Исследование упругих свойств многокомпонентной липидной мембраны при экстремальных изгибных деформациях Чекашкина Ксения Владимировна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 12

1.1 Роль физико-химических свойств липидного бислоя (ЛБ) в мембранных процессах. 12

1.2 Модель линейной изгибной упругости мембраны. 15

1.3 Методы измерения модуля изгиба мембраны. 17

1.3.1 Анализ флуктуаций поверхности свободной мембраны 17

1.3.2 Анализ связи приложенная сила – механическая деформация мембраны. 18

1.4 Влияние липидного состава и холестерина на изгибную жесткость мембраны. 22

1.4.1 Не-бислойные липиды. 27

1.5 Молекулярные механизмы морфогенеза клеточных мембран специализированными белками. 31

1.5.1 Роль эпсина в процессе клатрин-зависимого эндоцитоза. 32

1.6 Влияние продуктов окисления на упругие свойства мембран и активность митохондриальных белков. 35

Глава 2. Материалы и методы 40

2.1 Материалы. 40

2.2 Методы. 41

2.2.1 Формирование бислойной липидной мембраны (БЛМ). 41

2.2.3 Вытягивание мембранных нанотрубок (НТ) из модельных липидных бислоев. 43

2.2.4 Измерение геометрических параметров НТ. 46

2.2.5 Измерение эластических параметров НТ. 48

2.2.6 Метод компенсации внутримембранного поля (КВП). 49

2.2.7 Добавление различных агентов к мембранным НТ. 51

Глава 3. Результаты и обсуждение 52

3.1 Теория упругости многокомпонентного липидного бислоя 52

3.1.1 Двухкомпонентный липидный бислой, обменивающийся веществом с резервуаром липидов и находящийся под воздействием трансверсального электрического поля . 52

3.1.2 Эффект “краудинга” белков. 60

3.1.3 Изгибная упругость многокомпонентного липидного бислоя. 62

3.2 Упругость ЛБ при экстремальных изгибных деформациях. 65

3.2.1 Создание критической кривизны – прекурсора деления мембраны – в липидных нанотрубках (НТ). 65

3.2.2 Зависимость изгибной жесткости мембраны от кривизны. 76

3.2.3 Линейная изгибная упругость прекурсора деления 79

3.3 Упругость многокомпонентного липидного бислоя. 85

3.3.1 Влияние не-бислойных липидов на изгибную жесткость ЛБ 85

3.3.2 Исследование упругих характеристик отдельных компонентов в различном фоновом липидном окружении. 89

3.4. Влияние молекулярных параметров липидов на транспортные характеристики митохондриального белка UCP1. 91

3.5 Влияние миграции заряженных компонентов на измерения 95

Основные выводы работы 99

Опубликованные работы по теме диссертации 100

Благодарности 105

Библиографический список используемой литературы 107

• Влияние липидного состава и холестерина на изгибную жесткость мембраны.
• Двухкомпонентный липидный бислой, обменивающийся веществом с резервуаром липидов и находящийся под воздействием трансверсального электрического поля
• Создание критической кривизны – прекурсора деления мембраны – в липидных нанотрубках (НТ).
• Влияние миграции заряженных компонентов на измерения

Введение к работе

Актуальность

Данная работа посвящена разработке и экспериментальной проверке нового
формализма в теории упругости липидного бислоя (ЛБ), связывающего такое его
макроскопическое свойство, как изгибная жесткость, с индивидуальными

геометрическими и эластическими параметрами липидных молекул, из которых он состоит. Актуальность такого исследования определяется тем, что клеточная мембрана содержит большое количество так называемых «не-бислойных» липидов, которые сами по себе при растворении в воде не образуют липидный бислой, а формируют сильно искривленные структуры, например, мицеллы или инвертированную гексагональную фазу. При встраивании в плоский бислой такие липиды должны индуцировать в нем стресс, который может оказывать существенное влияние на работу некоторых мембранных белков, чья активность сопряжена с конформационными изменениями трансмембранных доменов. До сих пор не существует однозначного представления о связи возникающего стресса со свойствами индивидуальных липидных молекул, что важно для оценки влияния различных липидов на работу белков. Остается открытым вопрос и о возможности перераспределения не-бислойных липидов в градиенте кривизны мембраны и его роли в регуляции упругих характеристик мембраны. В этом случае возникает дополнительная изгибная деформационная мода, связанная с локальным изменением концентрации таких липидов, а не с изменением их конформационного пространства. Также в данной работе проводится исследование упругих свойств ЛБ при его экстремальных изгибных деформациях вплоть до потери им стабильности.

В 70-х годах прошлого века Вольфгангом Хельфрихом была предложена теория линейной упругости ЛБ для малых отклонений кривизны от спонтанного значения. В рамках данного подхода модуль изгиба ЛБ определяется как вторая производная плотности свободной энергии по кривизне в спонтанном состоянии. В настоящее время существует ряд оригинальных методик, позволяющих проводить измерения модуля изгиба ЛБ в модельных системах. Показано, что обычно его величина имеет небольшое значение в диапазоне от 10 k_BT до 30 k_BT. Следовательно, изгибная жесткость мембраны не может оказывать существенного влияния на деформацию клеточных мембран на субмикронном уровне. В то же время, изгибная жесткость ЛБ должна играть ключевую роль в процессах топологической перестройки мембран, сопряженных с образованием сильно искривленных структур, радиус кривизны которых сравним с длинами молекул липидов. Однако, в настоящее время ничего не известно об упругих свойствах ЛБ при таких экстремальных деформациях, ведущих к потере его стабильности и, как следствие, топологической реорганизации. Сохраняет ли ЛБ при этом макроскопические свойства (линейную упругость), или происходит их качественное изменение (возникновение пластичности)? Ответ на данный вопрос является крайне актуальным для нашего понимания механизмов топологических перестроек мембраны, в том числе и в случаях ее патологических нарушений.

Цель работы

Основная цель данной работы: проверить применимость линейного приближения изгибной жесткости ЛБ во всем диапазоне его изгибных деформаций, вплоть до критических, приводящих к его дестабилизации, и в рамках этого приближения разработать новый формализм описания упругости мембраны, учитывающий вклад перераспределения липидов с различной молекулярной формой, и доказать обоснованность данного формализма в экспериментальной системе.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Разработать экспериментальный подход, позволяющий проводить измерения модуля изгиба мембраны во всем диапазоне кривизны ее поверхности вплоть до экстремальных значений, при которых происходит спонтанное деление НТ.

2. Провести исследование зависимости модуля изгиба мембраны от ее кривизны.

3. Разработать теорию упругости мембраны, учитывающую дополнительную деформационную моду, а именно локальное изменение концентрации липидов, имеющих различную молекулярную геометрию.

4. Провести исследование влияния не-бислойных компонентов биологических мембран, таких как 1, 2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE) и 1-олеил-2-гидрокси-sn-глицеро-3-фосфохолин (OPC), на модуль изгиба мембраны и сравнить полученные результаты с теоретическими предсказаниями.

5. Проверить предположение о сохранении приписываемых отдельным липидным компонентам таких свойств, как материальный модуль изгиба и спонтанная кривизна, в рамках линейного приближения изгибной упругости многокомпонентного ЛБ во всем биологически значимом диапазоне значений его геометрической кривизны.

6. На примере продуктов взаимодействия DOPE с высокореакционными альдегидами (РА) исследовать влияние изменения спонтанной кривизны и материального модуля липидного компонента на активность митохондриального разобщающего белка 1 (UCP1).

Научная новизна

Описание различных мембранных процессов в терминах упругих механических
напряжений ЛБ давно стало парадигмой, в том числе и в случаях, сопряженных с
образованием сильно искривленных липидных структур. В данной работе впервые
проведено экспериментальное исследование упругих характеристик сильно

искривленного ЛБ, находящегося под воздействием большого изгибного напряжения.
Показано, что на масштабах кривизны, соответствующих промежуточным структурам
деления/слияния мембран, кромке липидной поры и пр., ЛБ сохраняет свойства
линейно-упругого тела, а его кривизна с точностью до долей нанометров определяется
макроскопическими упругими характеристиками (изгибная жесткость, латеральное
натяжение), которые остаются неизменными во всем диапазоне отклонения кривизны от
спонтанного значения. Кроме того, впервые экспериментально доказано наличие
имманентных характеристик чистого липидного компонента в состоянии

молекулярного монослоя – материального модуля изгиба и спонтанной кривизны.

Доказано, что липиды, обладающие выраженной спонтанной кривизной,

перераспределяются в градиенте кривизны мембраны, что создает дополнительную к
изменению формы молекулы изгибную деформационную моду, жесткость которой
определяется собственным “энтропийным” модулем изгиба. Разработан уникальный
метод измерения энтропийного модуля изгиба и показано, что для некоторых
физиологически значимых липидных составов с большим содержанием не-бислойных
компонентов вклад энтропийной и материальной упругости в эффективную изгибную
жесткость мембраны может быть одинаковым. Показана регуляторная роль не-
бислойных липидов в процессах, сопряженных с изменениями формы клеточных
мембран. Предложен новый формализм описания изгибной упругости

многокомпонентного липидного бислоя, где каждый липидный компонент представляется как отдельный упругий элемент, характеризующийся двумя модулями упругости – материальным и энтропийным.

Практическая значимость

Полученные результаты подтверждают правомочность использования линейно-упругого приближения при описании механики ЛБ, находящегося под воздействием большого изгибного напряжения, что крайне важно для экспериментального и теоретического исследования таких процессов, как деление/слияние мембран, порообразование и пр. Кроме того, показана регуляторная роль не-бислойных компонентов в регуляции изгибной жесткости клеточных мембран, что может использоваться в медицинских целях для управления процессами клеточного морфогенеза в случае их патологических нарушений. Разработанное теоретическое описание упругости многокомпонентных мембран дает возможность с хорошей точностью оценивать эффективную изгибную жесткость ЛБ, исходя из данных о материальном модуле упругости и спонтанной кривизне чистых компонентов. Также в работе предложен новый метод измерения материального модуля изгиба и спонтанной кривизны чистого компонента для липидов, которые сами по себе не формируют ЛБ. Предложенный метод измерения позволил на примере UCP1 доказать его чувствительность к изменению материального модуля изгиба одного из мембранных компонентов в результате взаимодействия с высокореакционными альдегидами.

Положения, выносимые на защиту

7. Изгибная упругость липидного бислоя описывается в рамках линейного приближения во всем диапазоне отклонений его кривизны от спонтанного состояния вплоть до критических деформаций, приводящих к его структурной перестройке.

8. Доказывается существование в липидном бислое двух независимых изгибных деформационных мод, характеризующихся собственными модулями упругости - материальным и энтропийным.

9. Макроскопические параметры, приписываемые отдельным липидным компонентам, а именно материальный модуль изгиба и спонтанная кривизна, сохраняются во всем биологически значимом диапазоне значений геометрической кривизны мембраны и определяют значения материального и энтропийного модулей изгиба многокомпонентного липидного бислоя.

4. Перераспределение компонентов, обладающих спонтанной кривизной,

приводит к уменьшению эффективного модуля изгиба/изгибного стресса липидного бислоя, что определяет путь его топологической перестройки в процессе деления.

Вклад автора

Основные результаты диссертационной работы получены лично автором. Им были проведены все представленные в исследовании экспериментальные работы и обработаны результаты. Также автор принимал самое непосредственное участие в анализе и обобщении полученных результатов и подготовки на их основе публикаций. Автор выражает благодарность соавторам по теоретическим исследованиям за помощь в разработке теории упругости многокомпонентных липидных бислоев.

Апробация результатов работы

Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах: 61^st, 60^th, 58^th, Annual Meetings of the Biophysical Society (США, Новый Орлеан, 2017; Лос-Анжелес, 2016; Сан-Франциско, 2014 ); 20ая, 19ая Международные Пущинские Школы-Конференции молодых ученых "Биология-наука 21 века" (г. Пущино 2015, 2014); XII, XI, X, IX, VIII, V Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов "Физикохимия-2017, 2016, 2015, 2014, 2013" (г. Москва, 2017, 2016, 2015, 2014,2013); Научно-практическая конференция ФБГУ ФНКЦ ФМБА России (г. Москва, 2016); 19 th International School on Condensed Matter Physics “Advances in Nanostructured Condensed Matter-Research and Innovations” (Болгария, г. Варна, 2016); Workshop “Membrane and Liquid Crystals Nanostructures”, MELINA (Болгария, г. Варна, 2016); V молодежная конференция по молекулярной и клеточной биологии" (Санкт-Петербург, 2016); 10th EBSA European Biophysics Congress (Германия, г. Дрезден, 2015); 10th International Frumkin Symposium on Electrochemisty (Москва, 2015); V Съезд биофизиков России (г. Ростов-на- Дону, 2015); Международная конференция «Structure and functions of biomembranes 2014» (г. Долгопрудный, 2014); IV Междисциплинарная конференция «Биологические активные вещества и материалы: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Крым, г. Новый Свет, 2013); Biomembrane Days (Германия, Потсдам, 2012); Конференция молодых ученых Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты (г. Москва, 2012); XXI International Symposium of Bioelectrochemistry and Bioenergetics of the Bioelectrochemical Society (BES) (Польша, г. Краков, 2011); 53 научная конференция МФТИ (г. Долгопрудный, 2010).

Публикации

По результатам исследования опубликовано 8 работ, имеющих индекс цитирования Web of Science, из них одна монография и две статьи в журналах, входящих в перечень ВАК.

Структура и объем диссертации

Влияние липидного состава и холестерина на изгибную жесткость мембраны.

Считается, что модуль изгиба мембраны в первую очередь определяется молекулярной организацией ее гидрофобной части - упаковкой жирнокислотных остатков (гидрофобных “хвостов”). Отклонение кривизны липидного монослоя от спонтанного состояния приводит к изменению формы пространства, доступного для размещения в нем возможных конформаций углеводородной цепи (липидного “хвоста”), что уменьшает энтропию системы и, как следствие, увеличивает свободную энергию. Поэтому изгибная жесткость липидного бислоя должна зависеть от физико-химических свойств гидрофобной области ЛБ - фазового состояния, уровня насыщенности углеводородных цепей, их длины и пр. [35, 61].

В теоретических работах было предсказано существенное повышение изгибной жесткости ЛБ с ростом длины гидрофобных “хвостов” липидов, из которых он состоит [61]. Чуть позже это предположение было экспериментально подтверждено в работах, проведенных в начале 2000-х группой под руководством профессора Evan Evans [35]. Было показано, что модуль изгиба ЛБ, сформированного из липидов, имеющих насыщенные или мононенасыщенные “хвосты”, и находящегося в жидкокристаллическом состоянии, увеличивается с ростом длины углеводородных цепей: изменение длины остова цепи с 13-ти атомов углеродов до 18-ти приводит к увеличению модуля изгиба от 0.56 10-19 Дж до 0.92 10-19 Дж. Обратный эффект наблюдается при увеличении количества двойных связей в остове углеводородной цепи: для ЛБ, образованного из липидов с двумя и тремя двойными связями, модуля изгиба принимали значения равные 0.44 10-19 Дж и 0.38 10-19 Дж, соответственно. Для многокомпонентного липидного бислоя, состоящего из невзаимодействующих молекул, верно следующее определение модуля изгиба мембраны

Данное выражение аналогично определению суммарной упругости сцепленных последовательно пружин различной длины.

Влияние фазового состояния липидного бислоя на его изгибную упругость была показана в работах [63, 64], где было получено экспериментальное подтверждение зависимости модуля изгибы от параметра порядка (ориентации гидрофобных остатков в гидрофобной прослойке бислоя). При фазовом переходе из жидко-неупорядоченного состояния к жидко-упорядоченному происходит скачкообразное изменение упаковки липидных молекул в бислое [65, 66]. В жидко-упорядоченном состоянии хвосты мало отклоняются от нормали относительно поверхности ЛБ. Такое существенное ограничение конформационного пространства, доступного для гидрофобной части молекул липидов (уменьшение площади сечения/конденсация), приводит к увеличению толщины ЛБ [67] и, как следствие, к двукратному росту изгибной жесткости. Считается, что большее значение модуля изгиба жидко-упорядоченного домена по сравнению с окружающим жидко-неупорядоченным липидным бислоем, имеет важнейшую физиологическую значимость и лежит в основе таких процессов, как: сортировка ассоциированных с доменами белков – их гетерогенное распределение между участками мембраны с различной геометрической кривизной [68, 69]; образование некоторых типов транспортных везикул (например, кавеолиновых везикул [70]).

Еще одним важнейшим модификатором физико-химических свойств мембраны является молекула холестерина (Chol). Известно, что холестерин является жизненно необходимым компонентом мембран клеток млекопитающих, составляя до 50 моль% от общей массы липидов в плазматической мембране [71]. Холестерин играет ключевую роль в стабилизации мембранных доменов/рафтов, которые ответственны за правильное функционирование многих мембранных белков [72, 73]. Холестерин оказывает существенное влияние на многие физико-химические свойства липидного бислоя – вязкость, температуру фазового перехода гель-жидкий кристалл, проницаемость [74-78], а также увеличивает изгибную жесткость мембраны [32, 48, 55, 78-80]. Однако, в настоящее время представления о воздействии холестерина на механические свойства липидного бислоя претерпевают изменения.

Согласно последним исследованиям стало ясно, что эффект, оказываемый холестерином на изгибную жесткость мембраны, зависит от липидного состава мембраны [48, 77, 81]. В первую очередь это определяется степенью насыщенности жирнокислотных остатков. Так измерения, проведенные в различных модельных системах, показали, что модуль изгиба мембраны, сформированной из смеси ненасыщенного 1, 2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфолхолина (DOPC) и холестерина, оставался неизменным во всем исследуемом диапазоне концентраций холестерина – концентрация изменялась от 0 до 40 моль% [48, 77, 81]. В то время как для мембраны из насыщенного 1, 2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DMPC) добавление холестерина приводило к заметному повышению изгибной жесткости мембраны: так при 30 моль% наблюдалось трехкратное увеличение модуля изгиба. Для липида, у которого один жирнокислотный остаток был насыщенным, а второй нет, эффект холестерина был выражен намного умереннее.

Различия в действии, оказываемом холестерином на упругие характеристики биологических мембран в зависимости от типа жирнокислотных, объясняется различной ориентацией молекул холестерина в гидрофобной прослойке бислоя среди наcыщенных и ненасыщенных липидных “хвостов”. Первоначально предполагалось, что молекулы холестерина в липидных мембранах слегка отклонены от нормали к поверхности липидного бислоя, при этом их гидроксильные группы располагаются в области полярных “голов” [82-89]. Однако последние экспериментальные исследования поставили под сомнение эту точку зрения, показав, что в присутствии полиненасыщенных жирных кислот [90], а также в случае мононенасыщенных липидов [91], холестерин может полностью располагаться внутри гидрофобной области ЛБ. Исследования методами молекулярной динамики [92] подтвердили, что даже в мембранах из насыщенных липидов, ориентация холестерина в толще бислоя сильно зависит от его концентрации - при низких концентрациях ( 10 моль%) он преимущественно располагается горизонтально, «лежит» в плоскости мембраны. Но эта тенденция постепенно уменьшается с увеличением концентрации холестерина в мембране - при высоких концентрациях ( 30 моль%) практически все молекулы холестерина располагаются вдоль нормали к поверхности ЛБ. Та же группа исследователей выявила наличие корреляции между ориентацией молекул холестерина в липидном бислое и их влиянием на изгибную жесткость мембраны. Для этого был проведен сравнительный анализ двух структурно похожих стеролов – холестерина и 7-дегидрохолестерина (7DHC) [93]. Авторами, как и ранее в работах [94, 95], было установлено, что молекулы 7DHC и Chol по-разному ориентированы в ЛБ; 7DHC имел менее выраженную тенденцию располагаться вертикально. При этом оба стерола индуцировали практически одинаковое уменьшение площади поверхности ЛБ, приходящейся на липидную молекулу, что указывало на аналогичный конденсирующий эффект 7DHC и Chol. Более того, не были выявлены какие-либо заметные различия в том, как два стерола влияют на параметр порядка ЛБ. Однако холестерин приводил к намного большему увеличению изгибной жесткости ЛБ, чем его аналог 7DHC. Таким образом, роль холестерина, как одного из важнейших клеточных модификаторов изгибной жесткости мембраны, определяется его ориентацией по отношению к нормали ЛБ; максимальный эффект наблюдается при вертикальном расположении холестерина в гидрофобной прослойке мембраны.

Резюмируя, эффект холестерина не является универсальным, а скорее специфичным для разного типа липидов. Изгибная жесткость мембраны, содержащей насыщенные или мононенасыщенные липиды, увеличивается с содержанием холестерина [96], в то время как жесткость мембран, содержащих лишь ненасыщенных липиды, например, такие как DOPC, не зависит от содержания холестерина [97].

Несмотря на то, что основной вклад в изгибную упругость мембраны вносит именно гидрофобная часть липидного бислоя, в некоторых случаях изгибная жесткость мембраны оказывается чувствительной к “химии” полярных частей молекул липидов. В основном это касается наличия свободного заряда. Так в ряде работ показано, что наличие поверхностного заряда может увеличивать модуль изгиба мембраны [98]. Эффект становится заметен при высокой плотности заряда или при малой ионной силе раствора [99] и связан с вкладом двойного электрического слоя, образующегося около поверхности мембраны [100, 101] или с изменением плотности заряда [102]. Интересно также отметить, что в работах [103, 104] было указано, что добавление 30 моль% 1, 2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина (DOPE) к мембране, сформированной из DOPC, приводило к заметному уменьшению изгибного модуля мембраны, несмотря на то, что “хвосты” обоих липидов одинаковые.

Различие между DOPE и DOPC заключается в их молекулярной форме; в то время как молекулы DOPC в воде самоорганизуются в плоские липидные бислои, молекулы DOPE формируют сильно искривленные структуры – инвертированную гексагональную HII фазу (Рисунок 6). Молекулы такого типа (не формирующие липидный бислой) называются не-бислойными.

Двухкомпонентный липидный бислой, обменивающийся веществом с резервуаром липидов и находящийся под воздействием трансверсального электрического поля

Рассмотрим симметричный двухкомпонентный липидный бислой (ЛБ), обменивающийся веществом с резервуаром липидов и находящийся под воздействием трансверсального электрического поля. В таком случае свободная энергия F любого из его монослоев будет являться функцией количества молекул первого и второго типов щ и «2, площади монослоя - А, средней кривизны его поверхности - J и трансмонослойного падения напряжения и: F = F(д, , A, J,и), а полный дифференциал свободной энергии будет определяться уравнением

Мы полагаем, что липидный монослой несжимаем, а площади проекции обеих молекул липида на поверхность монолослоя одинаковы и равны а, тогда площадь монослоя А = а(п1+п2), а доля поверхности занимаемой первым компонентом В наших экспериментах максимальное значение, которое принимала величина Ы составляло 1/2 (для мембранных нанотрубок с радиусом просвета 2 нм), что соответствует 8% отклонению Csp отCSP . Таким образом, в дальнейших вычислениях мы считаем удельную емкость липидного бислоя и, следовательно, его монослоев, постоянными величинами, а изгибающий момент г не зависящим от кривизны монослоя.

Будем считать, что молекулы липида обладают спонтанной кривизной Jsj -физический смысл которой заключается в том, что это значение кривизны монослоя чистого компонента, при котором изгибающий момент, действующий на него, равен 0. Точно также спонтанная кривизна двухкомпонентного монослоя Js - кривизна, при которой изгибающий момент, действующий на него, равен 0. Понятно, что Js(cp) -функция состава. Определим спонтанное состояние двухкомпонентного монослоя как то, при котором его средняя кривизна (сумма главных кривизн) равна спонтанному значению, а латеральное натяжение и трансмонослойное напряжение равны 0: J = Js((p), и = 0, а = 0. Тогда считая, что в системе отсутствуют межмолекулярные взаимодействия, в рамках решетчатой модели можно определить химические потенциалы компонентов в таком состоянии как

В уравнении (12) нижний предел интегрирования снова не определен и может быть любым, единственно он должен быть одинаков в обоих выражениях. Обратим внимание, как следует из уравнения (11) все новые функции - F, Д,Д зависят только от количества частиц - переменных щ и щ (на самом деле от одной ср). Таким образом, их значения могут быть определены для любых переменных J, и и а. Определим значения “модифицированных” химических потенциалов для спонтанного состояния, как мы делали это для “обычных” ju1 и рі2 в уравнении (9)

Для дальнейшего описания системы необходимы модельные предположения о характере зависимости изгибающего момента от кривизны монослоя. В рамках линейной изгибной упругости, предложенной Вольфгангом Хельфрихом в начале 70-х годов прошлого столетия [47], изгибающий момент на единицу длины пропорционален отклонению кривизны от спонтанного значения Js

Создание критической кривизны – прекурсора деления мембраны – в липидных нанотрубках (НТ).

Топологическая перестройка мембраны (деление/слияние) происходит в результате локальной потери стабильности ЛБ при накоплении в нем достаточных упругих напряжений, которые генерируются специализированными белковыми машинами. Считается, что структурой прекурсора деления мембран служит тонкая мембранная нить (полый цилиндр), соединяющая делящиеся объемы. Согласно общепринятой на сегодняшний день модели деления клеточных мембран, данный процесс реализуется через локальное замыкание внутреннего монослоя такого цилиндра - образование так называемой структуры полуделения, что требует создание большого изгибного стресса, приводящего к сужению просвета прекурсора до 1-2 нм. Прекурсор деления является открытой системой, которая обменивается веществом как с “материнской” мембраной, так и с цитоплазмой, кроме того “материнская” мембрана задает эффективное латеральное натяжение, которое действует как важный управляющий параметр - эквивалент растягивающей/сжимающей силе, задающий изгибное напряжение в липидном бислое прекурсора деления. Баланс между силой натяжения и изгибной упругостью определяет значение радиуса мембранного цилиндра

В качестве модели перешейка - прекурсора деления - мы использовали мембранные нанотрубки (НТ), которые вытягивали из ЛБ с помощью пэтч-кламп технологии [59] (см. Материалы и методы). Нами использовались бислойные липидные мембраны (БЛМ), как ЛБ с большим латеральным натяжением, и гигантские униламеллярные везикулы (ГУВ), как система с низким латеральным натяжением.

Радиус НТ определяли из зависимости ионной проводимости ее просвета GНТ от длины LНТ (см. Материалы и Методы), согласно уравнению

Как и предсказывает уравнение (48), кривизна мембраны НТ полностью определяется механическими параметрами “материнской” мембраны (резервуара). Различие на два порядка в значениях радиусов НТ, вытянутых из БЛМ и ГУВ (Рисунок 17Б), объясняется различием латеральных натяжений в системах. Это наблюдение подтверждает возможную роль натяжения в генерации структур с критической кривизной – прекурсоров деления мембраны. Однако, согласно литературным данным, увеличение натяжения мембраны возможно только до определенного значения, дальнейший рост сопровождается потерей стабильности ЛБ – формированием в нем проводящих дефектов и разрывом [177]. Это существенно ограничивает кривизну, которую можно создать за счет латерального натяжения. Так при вытягивании НТ из ГУВ, чье латеральное натяжение контролируется с помощью аспирационной методики (Рисунок 5), минимальный достижимый радиус НТ составляет 10 нм, дальнейшие попытки его уменьшить за счет увеличения натяжения (48) приводят к разрыву везикулы. БЛМ, сформированные методом Рудина-Мюллера, из раствора липидов в органическом растворителе (сквалан), представляют собой ЛБ подверженные значительно более высокому натяжению. Поэтому НТ, вытянутые из БЛМ, могут иметь радиус меньше 10 нм [60], но даже в этом случае практически невозможно создать критическую кривизну, из-за высокой вероятности дестабилизации БЛМ большим натяжением.

Как уже отмечалось выше, в клетке критическая кривизна создается специализированными белками [121]. Существует несколько молекулярных механизмов, лежащих в основе морфогенеза клеточных мембран белками, вкратце они представлены в разделе 1.5. Одним из таких способов является частичное встраивание амфифильного участка белка в границу раздела полярной и гидрофобной областей мембраны. Считается, что при этом белок индуцирует спонтанную кривизну в мембране и тем самым способствует ее деформированию. Белок эпсин человека – наиболее яркий представитель, действующий по такому сценарию. Его N-концевой домен ENTH при специфическом взаимодействии с отрицательно заряженным липидом PIP2 образует дополнительную амфифильную спираль, которая встраивается на уровне полярных голов мембраны. Показано, что ENTH не только индуцирует спонтанную кривизну, но также в некоторых условиях, хотя и далеких от физиологических, способен осуществлять деление мембраны [128, 134]. При этом ENTH не полимеризуется на поверхности мембраны. Поэтому мы использовали именно этот белок для увеличения кривизны мембраны НТ. Для привлечения белка на поверхность мембраны к базовой липидной композиции (DOPC+30 моль% Chol) добавляли отрицательно заряженные липиды DOPS. Показано, что ENTH накапливался на поверхности мембраны в результате неспецифического электростатического взаимодействия с DOPS. Так с помощью метода флотационного анализа в лаборатории наномеханики мембран (руководитель проф. Фролов В.А.) департамента биофизики университета страны басков (Лейоа, Испания) было показано заметное связывание белка с поверхностью липосом уже при концентрации 20 моль% DOPS (Рисунок 18А).

Это подтверждает адсорбцию ENTH на поверхность мембраны исключительно за счет неспецифического электростатического взаимодействия, что также было показано в работе [178]. Как и ожидалось, в присутствии 1 моль% PIP2 связывание было в несколько раз выше, что доказывает важнейшую роль PIP2 в регуляции поверхностной концентрации эпсина в клетках. Также сорбция ENTH на липидный бислой, содержащий 20 моль% DOPS, была подтверждена методом флуоресцентной микроскопии. Для визуализации ЛБ, закрепленного на поверхности стеклянного шарика - бида (40 мкм), в состав мембраны добавляли 0.5 моль% DOPE-Rh (Рисунок 18Б, красный канал), а для наблюдения за ENTH использовали белок, модифицированный красителем А1еха488 (Рисунок 18Б, зеленый канал), который добавляли в окружающий раствор в концентрации 0.5 мкМ. Совпадение изображений, полученных для ЛБ и белка, однозначно свидетельствуют о связывании ENTH с мембраной.

Кинетику адсорбции ENTH на поверхность БЛМ, содержащих разное количество заряженного липида (20 моль% и 40 моль% DOPS), исследовали с помощью метода компенсации внутримембранного поля (КВП) [174] (см. Материалы и Методы). Белок добавляли с одной из сторон БЛМ в концентрации 0.5 мкМ и при постоянном перемешивании измеряли возникающий на мембране граничный потенциал. Характерное время адсорбции составляло около 20 с (Рисунок 19А). Увеличение плотности поверхностного заряда в два раза примерно вдвое увеличивала итоговую амплитуду изменения граничного потенциала у мембраны, что говорит о линейном характере зависимости поверхностной концентрации ENTH от заряда мембраны.

Влияние миграции заряженных компонентов на измерения

В растворе электролита появление заряженного липида в мембране приводит к появлению двойного электрического слоя у ее поверхности, компенсирующего поверхностный заряд мембраны. Концентрация ионов в двойном электрическом слое может существенно отличаться от объемной с0. Когда характерный размер двойного электрического слоя – длина Дебая, D становится сравнима с радиусом люмена мембранной НТ, его вклад в интегральную ионную проводимость может стать существенным. В этом случае удельное сопротивление электролита внутри НТ будет меньше объемного значения. Для длинных и узких НТ удельное сопротивление электролита внутри НТ можно найти из уравнения (2.2).

Важно также учитывать то, что стенка НТ представляет собой двумерную жидкость – липидный бислой, в котором могут возникать явления переноса. При возникновении разности электрических потенциалов между раствором в пипетке и объемом на заряженные компоненты мембраны начинает действовать сила со стороны электрического поля, которая может заставить перемещаться заряженные компоненты вдоль или против силовых линий поля в зависимости от знака их заряда. Это может приводить к изменению концентрации заряженных мембранных компонентов во внутреннем монослое НТ, что в свою очередь может повлечь за собой изменение механических параметров НТ.

Нами было проведено исследование миграции заряженных молекул DOPS вдоль внутренней поверхности НТ под действием электрического поля. При положительных значениях потенциала в пипетке молекулам DOPS становится энергетически выгодно находится в монослое “пэтч”-мембраны, обращенным к объему пипетки, поэтому должен возникнуть поток молекул DOPS во внутреннем монослое НТ от БЛМ к пипетке. Этот поток прекратится, как только поток по градиенту потенциала будет компенсирован противоположным потоком по градиенту концентраций.

Нами было показано, что на характерных временах измерений, проводимых в данной работе, не происходило существенного изменения концентрации заряженного липида во внутреннем монослое НТ (Рисунок 35). Добавление заряженного липида не приводило к существенному изменению радиуса люмена НТ, ее натяжению и модуля изгиба.

Естественно ожидать, что увеличение удельного заряда мембранного компонента может значительно усиливать вклад электромиграции в измерения. Для подтверждения данного предположения в качестве заряженной молекулы аналита мы использовали модифицированные нити одноцепочечной ДНК, содержащие 49 нуклеотидных остатков. Длина нити составляет примерно 18 нм. Методом КВП мы показали, что за счет наличия на 5 -конце гидрофобной молекулы холестерина комплекс ДНК-холестерин необратимо встраивался в липидный бислой, что позволяло достигать существенной поверхностной концентрации при малом содержании в объеме: амплитуда изменения граничного потенциала составляла 16 ± 4 мВ (SD, N = 6) (Рисунок 36) и не зависела ни от объемной концентрации ДНК в пределах от 0.1 до 1 мкМ, ни от липидного состава БЛМ, кроме того, после отмывки ДНК из объема потенциал сохранял свое значение.

Мы вытягивали НТ из БЛМ, фиксировали ее длину LНТ 300 нм и затем добавляли в объем, омывающий БЛМ, комплекс ДНК-холестерин в концентрации 0.05–0.1 мкМ. Концентрация раствора электролита 10 мМ KCl, 0.5 мМ Hepes, 0.05 мМ ЭДТА, при этом нами было показано, что в случае отсутствия свободных зарядов на поверхности мембраны радиус люмена НТ не зависит от ионной силы раствора, т.е. изменение концентрации KCl в растворе не оказывает какого-либо существенного влияния на эластические параметры мембраны (модуль изгиба, латеральное натяжение) (концентрацию электролита (KCl) изменяли в диапазоне от 1 М до 10 мМ.).

Раствор электролита, которым была заполнена пипетка, не содержал молекул ДНК, и для предотвращения входа молекул ДНК внутрь НТ в пипетке поддерживали отрицательный электрический потенциал относительно объема (–100 мВ) в течение 1–2 мин. За это время, согласно нашим данным по исследованию кинетики адсорбции, концентрация ДНК на обеих поверхностях БЛМ должна достигнуть 20–30% от своего максимального значения. Затем потенциал внутри пипетки изменяли на противоположный (+100 мВ). В результате инвертирования потенциала амплитуда тока, текущего через НТ радиусом 7.3 нм, увеличивалась в 2–3 раза. Значение ионного тока также быстро возвращалось к своему исходному значению при изменении потенциала обратно до –100 мВ. Увеличение ионного тока ассоциировали с входом молекул ДНК внутрь канала НТ. В растворе электролита заряженная молекула ДНК окружена экранирующим слоем ионов, который компенсирует ее заряд. Толщина экранирующего слоя и концентрация ионов в нем определяется ионной силой раствора. В случае слабой ионной силы раствора концентрация ионов вокруг ДНК значительно превосходит концентрацию ионов в объеме. Соответственно при попадании заряженной молекулы ДНК внутрь канала НТ происходит локальное значительное увеличение концентрации ионов и, как следствие, уменьшение интегрального электрического сопротивления люмена НТ, что в свою очередь приводит к увеличению ионного тока.

Как и ожидалось, в условиях более высокой ионной силы (100 мМ KCl) эффект увеличения проводимости в ответ на инвертирование потенциала не регистрировался – проводимость оставалась неизменной. В данном случае концентрация ионов внутри НТ при наличии там молекул ДНК должна слабо отличаться от объемного значения.

Таким образом мы показали, что при наличии потенциала между раствором в пипетке и объемом на заряженные компоненты мембраны начинает действовать сила со стороны электрического поля, которая может заставить перемещаться заряженные компоненты мембраны согласно направлению силовых линий поля, изменяя амплитуду ионного тока, текущего через НТ.