Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Аналитический обзор существующих моделей взаимодействия белков 15
1.1 Математические кинетические модели образования белок-белковых комплексов 19
1.2 Метод броуновской динамики. 22
1.3 Белки электрон-транспортной цепи фотосинтеза 32
1.4 Применение метода броуновской динамики к моделированию взаимодействия электронно-транспортных белков 53
Глава 2. Метод прямого компьютерного моделирования взаимодействия белков 67
2.1 Физическая модель образования комплекса белков 67
2.2 Особенности моделирования диффузии белков 71
2.3 Электростатическое взаимодействие белков 74
2.4 Анализ траекторий броуновской динамики 78
Глава 3. Компьютерное моделирование взаимодействия пар фотосинтетических электрон-транспортных белков в растворе 86
3.1 Модель взаимодействия пластоцианина и цитохрома f 88
3.2 Модель взаимодействия ферредоксина и ФНР 103
3.3 Модель взаимодействия фотосистемы 1 с флаводоксином 108
3.4 Модель взаимодействия фотосистемы 1 с ферредоксином 113
3.5 Модель взаимодействия фотосистемы 1 с пластоцианином 116
3.6 Модели взаимодействия белков из цианобактерий 119
Глава 4. Изучение влияния клеточного окружения на скорость образования комплексов белков 132
4.1 Моделирование влияния ширины люминального пространства на скорость связывания белков пластоцианина и цитохрома f 132
4.2 Эффект электрического поля мембраны при взаимодействии пластоцианина и цитохрома f 138
4.3 Влияние размеров и формы реакционного объема на формирование кинетики редокс-превращений цитохрома f и P700 146
Глава 5. Идентификация пPомежуточныX CоCтояний в пPоцеCCе диффузионного Cближения электPон-тPанCпоPтныX белков 161
5.1 Определение областей связывания белковых молекул 161
5.2 Анализ энеpгетичеcки выгодныx столкновительных комплексов плаcтоцианина и цитоxpома f 163
5.3 Исследование эволюции метастабильных состояний при образовании комплекса электрон-транспортных белков пластоцианина и цитохрома f 169
Обсуждение результатов 174
Заключение 178
Выводы 180
Список литературы
- Белки электрон-транспортной цепи фотосинтеза
- Особенности моделирования диффузии белков
- Модель взаимодействия фотосистемы 1 с флаводоксином
- Анализ энеpгетичеcки выгодныx столкновительных комплексов плаcтоцианина и цитоxpома f
Белки электрон-транспортной цепи фотосинтеза
Фотосистема 1 катализирует светоиндуцированный транспорт электронов от пластоцианина на люминальной стороне мембраны к ферредоксину на стромальной стороне мембраны [Nelson, 2006]. Структура комплекса фотосистемы 1 хорошо изучена в работах последних лет. Существует несколько структур комплекса фотосистемы 1 с высоким пространственным разрешением, полученных методом рентгеноструктурного анализа, первая из которых – структура комплекса фотосистемы 1 цианобактерий с разрешением 2.5 [Jordan, 2001], идентификатор в белковом банке данных (PDB) 1JB0. Первая структура фотосистемы 1 высших растений (Pisum sativum var. alaska) с разрешением 4.4 получена в работе [Ben-Shem, 2003], PDB идентификатор 1QZV. Позже была получена структура фотосистемы 1 высших растений со светособирающим комплексом 1 с разрешением 3.4 [Amunts, 2007], PDB идентификатор 2O01, которая впоследствии была улучшена до 3.3 [Amunts, 2010], PDB идентификатор 2WSC. Последняя структура суперкомплекса фотосистемы 1 со светособирающим комплексом 1 с высоким разрешением 2.8 была получена в работе [Mazor, 2015], PDB идентификатор 4Y28.
Согласно современным представлениям, фотосистема 1 высших растений представляет собой большой трансмембранный пигмент-белковый комплекс, состоящий из 12 коровых субъединиц, связанных с четырьмя светособирающими белками, составляющими светособирающий комплекс 1 [Mazor, 2015]. Фотосистема 1 содержит следующие редокс-центры: Р700 (первичный донор электронов), А0 (молекула Chla), А1 (филлохинон), и три [4Fe4S] кластера FX, FB, FA. Два больших полипептида PsaA и PsaB (58-70 кДа) составляют центральную часть комплекса фотосистемы 1, на этих белках размещены компоненты электрон-транспортной цепи с Р700 до FX. Электрон-транспортная цепь окружена симметрично десятью -спиралями субъединиц PsaA и PsaB, формирующими центральное ядро. Двенадцать -спиралей PsaA и PsaB размещены в форме тримера димеров близко к центральному ядру.
Субъединицы PsaC, PsaD и PsaE, расположенные на стромальной части комплекса, формируют стромальный выступ фотосистемы 1. Область связывания ферредоксина предположительно находится в выемке, сформированной этими субъединицами. Эти субъединицы сами не содержат трансмембранных -спиралей, однако находятся в контакте с субъединицами PsaA и PsaB. На субъединице PsaC находятся два терминальных FeS кластера FA и FB.
Область связывания пластоцианина также формируют три участка: положительный участок N-концевого домена субъединицы PsaF, гидрофобный участок из двух параллельных спиралей субъединиц PsaA и PsaB, и люминальная петля субъединицы PsaA, выдающаяся из сравнительно ровной люминальной поверхности фотосистемы 1.
Остальные субъединицы расположены вокруг субъединиц PsaA и PsaB. Главная их функция – стабилизация антенной системы и четвертичной структуры фотосистемы 1.
Электронный транспорт в фотосистеме 1 функционирует следующим образом [Antal, 2013; Brettel, 1997; Setif, 2006]. После возбуждения Р700 квантом света и перехода в возбужденное состояние Р700 , электрон за 1-3 пс переносится на А0. Транспорт электрона с А0– на А1 происходит за 20-50 пс. Перенос электрона с FX на терминальные железо-серные кластеры FA и FB происходит быстрее, чем перенос электрона с A1 на FX (примерно 50 нс). Электрон достигает ферредоксина за время меньше 1 мкс. Фотосистема 2
Фотосистема 2 поглощает солнечный свет и осуществляет уникальную реакцию фотоиндуцированного окисления воды до атмосферного кислорода, тем самым инициируя фотосинтез в высших растениях, водорослях и цианобактериях [Мокроносов, 2006]. Эта реакция осуществляется так называемым кислород-выделяющим комплексом (КВК), находящимся на люминальной стороне фотосистемы 2. Одна из последних пространственных структур фотосистемы 2 с КВК с высоким разрешением 1.9 Thermosynechococcus vulcanus представлена в работе [Umena, 2011], PDB идентификатор 3ARC. Эта структура была в 2014 году улучшена, PDB идентификатор 3WU2.
Фотосистема 2 – это трансмембранный пигмент-белковый комплекс, состоящий из 20 субъединиц и содержащий реакционный центр Р680. Два главных мембранных белка, D1 (32 кДа) и D2 (34 кДа), содержат редокс-центры цепи электронного транспорта Р680, феофетин и пластохинон. Белки CP43 и CP47 локализованы во внутренней части мембраны, связывают хлорофилл а и выполняют роль внутренней светособирающей антенны PSII. Три других белка, массой 33, 23 и 17 кДа, локализованы на люминальной стороне мембраны. Эти белки электростатически связаны с мембраной и экспонированы в водную фазу. Они образуют комплекс расщепления воды.
Цитохромный b/f комплекс
Цитохромы b6 и f образуют единый интегральный комплекс, погруженный в тилакоидную мембрану – цитохром bf комплекс. Этот комплекс объединяет и сопрягает работу двух фотосистем и осуществляет перенос электронов от пластохинонов к пластоцианину [Мокроносов, 2006].
Первые пространственные структуры цитохромного bf комплекса были определены методом рентгеноструктурного анализа для термофильной цианобактерии Mastigocladus laminosus с разрешением 3 [Kurisu и др., 2003], PDB идентификатор 1VF5, и зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii с разрешением 3.1 [Stroebel, 2003], PDB идентификатор 1Q90. В дальнейшем были получены структуры цитохромных bf комплексов еще одного вида цианобактерий, последняя из них из Nostoc PCC 7120 с разрешением 2.7 , PDB идентификатор 4H44 [Hasan, 2013].
Из кристаллической структуры следует, что цитохромные bf комплексы организованы в димеры. Мономер цитохромного bf комплекса состоит из 4 субъединиц с молекулярной массой 34, 23.5, 20 и 17.5 кДа [Мокроносов, 2006]. Субъединица 34 кДа содержит цитохром f, субъединица 23.5 кДа содержит низкопотенциальный и высокопотенциальный цитохромы b6, субъединица 20 кДа представляет собой центр Риске (2Fe-2S белок). Внемембранные домены цитохрома f и белка Риске выступают в люмен тилакоида, Fe-S кластер в центре Риске и гемовая группа в цитохроме f расположены в люмене. Внемембранный домен белка Риске является внутренне неупорядоченным белком.
Цитохром f – это связанный с мембраной белок 34 кДа. Единственная -спираль пронизывает мембрану и держит белок заякоренным, однако большая часть белка находится в люмене. До того, как были определены структуры цитохромных bf комплексов целиком (см. выше) или комплексов пластоцианин-цитохром f (см. ниже), были определены структуры выделенных цитохромов f из организмов различных видов: Chlamydomonas reinhardtii (1EWH и 1CFM); Phormidium laminosum (1CI3); Brassica rapa (1HCZ и 1CTM).
Электростатический анализ структуры цитохрома f высших растений показывает, что молекула имеет суммарный отрицательный заряд, однако существует обширная положительно заряженная область, расположенная около гема, образованная железным центром и положительно заряженными остатками, включая Lys58, Lys65, Lys66, Lys185, Lys187, Arg156 и Arg209 (нумерация цитохрома f турнепса).
Особенности моделирования диффузии белков
Остается неясным, в какой степени электростатические взаимодействия влияют на скорость образования комплексов белков на различных этапах диффузионного сближения молекул. Для ответа на этот вопрос методом броуновской динамики исследована роль электростатических взаимодействий белков пластоцианина и цитохрома f в процессе формирования комплекса.
В модели используется структура комплекса пластоцианина шпината и цитохрома f турнепса (PDB ID: 2PCF), полученная методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Рассматривается взаимодействие восстановленного цитохрома f и окисленного пластоцианина. Распределение электростатических зарядов на атомах белков соответствует силовому полю CHARMM22(27) [MacKerell, 1998], на геме — взято из [Autenrieth, 2004]. Заряды на атоме меди пластоцианина и связанных с ним аминокислотных остатках аппроксимированы на основе данных [Zolotareva, 2015]. Суммарные заряды белков в модели составляли -8 (пластоцианин) и -4 (цитохром f) элементарного заряда. Электростатическое взаимодействие между белками не учитывалось, если расстояние между описывающими их сферами было более 3.5 нм (что соответствует расстоянию между реакционными центрами более 8.8 нм).
Ионная сила раствора - 100 мМ, температура - 300 K. Моделирование движения белков проводили в кубическом реакционном объеме размером 30х30х30 нм3 с периодическими граничными условиями. В каждом вычислительном эксперименте по одной молекуле пластоцианина и цитохрома/ помещали в ячейку в случайных положениях и ориентациях, и проводили моделирование их диффузии до тех пор, пока реакционные окислительно-восстановительные центры двух молекул (атом меди пластоцианина и атом железа цитохрома/) не сближались до заданного расстояния, которое отложено по оси абсцисс на Рис. 3.3.
Для каждого заданного расстояния между окислительно-восстановительными центрами белков проводились две серии из 500 вычислительных экспериментов, каждая в двух модификациях. В первом варианте диффузия белков определялась только тепловым движением молекул растворителя, а электростатические взаимодействия молекул не учитывались; во втором варианте учитывались также электростатические взаимодействия белков в процессе диффузии. В обоих случаях по окончанию вычислительного эксперимента при сближении белков на определенное расстояние рассчитывалась энергия электростатического взаимодействия между ними в достигнутой финальной конфигурации и константа скорости сближения белков до заданного расстояния.
Распределение времени, за которое образовывается комплекс, в серии однотипных экспериментов должно быть экспоненциальным, следовательно, константа скорости реакции второго порядка может быть вычислена как к = - - = —-, где т - среднее время наступления события, с - концентрация молекул, V с т - объем ячейки, NA - число Авогадро.
Была исследована зависимость скорости диффузионного сближения реакционных центров двух белков от заданного расстояния между этими центрами при их сближении (Рис. 3.3) и проанализировано распределение взаимных ориентаций белков по энергии электростатического взаимодействия (Рис. 3.4) [Коваленко, 2016]. На Рис. 3.3а видно, что если электростатическое взаимодействие между белками учитывается в модели в процессе их диффузии (верхняя кривая), то скорость их сближения резко возрастает после того, как расстояние между реакционными центрами достигнет 3 нм. На расстояниях больше 3 нм и вплоть до 5 нм достоверных данных о влиянии электростатического взаимодействия на скорость сближения центров не наблюдается. Как видно из Рис. 3.3б, при этих же значениях расстояний (от 3 до 5 нм) между реакционными центрами средняя энергия электростатического взаимодействия молекул, диффундирующих под одновременным влиянием этих взаимодействий (нижняя кривая), достоверно выше по абсолютной величине по сравнению с молекулами, диффундирующими без учета электростатических взаимодействий. Заметим, что на тех же расстояниях, при которых константы скорости сближения белков в модели достоверно различаются (расстояния меньше 3 нм, Рис. 3.3а), энергия электростатического притяжения становится сравнимой с кТ (Рис. 3.3б). При дальнейшем сближении электростатическое притяжение начинает преобладать над хаотическим тепловым движением. Очевидно, электростатические взаимодействия не только ускоряют диффузионное сближение молекул на расстояниях между активными центрами меньше 3 нм, но и способствуют занятию ими более выгодной энергетической конфигурации при одном и том же расстоянии между реакционными центрами.
Модель взаимодействия фотосистемы 1 с флаводоксином
Для изучения диффузии пластоцианина в люмене и его взаимодействия с мультиферментными комплексами была построена модель переноса электрона пластоцианином в люмене, которая, с одной стороны, учитывает сложную геометрию люминального пространства, а с другой стороны достаточно подробно описывает электростатические взаимодействия белков – участников электронного транспорта. В работе с помощью метода броуновской динамики изучается взаимодействие пластоцианина и цитохрома f в люмене тилакоида. В модели учитывается наличие мембран, ограничивающих люминальное пространство, белки цитохрома f располагаются в люмене в соответствии с экспериментальными данными о структуре цитохромного bf комплекса, пластоцианин диффундирует в люмене. С помощью модели получена зависимость константы скорости взаимодействия белков от геометрии (длины и ширины) люминального пространства и характера расположения комплексов.
Модельная сцена представляет собой трехмерный реакционный объем, имеющий форму прямоугольного параллелепипеда и представляющий модель люминального пространства. Этот реакционный объем сверху и снизу ограничен мембранами, с торцов применены зеркальные граничные условия. Площадь мембран, расстояние между ними, плотность расположения цитохромных комплексов на мембранах и концентрации подвижных переносчиков оценивались по литературным данным. Диаметр гранальной мембраны варьируется от 300 до 600 нм [Staehelin, 1996], плотность цитохромных bf комплексов на мембране равна 2,55 на 1000 нм2 [Albertsson, 2001a], концентрация пластоцианина 430 мкМ.
Цитохромный bf комплекс из Chlamydomonas reinhardtii состоит из 4 больших субъединиц – цитохрома f, цитохрома b6, железосерного белка Риске и субъединицы IV, а также из 4 малых гидрофобных субъединиц [Stroebel, 2003]. Белки Риске и цитохром f выступают в люмен. Совместив структуру комплекса пластоцианина шпината и цитохрома f турнепса (PDB структура 2PCF) [Ubbink, 1998] и структуру цитохромного bf комплекса Chlamydomonas reinhardtii (PDB структура 1Q90) [Stroebel, 2003], мы нашли возможное взаимное расположение комплекса пластоцианина и цитохрома f относительно мембраны (Рис. 4.1). При моделировании мы реализовали такое положение цитохрома f относительно мембраны [Коваленко, 2008]. В модели молекулы пластоцианина диффундируют в люминальном пространстве и могут образовать комплекс с неподвижными молекулами цитохрома f, только приняв соответствующую ориентацию относительно молекул цитохрома f.
В качестве параметров взаимодействия пластоцианина и цитохрома f выбрали параметры, оцененные нами для модели взаимодействия этих белков в растворе (глава 3). С помощью компьютерной модели мы исследовали зависимость константы скорости реакции пластоцианина и цитохрома f в люмене тилакоида от ширины люминального пространства (расстояния между мембранами). При этом количество молекул (270 молекул пластоцианина и 270 молекул цитохрома f) и площадь мембран (322x322 нм2) оставались постоянными. Расстояние между мембранами изменяли от 7 до 200 нм. Молекулы цитохрома f были фиксированы относительно мембраны.
Рис. 4.2. Зависимость скорости реакции пластоцианина и цитохрома f, отнесенной к концентрации цитохрома f, в люмене тилакоида от расстояния z между мембранами при постоянном количестве молекул.
Результаты численного эксперимента приведены на Рис. 4.2. Видно, что скорость реакции максимальна при расстоянии между мембранами тилакоида 8 нм. При увеличении расстояния скорость реакции снижается из-за уменьшения концентрации пластоцианина. Однако при уменьшении расстояния меньше 8 нм скорость реакции резко падает до нуля. Это объясняется тем, что молекула цитохрома f с присоединенным к нему пластоцианином выступает из мембраны на 7 нм, и вследствие наличия противоположной мембраны при расстоянии меньше 7 нм образование комплекса пластоцианин – цитохром f невозможно.
Константа скорости второго порядка реакции пластоцианина и цитохрома f k = 2.2 108 M–1c–1 также максимальна при расстоянии между мембранами тилакоида 8–10 нм; если расстояние меньше 7 нм, то наблюдается резкий спад величины константы скорости до нуля. С увеличением расстояния между мембранами константа скорости немного уменьшается. Это может быть объяснено тем, что молекулы цитохрома f закреплены на мембранах и, как следствие, молекулы пластоцианина удалены от них на большое расстояние в начальный момент времени.
Мы также исследовали зависимость величины константы скорости реакции пластоцианина и цитохрома f в люмене тилакоида от размера люмена при постоянном расстоянии между мембранами 10 нм и постоянном количестве молекул пластоцианина и цитохрома f (270 молекул). В латеральной плоскости люмен имел форму квадрата с длиной стороны x, которую изменяли от 200 до 1200 нм. Результат приведен на Рис. 4.3. При уменьшении реакционного объема, т.е. при увеличении концентрации молекул, константа скорости увеличивается. Это может быть связано с тем, что мембраны ограничивают объем для диффузии пластоцианина, препятствуя его уходу из области притяжения цитохрома f, а также с тем, что молекулы цитохрома f на мембранах находятся в удобной для связывания пространственной ориентации.
Анализ энеpгетичеcки выгодныx столкновительных комплексов плаcтоцианина и цитоxpома f
Метод прямого многочастичного моделирования позволяет оценить интегральные характеристики белок-белкового взаимодействия, такие как константы скорости образования комплексов белков. Метод также позволяет проследить роль электростатических взаимодействий на различных этапах сближения белковых молекул и определить структуры диффузионно-столкновительных комплексов, которые обусловливаются как электростатическими свойствами белков, так и стерическими факторами.
Расчеты с использованием метода броуновской динамики позволили выявить роль дальнодействующих электростатических взаимодействий на различных этапах сближения белков. Оказалось, что даже при значительных расстояниях (3 – 5 нм) между реакционными центрами диффундирующих молекул пластоцианина и цитохрома f из высших растений электростатические взаимодействия способствуют достижению правильной взаимной ориентации этих молекул в пространстве в процессе их диффузионного сближения. На более коротких расстояниях это приводит к увеличению скорости сближения молекул. Как результат в модели в процессе броуновского движения и электростатического взаимодействия белков образуются предварительные диффузионно-столкновительные комплексы, структуры которых могут быть различными, однако большинство из них являются энергетически выгодными. Эти комплексы затем могут трансформироваться в финальный комплекс.
В высших растениях, когда молекула пластоцианина подходит к месту связывания на цитохроме f, у нее остается возможность совершать вращательные движения вокруг собственного центра. У некоторых белков, наоборот, может реализовываться другая ситуация: у цианобактерии Nostoc в столкновительных комплексах пластоцианин ориентирован атомом меди по направлению к цитохрому f, однако при этом он взаимодействует с различными частями последнего. Для некоторых белков, у которых константа скорости практически не зависит от ионной силы (например, пластоцианин и цитохром f из цианобактерии P.Laminosum), молекулы сталкиваются в произвольных ориентациях, а затем при непосредственном контакте поверхностей благодаря гидрофобным взаимодействиям происходит поиск финальной конфигурации. Представляет интерес детальное изучение механизмов образования комплексов одних и тех же белков у различных видов организмов методом молекулярной динамики с явным учетом молекул растворителя.
В случае белков пластоцианина и цитохрома f из высших растений удалось показать, что все энергетически выгодные предварительные комплексы могут быть разделены на два кластера. Необходимо отметить, что найденные в работе кластеры примерно одинаковы по количеству входящих в них структур, однако структуры первого кластера являются продуктивными, из них может быстро образоваться финальный комплекс, а структуры второго – непродуктивные, в этих метастабильных состояниях белки могут находиться длительное время, не образуя функционально-активный комплекс. Можно предположить, что структуры первого кластера более выгодны с точки зрения гидрофобных взаимодействий, чем второго, поскольку в первом кластере среднее расстояние между гидрофобными областями двух белков почти в два раза меньше, чем во втором. Если в методе броуновской динамики учесть вклад гидрофобных взаимодействий, то кластеры получились бы различными по размеру: структуры первого кластера встречались бы чаще, чем второго. Гидрофобные взаимодействия могут быть учтены в полном объеме с использованием метода молекулярной динамики с явно заданным растворителем.
С помощью метода молекулярной динамики мы показали, что центральная структура продуктивного кластера может быстро (300 нс) трансформироваться в финальный комплекс, расстояние между кофакторами белков в котором составляет около 15 ангстрем. Однако в других реализациях молекулярно-динамического расчета с теми же начальными условиями белки могут образовать финальный комплекс за другое время, либо вообще разойтись. Следует отметить, что в работе [Ubbink, 1998] с помощью метода ЯМР было получено 10000 возможных структур комплексов белков пластоцианина и цитохрома f, из которых были выбраны 10 наиболее типичных. Все эти структуры лежат в пределах неглубокого энергетического минимума, а комплекс этих белков динамический и не имеет одной четко определенной структуры.
Детали процесса трансформации структур различных предварительных комплексов в финальный комплекс пока не ясны. Необходимо дальнейшее изучение процессов образования функционально-активных комплексов, в том числе методами молекулярного моделирования. Ответы на подобные вопросы требуют проведения множества молекулярно-динамических симуляций для системы, состоящей примерно из ста тысяч атомов, на временах порядка микросекунды. Такие объемы вычислений пока недоступны с использованием современных вычислительных средств, однако возможность подобных расчетов может появиться в ближайшем будущем, в связи с быстрым развитием суперкомпьютеров с гибридной вычислительной архитектурой.
Если в прямой многочастичной модели заданы критерии реакции образования комплексов белков, то кинетическая кривая может быть получена непосредственно из вычислительного эксперимента. На каждом шаге в модели подсчитывается количество образованных комплексов, и таким образом строится кривая изменения во времени для количества комплексов. Эту кинетическую кривую можно напрямую сравнить с экспериментальной кривой. При этом нет необходимости использовать те или иные предположения о кинетических механизмах реакций. Кроме того, при моделировании реакций не в растворе, а компартментах со сложной геометрической формой (например, когда одна из размерностей системы мала, и реакционный объем квази-двумерный), либо когда в системе существуют микродомены диффузии, или просто при очень плотном расположении реагентов в системе, может не выполняться закон действующих масс.