейностей выделяют группы резонанных и нерезонансных нелинейностей (по соотношению частоты светового поля и частот атомных переходов). Нерезонансная электронная нелинейность обусловливает генерацию второй гармоники, генерацию суммарных и разностных частот, многофотонное поглощение и ряд других нелинейных явлений. Резонансная электронная нелинейность обусловливает просветление среды, которое впервые наблюдали С.И Вавилов и В.Л.Левшин задолго до появления лазеров. В нелинейных механизмах с откликом ядер атомов и молекул движение электронов вещества под действием поля остается гармоническим, но это движение становится причиной перемещения атомных остовов, что проявляется в изменении оптических свойств среды. Среди этих механизмов определяют электрострикцию, ориентацию оптически анизотропных молекул, раскачку молекулярных колебаний и др. Эти механизмы обусловливают нелинейность показателя преломления сред, наведенное двулучепреломление, вынужденное рассеяние света, эффект Керра и другие явления. Как видно, нелинейные механизмы по своему разнообразию выходят за рамки влияния света на населенности энергетических уровней вещества. Многие нелинейные явления происходят вообще в отсутствие поглощения (генерация второй оптической гармоники, нелинейный показатель преломления и др.). В тех механизмах, которые сопровождаются изменением показателя преломления, всегда присутствуют эффекты самовоздействия световых волн, которые значительно могут изменить характеристики самих веществ.
Хотя нелинейная спектроскопия в принципе имеет дело с бесконечным числом новых параметров - нелинейных восприимчивостей различных порядков % (n) (со1……On), фактически в большинстве применяемых методов (когерентная активная спектроскопия рассеяния света, спектроскопия двухфотонного поглощения, нелинейная поляризационная спектроскопия, КАРС-спектроскопия и т.д.) исследуются резонансы в кубической нелинейной восприимчивости. Помимо информации о новых (нелинейных) параметрах вещества, нелинейная спектроскопия открывает принципиально новые возможности извлечения данных, являющихся традиционно предметом линейной спектроскопии, - данных о положении и структуре спектральных линий, сечениях рассеяния и т.д. Так, например, рассмотренная выше КАРС-спектроскопия, основанная на измерении зависимости антистоксова сигнала от разности частот со1 - со2 дает традиционные данные о комбинационных (рамановских) резонасах, чувствительность и спектральное разрешение при этом существенно превосходят таковые для спектросокпии обычного КР. Вместе с тем КАРС-спектроскопия оказывается и источником принципиально новой информации, поскольку кубическая восприимчивость слагается из нескольких составляющих -помимо резонансной восприимчивости х(3), связанной с колебательным резонансом, вклад в антистоксов сигнал дают четырехфотонные процессы, развивающиеся на быстрой нерезонансной электронной нелинейности х(3)нл [Ахманов 1979; Коротеев, Шумай, 1991].
В случае нелинейной ИК-эмиссионной спектроскопии может быть получена еще и дополнительная информация о времени жизни, столкновительных и релаксационных процессах.
Эмиссионная ИК-Фурье спектроскопия
Полностью - транс ретиналь, как и все его геометрические изомеры имеет низкий квантовый выход флуоресценции 10-4 [Takemura et al., 1978]. Отсутствие флуоресценции сильно поглощающей молекулы ретиналя означает, что энергия возбуждения преобразуется в иную форму. Известно, что все изомеры под действием УФ-света в растворах претерпевают фотохимическую реакцию цис-транс изомеризации. Эта реакция изомеризации выполняет в природных пигментах важную физиологическую функцию [Racker, W. Stoeckeniu, 1974; Spudich, Luecke, 2002]. Показано, спектроскопические и фотохимические свойства ретиналя сильно зависят от окружения. Особенности такого поведения ретиналя объясняются его достаточно сложной энергетической структурой, которая вплоть до 30000 см-1 имеет три низко -энергетических синглетных уровня S3 ( B u ( )), S2 (Ag ( )) и S1 (n ), а также триплетный уровень Т1. Электронная структура ретиналя наиболее тщательно исследовалась в последние десять лет самыми разными спектроскопическими и теоретическими методами. В результате было установлено, что в области энергии до 30 000 см-1 в полностью-транс ретинале существует три синглетных состояния (S3, S2 и S1) [Birge, et al. 1982] Хотя порядок их расположения все еще точно не установлен, предположительно считают, что расположение синглетных уровней может u ( ), Ag ( ) и n [Birge, et al. 1982] Первые два высоких уровня наиболее близко расположены между собой. При комнатной температуре энергия 0-0 перехода (397 нм) для S3 уровня ретиналя в гексане определяется величиной 2, 52 х 10 4 см-1, тогда как энергия 0-0 перехода (405 нм) для S2 уровня определяется 2, 47 х 10 4 см-1, то есть в этих условиях разница между уровнями S3 и S2 составляет порядка 500 см-1 [Warshel, Karpus, 1974; Yamagichi, Hamaguchi, 1998; Yamaguchi, Tahara 2003]
1Bu ( ) состояние представляет собой оптически разрешенный переход, тогда как сильный переход при поглощении 370-400 нм 1Ag ( ) запрещен в силу симметрии. Возбужденное синглетное n состояние происходит от карбонильной группы. Это состояние также оптически запрещено, поскольку в нем несвязанные n-орбитали локализованы на атоме кислорода и почти не перекрываются с электронными оболочками возбужденных л - орбиталей. Недавние флуоресцентные [Takeuchi, Tahara, 1997] и адсорбционные измерения [Yamagichi, Hamaguchi, 1998], выполненные с высоким временным разрешением показали, что после фотовозбуждения (S3) состояния заселяются три возбужденных 1Bu -подобное ( , S3 ), 1Ag - подобное (S2) и n (S1) состояния. Хотя S3 и S2 распадаются в течение 1 пикосекунды, а S1 заселяется на временной шкале десятки пикосекунд. Было показано также наличие триплетного состояния. В электронных спектрах S1 состояние проявляется слабее триплетного Т1 и S0 состояния. Триплетное Т1 (кмах = 450 нм состояние было обнаружено в ретинале с полностью-транс конфигурацией в S0 состоянии) [Yamaguchi, Hamaguchi, 1998]. Это Т1 состояние образуется под непосредственным освещением видимым светом в течение 50 нсек и является колебательно-возбужденным промежуточным триплетным состоянием. Оно распадается с константой 5 микросекунд только в основное S0 состояние. [Yamaguchi, Hamaguchi, 1998].
Таким образом, установлено, что ретиналь безизлучательно «релаксирует» в S0 состояние двумя путями: непосредственно с возбужденного синглетного состояния или через промежуточное, триплетное состояние.
На рис 18. приведено наиболее вероятное расположение энергетических уровней ретиналя, действительный порядок которых в настоящее время остается все еще не известным. Ранее динамические исследования сверхскоростной «pump-probe» и спектроскопией КАРС показали, что после поглощения видимого света Л =400 нм в течение пикосекунд заселяются все три синглетных S3 , S2 и S1 уровня, а релаксация включает в себя ряд процессов: колебательную релаксацию, внутреннюю и интерконверсию, люминесценцию и тепловое рассеяние энергии. Релаксация возбужденного полностью - транс ретиналя осуществляется двумя путями: по одному из них молекула практически мгновенно релаксирует из S3 в S2, и далее через внутреннюю конверсию переходит в S1 hot возбужденное состояние, из которого последующей интерковерсией переходит в триплетное Т1 состояние.
Схематическая диаграмма энергетическая, иллюстрирующая пути заселения и релаксации энергетических уровней. Схема адаптирована из ссылки [9]. Bu ( ) и S2 (Ag ( )) - оптически разрешенные переходы, разница в энергии между которыми составляет 500 см-1. S1 (n ) - оптически запрещенный (из-за симметрии уровня) /л hot переход. Триплетный уровень Т1 имеет - характер (А погл. = 445 нм).S1 и S -возбужденные синглетные состояния - оба заселяются непосредственно из S2 . Между S1 и S1 hot или S нет перехода. S через внутреннюю конверсию переходит в триплетное T hot состояние. Волнистые стрелки обозначают колебательные переходы: синие безилучательные; красные - излучательные переходы.
В триплетном состоянии может происходить изомерное превращение молекулы. По второму пути - молекула претерпевает структурные изменения в S2 состоянии и затем релаксирует в S1 и далее S0 состояние. На пути перехода из S3 в S1 отмечают существование двух промежуточных коротко живущих возбужденных (S1 hot и S ) состояния, которые характеризуются одной полосой при 1573 см С=С валентных колебаний. Эти состояния характеризуются разной полушириной и разделены между собой небольшим временным промежутком. Более позднее состояние может включать в себя смесь изомеров, а также триплетное состояние, характеризующееся полосой С=С валентных колебаний при 1555 см . Основным маркером синглетного и триплетного состояния является частота валентных С=С колебаний, характеризующая собой растяжение длины этой связи в полиеновой цепи (интенсивность этой полосы составляет половину интенсивности спектров КР и ИК - поглощения).
Было показано, что фотохимия ретиналя сильно зависит от свойств возбужденных синглетный состояний, а также от внешних факторов [Hudson, Kohler, 1974; Zgrabic et al., 2005]. В этом отношении показательным является имеющийся в литературе большой разброс по величине квантового выхода реакции фотоизомеризации ретиналя. Разброс данных сильно зависит от условий возбуждения, растворителя, температуры, растворенного в растворе кислорода, и возможно, даже от используемого метода [Hudson, Kohler, 1974]. Высокая чувствительность фотореакции прежде всего обусловлена сложной электронной структурой, включающей в себя большое число возбужденных состояний, которые еще могут флуоресцировать. В изомере полностью-транс ретиналя было обнаружено три (S3 , S2 и S1 ) флуоресцирующих при А,мах = 430 нм, 440 нм и 570 нм состояний, которые различаются не только по электронным спектрам, но и фото динамике [Hudson, Kohler, 1974; Takeuchi, Tahara, 1997].
ИК-Фурье спектр излучения молекулы полностью - транс ретиналя в 4000-500 см-1 области. Иллюстрация того, какие виды колебаний присутствуют в спектре ИКЭС. Наличие флуоресценции в высоковозбужденных S3 и S2 состояниях означает то, что относительно медленный процесс (10-9 с) флуоресценции способен конкурировать с более быстрым процессом безизлучательной деградации, осуществляющейся на временной шкале 10-11-10-13 с [Hudson, Kohler, 1974]. Замедление колебательной релаксации внутри возбужденного электронного уровня может происходить по причине либо низкого значения величины электронного фактора, либо низкого фактора Франка – Кондона (ФК), либо обоих этих факторов. Полагают, что причиной низкого электронного фактора является ортогональность волновых функций электронных переходов. Низкий же фактор ФК наблюдается в том случае, когда разница между нулевыми колебательными уровнями наиболее высоко лежащего и низко лежащего возбужденных синглетных состояний достаточно велика [Hudson, Kohler, 1974].
Что касается колебательной структуры возбужденных состояний ретиналя, в настоящее время они все еще слабо изучены и больше представлены в теоретических работах [Touw et al., 2004]. Данные об излучательной колебательной релаксации вовсе отсутствовали.
Исследование спектрального поведения L-лизина монохлорида при селективном колебательном возбуждении отдельных репортерных групп
На рис.30 представлен типичный дискретный спектр лизина, записанный при освещении светом ( 560 нм) с усреднением 400 сканов и спектральным разрешением 4 см . Сравнение полученного спектра со спектром ИК-поглощения лизина показало, что в спектре ИК-эмиссии (кривая 1б), воспроизводятся практически все линии на тех же частотах, что и в поглощении. Однако набор полос, как и относительное распределение интенсивности отличалось от того, что наблюдали при ИК-возбуждениии.
На рисунке 30 представлен спектр ИК-эмиссии лизина в растворе 1700-1000 см области с обозначением характеристичных колебаний лизина. В спектре раствора лизина были выявлены все рассмотренные выше базовые колебания протонированной (1724, 1767 и 1814 см-1) и заряженной карбоксильной (антисимметричное колебание при 1570 и 1632 см-1 и симметричное колебание при 1405 см-1) группы, а также колебание заряженной NH3+ группы, локализованной возле 1506 см-1. Описание спектров ИК-эмиссии пленок лизина было проведено на основе совпадающих литературных данных [ Barth, 2000; Wolpert, Hellwig, 2006; Krishnakuman et al, 2010].
Вместе с этими наблюдали ряд деформационных колебаний возле 1328, 1350 и 1440 см-1, обусловленных колебаниями СН2 группы, а так же симметричные С-О(Н) валентные колебания в области 1160-1090 см-1, и деформационные колебания типа (С-С-N), расположенные в области 900-830 см-1. Были выявлены колебания, типичные для цвиттерионов по присутствию в спектре колебаний заряженных СОО- и NH3+ групп. Это означало существование цвиттерионной формы (+NH3-CH2-COO—) лизина, что согласовывалось с литературными данными, согласно которым в нейтральных водных растворов и кристаллической форме аминокислоты существуют преимущественно в форме биполярных ионов, т.е.е цвиттерионов. В то же время, присутствие колебаний протонированной СООН группы указывало на то, что в растворе вместе с цвиттерионом существует так же незаряженная форма лизина. Обе эти группы в спектрах ИК-эмиссии лизина имели не одну, а несколько частот, что свидетельствовало о том, что в растворе эти химические группы существуют в разном окружении. Наличием в спектре ряда высокочастотных полос выше 1800 см-1 свидетельствовало об образовании сильных водородных связей в сложных структурах типа димеров аминокислота – вода или даже цвиттерион- цвиттерион. Это позволяло заключить, что в растворе наряду с простыми формами моноионов существуют их сложные образования. В частности, в спектре раствора лизина (рис. 12) особо обращал на себя факт присутствия высокоинтенсивных полос при 1485 и 1665 см-1, которые являются не типичными для растворов лизина [Chirgadze, 1975; Venyaminov, Kalnin, 1990; Bellamy, 1975; Wu et al., 2011]. Согласно литературным данным, обе эти интенсивные полосы характерны для протон-связанного димера лизина (Lys)2H+ [Venyaminov, Kalnin, 1990; Leng et al., 2008; Wu et al., 2011; Zadarashvili et al. 2011]. Этот результат подтверждал образование в растворе полярных связей и ионных пар (димеров). Как известно, для димеров аминокислот характерно наличие полярной водородной связи O-H…O=C, O-H…N , N-H…O=C или C-H…O-H или связи типа («голова- хвост» СО)О- …. (NH2 )Н+ , возникающей между цвиттерионными парами [Barrow et al., 1958; de Carvaloet et al., 2007; Yang et al., 2008]. Таким образом, исследованный спектр лизина содержал доказательства того, что низкоинтенсивный свет способен активировать в растворе взаимодействие аминокислот между собой и с молекулами воды в результате которого могут образовываться полярные связи и полярные структуры типа (+NH3-CH2-COO—)2. Высокие полярные и электрические свойства подобных связей и структур вероятнее всего обусловливают необычные оптические свойства аминокислот в данных экспериментальных условиях [Boldyreva, 2007$ Ozga et al., 2008; Sivanesan, 2010; Kavitha et al., 2012; Krishnakuman et al., 2010].
ИК-Фурье спектры ИК-эмиссии лизина в растворе (средняя кривая) и пленке (нижняя кривая) в области 2000- 500 см- Спектры записаны со спектральным разрешением 4 см-1 и накоплением 400 сканов при освещении видимым светом 340 Х 700 нм, мощностью 93 мВт; Спектр поглощения лизина (верхняя крисвая) представлен для сравнения.
Как и в предыдущих экспериментах, при частотном соответствии существовало различие между спектрами ИК-эмиссии и ИК-поглощения, которое было в ином относительном распределении интенсивностей между полосами. Например, слабая полоса в поглощении на частоте около 540 см -1 в эмиссионном спектре имела высокую интенсивность в эмиссионном спектре, а интенсивная широкая полоса от 2500 до 3300 см1, наблюдаемая в спектре поглощения практически отсутствовала в этом спектре ИК-эмиссии.
Сравнительный анализ спектров пленки и раствора показал наличие определенного сходства между спектрами, но при этом не было обнаружено полного совпадения между ними (см., например, рис. 31). Это касалось набора полос, положения максимумов отдельных полос и относительного распределения интенсивности между ними. Следовательно, структуры аминокислот в растворе и поликристаллической пленке, вовлеченные в ИК-активный отклик, не являются полностью идентичными. Это объясняло разничие в их спектральном поведении в зависимости от вариации условий возбуждения, как это можно видеть на рис. 32 а-в.
Было интересно определить, насколько структура аминокислот чувствительна к изменению условий возбуждения. Мы исследовали спектры ИК-эмиссии L-лизина моногидрохлорида и глицина при варьировании мощности действующего света. Оказалось, что спектры ИК-эмиссии обеих аминокислот как в твердой форме, так и в растворе были очень чувствительны к варьированию мощности и как будет показано ниже к частоте действующего света в пределах 42 мВт - 660 мВ [Терпугов, Дегтярева, 20154 terpugov, Degtyareva, 2015].
Это проявлялось в перераспределении интенсивности между отдельными полосами, в результате чего могли исчезать одни и появляться другие полосы, как это иллюстрирует рис. 34. На этом рисунке представлен спектр пленки глицина в низкочастотной области 960 - 840 см-1, где наблюдалась наиболее сильная широкая полоса с максимумом при 917 см-1. которая как нам удалось при разрешении показать, содержит две компоненты при 918 и 892 см-1. Полоса 918 см-1 включает в себя ряд колебаний, в том числе и деформационные колебания СН групп и согласно литературе, частота этого колебания используется для распознавания чистых форм а и у-кристаллов в глицине [Aber et al, 2005]. Деформационное колебание при 892 см-1 обладает особой чувствительностью к силе водородной связи между заряженными СОО и NH3 , группами в глицине [Aber et al., 2005; Phata et al., 2008; Huang et al., Lin et al, 1998; Murli et al, 2005; Maul et al, 2007; Pilling et al, 2013]. Как видно, незначительные изменения в интенсивности действующего света могли вызвать