Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. Методы исследования 21
2.1.Оптическая когерентная томография 21
2.2. Нелинейная микроскопия
2.2.1. Микроскопия с использованием генерации второй гармоники
2.2.2. Флуоресцентная микроскопия с двухфотонным возбуждением
3. Объекты исследования 35
3.1.Диффузия химических агентов в биотканях 35
3.2. Просветление биотканей при диффузии иммерсионных агентов
3.3.Строение тканей зуба и использование ОКТ для их исследования
3.3.1. Основные сведения о строении зуба 40
3.3.2. Использование ОКТ для исследования тканей зуба 46
3.4.Строение ногтя пальца человека и применение ОКТ для его исследования
3.5.Строение жировой ткани и проблема разрушения адипоцитов 52
4. Окт мониторинг диффузии иммерсионных агентов в образцах зубной ткани in vitro
4.1.Подготовка образцов 56
4.2. Схема экспериментальной установки и методика обработки результатов
4.2.1. Описание экспериментальной установки 57
4.2.2. Обработка полученных данных. Модель формирования сигнала ОКТ
4.3.Результаты измерений и их обсуждение 66
4.3.1. Мониторинг проникновения воды и глицерина в ткани зуба методом ОКТ
4.3.2. Исследование изменений дентина под действием глюкозы методом ОКТ 3
5. ОКТ измерения в тканях ногтя in vivo и образцах жировой ткани
5.1.ОКТ визуализация тканей пальца человека 74
5.2. ОКТ исследования фотоиндуцированных изменений жировой ткани
6. Модельные расчеты проницаемости дентина и формирования сигнала окт в процессе оптического просветления
6.1.Модельный расчет проницаемости дентина для химических агентов
6.2.Численное моделирование нестационарного сигнала ОКТ, формирующегося в процессе оптического просветления рассеивающей среды
7. Оптический монторинг проникновения наночастиц в образцы зубной ткани in vitro
7.1.Изменения формы ОКТ сигнала после ультразвукового 108
воздействия на образцы тканей зуба, погруженные во взвесь наночастиц
7.2.Нелинейная микроскопия проникновения наночастиц в образцы тканей зуба
Заключение 122
Список цитируемой литературы
- Нелинейная микроскопия
- Просветление биотканей при диффузии иммерсионных агентов
- Схема экспериментальной установки и методика обработки результатов
- ОКТ исследования фотоиндуцированных изменений жировой ткани
Введение к работе
Актуальность исследования. Изучение транспорта химических агентов в биологических тканях, в том числе в твердых тканях, является важной задачей по ряду причин. Первой из них является необходимость изучения метаболических процессов, осуществляемых посредством диффузии. Вторая причина связана с диагностикой биоткани оптическими методами, в частности, с помощью оптической когерентной томографии (ОКТ). Основным препятствием для проникновения оптического излучения вглубь биологической ткани является рассеяние света на структурных элементах, показатель преломления которых отличается от показателя преломления базового вещества. Уменьшить рассеяние можно путем введения в биоткань химических агентов, выравнивающих указанные показатели преломления (метод оптического просветления).
Исследование проницаемости биотканей человека по отношению к различным агентам и лекарственным препаратам представляет интерес в широком контексте проблем, связанных с их лечением и косметологическим уходом. Одним из возможных методов изучения распространения химических агентов в биотканях является ОКТ.
Метод ОКТ в настоящее время является одним из наиболее перспективных и развивающихся методов неинвазивной диагностики оптически неоднородных сред. Основой метода является интерферометрическая регистрация низкокогерентного оптического излучения, отраженного от различных слоев биоткани. По сравнению с другими распространенными системами визуализации внутренней структуры объекта, такими как рентгеновская, магнитно-резонансная и ультразвуковая томография, ОКТ имеет преимущества по безопасности использования, стоимости оборудования, контрасту и разрешению получаемых изображений. Метод ОКТ исходно предназначен для визуализации, однако, обработка цифровых ОКТ-изображений позволяет извлечь количественные данные об оптических параметрах рассеивающей биоткани и ее морфологическом и функциональном состоянии. Такие исследования уже проводились, но для ограниченного числа биотканей (кровь, склера глаза, эпителий). Распространение данного подхода на более широкий круг биотканей, к которым относятся эмаль и дентин зуба, ткани ногтя и жировая ткань, является актуальной задачей.
Среди применений ОКТ в стоматологии преобладает визуализация структуры тканей зубов и полости рта in vivo для оценки их состояния по полученным изображениям. Мониторинг проникновения химических агентов в ткани зуба на основе математической обработки цифровых ОКТ изображений - новая и актуальная задача.
Проникновение в ткани зуба наночастиц - не менее важная проблема, чем транспорт химических агентов. С введением наночастиц в тубулы дентина связана разработка методов снижения гиперчувствительности зуба. Внедренные наночастицы могут оказывать бактерицидное действие, усиливать фотодинамическое воздействие, выполнять косметические функции, способствуя отбеливанию. В связи с этим актуальной задачей является развитие оптических методов для простого и неинвазивного контроля доставки наночастиц в ткань зуба. В качестве таковых представляет интерес использовать ОКТ и нелинейную микроскопию, также дающую послойное изображение, но с более высоким разрешением, достаточным для регистрации сигналов от отдельных наночастиц и их скоплений.
В силу доступности и особенностей строения ноготь пальца человека является удобным объектом ОКТ-визуализации in vivo. Как и в стоматологии, полученные изображения затем используются для дифференциальной диагностики заболеваний ногтя. Основное внимание разработчиков уделяется повышению контраста и разрешения изображений, а также скорости их получения. Актуальной задачей является применить ОКТ для изучения таких внешних воздействий на ткани ногтя in vivo (механическое сжатие, нанесение иммерсионного агента), которые могут вызывать оптическое просветление. Новые возможности можно ожидать от использования как видимых изменений самих ОКТ изображений, так и результатов их цифровой обработки в виде количественных оценок изменений геометрических и оптических параметров биотканей ногтя, что важно для мониторинга грибковых заболеваний ногтя и ряда системных заболеваний человека.
Действие оптического излучения, усиленное введением в биоткань красителя, в последнее время широко изучается в связи с целым рядом биомедицинских приложений, одно из которых – снижение количества жировых клеток, что представляет собой важную часть медицинских программ по борьбе с ожирением. Значительные размеры адипоцитов позволяют получать ОКТ изображения жировой ткани, на которых отдельные клетки хорошо видны, что открывает уникальную возможность использовать ОКТ для мониторинга последствий фотодинамического воздействия в
реальном времени на клеточном уровне. Такое применение ОКТ является актуальной задачей, а полученные ОКТ-изображения могут быть количественно обработаны с целью ответа на важный вопрос о том, что происходит с отдельными адипоцитами при фотодинамическом или ином воздействии.
Цель работы - изучить процессы доставки химических агентов и наночастиц в биоткани путем ОКТ-визуализации с цифровой обработкой изображений для количественного определения диффузионных и оптических свойств биотканей и их изменений под действием внешних факторов, а также с помощью нелинейной микроскопии. Основные объекты - образцы тканей зуба человека и жировой ткани in vitro, а также ткани ногтя пальца человека in vivo.
Задачи исследования:
ОКТ-мониторинг проникновения вызывающих оптическое просветление химических агентов (вода, глицерин, глюкоза) в образцы in vitro дентина зуба человека и оценка коэффициентов проницаемости по скорости изменения среднего наклона А-скана.
Оценка оптических параметров эпителиальных и фиброзных тканей под ногтем пальца человека in vivo и их изменений под действием просветляющего агента и механического сжатия с помощью цифровой обработки ОКТ изображений.
ОКТ-мониторинг последствий фотодинамического воздействия на образцы жировой ткани in vitro в реальном времени на клеточном уровне
Расчет проницаемости дентина по отношению к воде и перекиси водорода как функции размеров тубул и плотности их числа на основе простой модели тубулярной структуры.
Разработка модели и численный расчет пространственно-временного поведения сигнала ОКТ при диффузии иммерсионного агента в макроскопически-неоднородной рассеивающей среде на основе численного решения уравнения диффузии с учетом зависимости сечения рассеяния назад от концентрации агента.
Определение глубины проникновения наночастиц TiO2 и ZnO в образцы дентина и эмали зуба человека методами ОКТ и нелинейной микроскопии.
Научная новизна работы:
Методика оценки коэффициента проницаемости по скорости изменения среднего наклона сигнала ОКТ во времени впервые применена к
проникновению оптически просветляющих химических агентов (вода, глицерин, глюкоза) в образцы in vitro дентина зуба человека.
Оценки коэффициентов ослабления света эпителиальными и фиброзными тканями под ногтем пальца человека in vivo впервые получены по результатам обработки ОКТ-изображений, продемонстрированы и оценены их изменения под действием просветляющего агента (глицерин) и механического сжатия.
Впервые осуществлен ОКТ-мониторинг долговременных (десятки и сотни минут) последствий совместного воздействия света и красителя на образцы жировой ткани in vitro на клеточном уровне.
С помощью простой модели тубулярной структуры дентина впервые рассчитаны зависимости коэффициентов проницаемости дентина по отношению к воде и перекиси водорода от диаметра и плотности числа тубул.
На основе численного решения уравнения диффузии и известной теории формирования ОКТ сигнала в рассеивающей среде с заданными параметрами построена математическая модель эволюции ОКТ сигнала в процессе диффузии иммерсионного агента. В отличие от известных аналитических решений, модель применима к макроскопически неоднородным средам. Показано, что уменьшение сечения рассеяния назад при оптическом просветлении может приводить к немонотонному поведению сигнала ОКТ даже в макроскопически однородной среде.
Впервые обнаружены заметные изменения формы усредненного сигнала ОКТ после длительной ультразвуковой обработки образца дентина зуба человека, погруженного во взвесь наночастиц TiO2. Определение глубины проникновения наночастиц TiO2 и ZnO в образцы дентина и эмали зуба человека впервые выполнено методами нелинейной микроскопии.
Научная и практическая значимость работы.
Доказана возможность использования серийного портативного оптического когерентного томографа THORLABS Spectral Radar OCT, исходно предназначенного для получения изображений биотканей in vivo в условиях медицинского учреждения, для решения фундаментальной биофизической задачи - мониторинга оптических, диффузионных и морфологических характеристик дентина и эмали зуба человека, тканей ногтя и жировой ткани в реальном времени при воздействии внешних факторов (аппликация иммерсионного агента или взвеси наночастиц, механическое сжатие, фотодинамическое воздействие).
Исследования диффузии просветляющих агентов в образцах дентина зуба человека подтвердили, что калибровка сигнала ОКТ, существенная для оценки коэффициента ослабления по его наклону, мало сказывается на характерном времени изменения указанного наклона и, следовательно, на оценке коэффициента проницаемости, которая является достаточно универсальной.
Исследования тканей ногтя человека показывают, что с помощью ОКТ можно проводить не только визуализацию подобных биотканей in vivo, но и количественно определять относительные изменения оптических характеристик (коэффициента ослабления) под действием просветляющего агента или механического сжатия, что расширяет сферу практического (и в отдаленной перспективе, клинического) применения ОКТ.
Выполненные автором диссертации ОКТ исследования образцов жировой ткани человека были использованы для получения дополнительной информации о механизмах фотодинамического воздействия на жировую ткань, что важно для медицинских исследований, направленных на борьбу с ожирением.
Реализованная в виде численного алгоритма и программы модель формирования сигнала ОКТ в среде, испытывающей оптическое просветление в результате диффузии иммерсионного агента, применима к неоднородным средам и может быть полезна как для интерпретации будущих экспериментов, так и для использования в алгоритмах решения обратной задачи извлечения исходных оптических и диффузионных параметров среды из данных ОКТ-измерений.
Помимо демонстрации возможностей оптического мониторинга проникновения наночастиц в образцы дентина и эмали зуба человека, практическая важность полученных в этом направлении результатов состоит в том, что они показывают весьма низкую эффективность «спонтанного» внедрения наночастиц в дентин и, тем более, эмаль зуба при погружении во взвесь наночастиц или при нанесении таковой на поверхность зуба и убеждают в необходимости поиска дополнительных мер интенсификации этого процесса.
На защиту выносятся следующие положения:
1. При исследовании плотных сильно рассеивающих биотканей (ткани зуба и ногтя человека) методика обработки цифровых ОКТ изображений, основанная на усреднении сигнала по группе А-сканов, позволяет лучше выявить как структурные элементы биоткани, так и сравнительно небольшие изменения сигнала ОКТ, вызванные внешними воздействиями (аппликация
иммерсионного агента, механическое давление) и слабо различимые визуально на исходном ОКТ изображении.
2. Методика обработки цифровых ОКТ-изображений с расчетом усредненного
А-скана позволяет проводить мониторинг проникновения химических агентов
в образцы тканей зуба человека по изменению среднего наклона сигнала ОКТ
в реальном времени. Получаемые в результате постоянная времени
насыщения и коэффициент проницаемости значительно менее чувствительны
к калибровке сигнала, вкладу многократного рассеяния, а также наличию и
характеру макроскопической неоднородности биоткани, чем сам наклон
сигнала ОКТ и определяемый по нему коэффициент ослабления света
биотканью.
-
Как показывает численное моделирование пространственно-временного поведения сигнала ОКТ в среде, где происходит диффузия иммерсионного агента, учет зависимости сечения рассеяния назад от концентрации агента существенно сказывается на пространственном поведении сигнала ОКТ и может приводить появлению на А-скане максимума, который является индикатором указанного влияния.
-
Длительное (несколько суток) содержание срезов дентина и эмали зуба человека во взвеси наночастиц TiO2 с периодическим (несколько раз в сутки) включением ультразвука приводит к заметным (до 5 дБ) изменениям формы усредненного А-скана ОКТ на глубинах, достигающих сотен микрометров. Эти данные свидетельствуют о проникновении наночастиц в образцы, но их недостаточно для оценки глубины проникновения, которая может быть завышена за счет многократного рассеяния. Прямая визуализация внедренных наночастиц методами нелинейной микроскопии показывает, что при небольших (до 30 минут) длительностях УЗ обработки срезов зуба человека, погруженных в суспензию наночастиц, глубина проникновения наночастиц ZnO в срезы дентина достигает десятков микрометров, а для наночастиц TiO2 на порядок меньше, что можно объяснить большей степенью агрегации последних.
Достоверность результатов вытекает, прежде всего, из корректного использования современных и предварительно апробированных приборов и методик исследования (спектральный оптический когерентный томограф THORLABS Spectral Radar OCT (США); двухфотонный томограф JenLab GmbH (Германия) с титан-сапфировым фемтосекундным лазером Mai Tai XF, Spectra Physics (США), оптические и электронные микроскопы и др.). При
обработке результатов использовались пакеты прикладных программ, математические модели, и приближения, апробированные ранее другими авторами на родственных объектах. Там, где позволяли условия эксперимента, измерения проводились многократно с последующим статистическим усреднением. Результаты и выводы согласуются с современными представлениями о механизмах изученных процессов и опубликованными результатами других авторов, полученными с помощью альтернативных методов.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на конференциях: Saratov Fall Meeting 2007 (SFM 2007), September, 25-28, 2007, Saratov, Russia; The International Topical Meeting on Optical Sensing and Artificial Vision 2008 (OSAV 2008), May, 12-15, 2008, St.-Petersburg, Russia; Biophotonics and Imaging Graduate Summer School (BIGSS’08), August, 29-September, 2, 2008, University of Limerick, Ireland; Scientific Meeting of EC-project “Photonics4Life”, November, 18-19, 2008, Brussels, Belgium; SPIE Optics+Photonics 2009, August 1-6, 2009, San Diego, USA; Saratov Fall Meeting 2009 (SFM 2009), September, 21-24, 2009, Saratov, Russia; Scientific Meeting of EC-project “Photonics4Life”, November, 6-18, 2009, Barcelona, Spain; SPIE Photonics West 2010, January, 23-28, 2010, San Francisco, USA; Научно-практическая конференция Presenting Academic Achievements to the World: 29-30 марта, 2010, Саратов, Россия; SPIE Photonics Europe 2010,April, 12-16, 2010, Brussels, Belgium; 71-я научно-практическая конференция студентов и молодых учёных Саратовского медицинского университета. «Молодые ученые – здравоохранению региона» МУ-ЗР’10: 22-24 апреля, 2010, Саратов, Россия; Saratov Fall Meeting 2010 (SFM 2010), October, 5-8, 2010, Saratov, Russia; SPIE Photonics West 2011, January, 22-27, 2011, San Francisco, USA; Saratov Fall Meeting 2011 (SFM 2011), September, 27-30, 2011, Saratov, Russia; SPIE Photonics West 2012, January, 21-26, 2012, San Francisco, USA; SPIE Photonics Europe 2012, April, 16-19, 2012, Brussels, Belgium; Russian-Chinese Workshop: Biophotonics and Biomedical Optics, SFM 2012, 26-28 September, 2012, Saratov, Russia; SFM 2012, 25-28 September, 2012, Saratov, Russia; 1st International Biophotonics Meeting in Israel, Conference BPI12, Tel Aviv, Israel, 9-11 December, 2012; SPIE Photonics West 2013, San Francisco, USA; February, 2-7, 2013.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 статей, из них 13 в рецензируемых изданиях, удовлетворяющих требованиям пунктов 12 и 13 «Положения о присуждении ученых степеней» (входящих в SCOPUS и/или Перечень ВАК).
Личный вклад автора состоит в участии в постановке задач и планировании работ совместно с руководителем проф. Тучиным В.В., в проведении экспериментов и обработке их данных, в проведении расчетов, в написании статей и презентации результатов на конференциях. Исследования по двухфотонной микроскопии проникновения наночастиц в ткани зуба проводились совместно с М.Е. Дарвиным в Центре экспериментальной и прикладной кожной физиологии Медицинского университета «Шарите», Берлин, Германия под руководством профессора Ю. Ладеманна. Исследования жировой ткани проводились совместно с И.Ю. Яниной, которая использовала результаты ОКТ-исследований автора диссертации для дальнейшей статистической обработки и интерпретации.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, основной части, содержащей 6 разделов, заключения и списка цитируемой литературы, включающего 317 наименований, содержит 45 рисунков и 3 таблицы. Объем диссертации составляет 157 страниц.
Нелинейная микроскопия
Параллельно с совершенствованием ОКТ как средства получения трехмерных изображений продолжают развиваться применения ОКТ для количественного определения тех или иных оптических параметров биоткани и их пространственного распределения. Поскольку в ОКТ используются широкополосные источники света, из ОКТ сигнала можно извлекать спектроскопическую информацию, то есть осуществлять спектроскопическое исследование биоткани с пространственным разрешением [86–89]. Такая методика называется спектроскопической ОКТ (СОКТ). Morgner и др. (2000) впервые предложили вариант временной широкополосной СОКТ с использованием сдвига центра тяжести спектра в качестве количественного индикатора спектральных изменений [86]. В работах [87, 90] на основе измеренных с разрешением по глубине спектров рассеяния назад и передаточных функций ткани была произведена количественная оценка распределения концентрации поглощающих центров. Модификация спектра рассеянного назад излучения обусловлена двумя механизмами: поглощением и рассеянием. Измерение поглощения в сочетании с использованием закона Бугера-Ламберта-Бера открывает возможность измерения концентраций таких сильно поглощающих биологических веществ, как гемоглобин, цитохромы и меланин с разрешением по глубине [91]. Аналогично можно получать распределение концентраций экзогенных контрастных агентов, таких как органические красители [92]. По данным измерений рассеяния с помощью теории рассеяния можно идентифицировать клеточные и субклеточные морфологические и биохимические изменения, такие как изменение отношения «ядро/цитоплазма» на ранней стадии развития опухолей [93]. Однако, стандартная ОКТ в мутных средах не позволяет дифференцировать вклады рассеяния и поглощения. Поэтому в большинстве первых работ по СОКТ спектральные изменения относились на счет поглощения, а вклад рассеяния считался пренебрежимо малым. Это предположение далеко от реальности, так как большинство биотканей рассеивают свет сильнее, чем поглощают. Даже при использовании специально подобранных поглощающих красителей в качестве контрастных агентов вклад рассеяния не может быть сделан пренебрежимо малым, так как концентрация красителя в биоткани не может быть как угодно высокой. Сложность разделения вкладов поглощения и рассеяния возникает от слишком большого числа переменных, подлежащих определению при решении обратной задачи. Иногда, например, при использовании красителей, сильно поглощающих в ближней ИК области, спектр красителя известен априори и сильно отличается от спектра рассеяния биоткани. В таких случаях разделение вкладов рассеяния и поглощения становится возможным (см., например, [94–96]).
Ряд авторов обратились к проблеме получения количественной информации об оптических свойствах рассеивающих образцов с помощью низкокогерентной интерферометрии (НКИ) и ОКТ. Для обеспечения высокой точности таких оценок требуется знание связи между оптическими свойствами рассеивающего образца и сигналом НКИ [97-101], а также роли спекл-шума в отображении оптических свойств [89,102,103]. В работе [104] продемонстрировано применение НКИ для измерений диффузии красителя в рассеивающих фантомах биоткани. Коэффициент диффузии фталоцианинового красителя был измерен в 1.5% агаровом геле, содержащем интралипид в качестве рассеивающего компонента, c использованием интерферометрии на двух длинах волн. Коэффициент диффузии красителя оценивался путем подгонки математической модели интерферометрического сигнала к экспериментально измеренной огибающей НКИ. Результаты показывают, что метод пригоден для образцов с непрерывными пространственными вариациями коэффициента рас 29 сеяния на расстояниях, ограниченных снизу длиной когерентности зондирующего излучения, и позволяет характеризовать процесс диффузии в рассеивающих средах in situ.
Методика неинвазивной оценки молекулярной диффузии в биотканях с помощью ОКТ была предложена Лариным и соавторами [105-109]. Они показали, что, используя ОКТ с одним источником света, можно осуществить мониторинг диффузии глюкозы в биотканях на основе анализа рассеивающих свойств биоткани с разрешением по времени и глубине, наблюдая за временной эволюцией А-скана [110]. Полученные результаты говорят о том, что метод ОКТ можно успешно применять для функционального имиджинга и количественной характеристики процессов диффузии как в фантомах, имитирующих биоткани, так и в самих биотканях. В работе [105] были представлены результаты пилотных исследований по применению ОКТ для мониторинга и количественной характеристики диффузии различных агентов в склере и роговице цельного глаза кролика ex vivo. Исследования по ОКТ-мониторингу диффузии глюкозы и других агентов, проведенные в рассеивающих средах со стабильными оптическими свойствами, на животных и человеке, продемонстрировали: способность метода ОКТ обнаруживать изменения коэффициента рассеяния с точностью около 1,5% в средах со стабильными оптическими свойствами; хорошую корреляцию изменений наклона сигнала ОКТ на глубине 150-900 мкм в коже с изменениями концентрации глюкозы в крови у животных; хорошую корреляцию изменений наклона сигнала ОКТ на глубине 200 -1000 мкм в коже с изменениями концентрации глюкозы в крови у человека; возможность повысить точность, чувствительность и специфичность неин-вазивного мониторинга концентрации глюкозы в крови с помощью метода ОКТ за счет использования оптимизированных систем ОКТ. Эти выводы стимулируют интерес к дальнейшему развитию техники ОКТ-мониторинга диффузии химических агентов, совершенствованию предложенной методики и ее распространению на различные проникающие агенты и новые типы биотканей, в частности, на ткани человеческого зуба, что составляет одну из основных задач настоящей работы.
Просветление биотканей при диффузии иммерсионных агентов
Эффект генерации второй гармоники (ГВГ) света – первый нелинейно-оптический эффект, экспериментально обнаруженный в кристалле кварца почти сразу после создания лазера [111]. Первое наблюдение ГВГ в биологических тканях относится к 1971 году [112]. Использование конфокального сканирующего микроскопа в сочетании с фемтосекундным титан-сапфировым лазером в качестве источника света привело к появлению ГВГ микроскопии, которая впервые была применена к биологическому объекту в работе [113]. Это вызвало бурный рост числа публикаций по различным применениям ГВГ, в том числе, в микроскопии и визуализации структуры биологических объектов [114-117]. В 2010 году ГВГ-микроскопия была успешно применена для исследований, проводимых на лабораторных животных in vivo [118,119].
Особенностью формирования сигнала второй гармоники в условиях возбуждения ультракоротким импульсом является то, что такой импульс имеет незначительную энергию, что обеспечивает неинвазивность воздействия, и при этом гигантскую пиковую мощность (и, соответственно, амплитуду электрического поля), что дает возможность получать доступные для регистрации величины интенсивности света на удвоенной частоте даже при малых коэффициентах преобразования. В стационарном режиме для обеспечения заметной перекачки энергии из первой гармоники во вторую требуется выполнение хорошо известных условий синхронизма (см., например, [120, 121]), а также прохождение синхронизированными волнами достаточного для перекачки расстояния в среде. В режиме ультракороткого импульса и высокочувствительной регистрации слабого сигнала на удвоенной частоте условия синхронизма не являются обязательными. Фактически в этом случае можно регистрировать излучение (некогерентное) отдельных молекул, обладающих нелинейной поляризуемостью. В результате можно регистрировать излучение на частоте второй гармоники в различных направлениях, в частности, назад. По существу, в этом случае имеет место нелинейное молекулярное рассеяние. Основным требованием для его существования является наличие нелинейной поляризуемости молекул. Одной из биологических сред с большой нелинейной восприимчивостью и сильным сигналом ГВГ является коллаген, входящий в состав соединительных тканей [122], что обусловило значительный интерес к его исследованиям с помощью ГВГ [113, 123, 124]. Описаны спектральные различия сигнала второй гармоники нормальной и раковой ткани, что делает ГВГ-мик-роскопию полезной в онкологии [125]. ГВГ может служить не только для обнаружения и визуализации коллагена [126], но и для различения его типов, например, кристаллический коллаген I типа генерирует более мощный сигнал, чем коллаген III типа на одной и той же длине волны [124]. Авторы [127] проводили исследования ГВГ в твердых тканях зуба и пришли к заключению, что ГВГ вызвано скорее коллагеном, чем кристаллами гидроксиапатита ( Са10(РО4)6(ОН)2). Более того сообщалось, что ГВГ не наблюдается в пораженных кариесом тканях, что дает дополнительный способ их обнаружения.
Возможность регистрации ГВГ в направлении назад позволяет реализовать на базе одной оптической схемы сканирующего микроскопа два физических принципа, а именно, ГВГ и флуоресценцию с двухфотонным возбуждением. Оба эти принципа позволяют получать объемное изображение на глубину порядка миллиметров. Такие приборы часто называют многофотонными оптическим томографами.
В основе лазерной сканирующей микроскопии с двухфотонным возбуждением, впервые практически реализованной в работе [128], лежит явление двух-фотонного поглощения. Теоретически оно было предсказанное в 1931 году [129], а экспериментальное его наблюдение стало возможным лишь в 1961 году с появлением лазеров [130]. Малая вероятность двухфотонного перехода требует высоких интенсивностей возбуждающего излучения, источником которого в настоящее время чаще всего является фемтосекундный титан-сапфировый лазер (длительность импульса 100 фc, частота следования импульсов 80 МГц). Именно с внедрением этого лазера в практику двухфотонное возбуждение стало реальным неинвазивным инструментом исследования биологических объектов (см., например, [131] и ссылки в этой работе, а также более новые публикации, например, [132]). Вероятность двухфотонного возбуждения растет пропорционально квадрату интенсивности возбуждения, а не первой степени, как при однофотонном возбуждении. Поэтому при двухфотонном возбуждении достигается большее аксиальное разрешение, чем это можно достичь в конфокальной микроскопии, так как флуоресценция возбуждается в объеме порядка 10 12 см 3 , а отсутствие необходимости в точечной диафрагме (см. рисунок 2.3) увеличивает число фотонов флуоресценции, собираемых приемником. Дополнительный эффект достигается за счет подбора формы и размеров фокального пятна [133].
Двухфотонный микроскоп меньше повреждает исследуемый образец, чем однофотонный конфокальный микроскоп (см. рис. 2.3), так как, во-пер 34 вых, энергия ИК фотонов недостаточна, чтобы вызвать нежелательные фото-индуцированные изменения, а во-вторых, суммарная энергия фемтосекунд-ных импульсов мала, а высокая мощность достигается за счет их малой длительности. Каждое положение фокуса дает один пиксель, а для получения трехмерного изображения необходимо сканирование. Сканирующая головка обычно образуется двумя зеркалами, угол наклона которых можно быстро менять с помощью гальванометра.
К недостаткам двухфотонного возбуждения флуоресценции относится сравнительно высокая стоимость фемтосекундных лазеров. Спектр двухфо-тонного поглощения молекул может сильно отличаться от спектра однофотон-ного поглощения. Для малых объектов (изолированные клетки) разрешение однофотонной конфокальной микроскопии может быть выше из-за меньшей длины волны возбуждения. Однако, в рассеивающих тканях, высокое разрешение по глубине и более высокий процент регистрации испущенных фотонов обеспечивают преимущество флуоресцентной микроскопии с двухфотонным возбуждением, что способствовало ее применению в физиологии, нейробио-логии, эмбриологии, биоинженерии тканей. Уже в течение первого десятилетия c момента появления с ее помощью удалось детально визуализировать клетки кожи человека in vivo [134]. Благодаря высокой скорости формирования изображения двухфотонная микроскопия флуоресценции может использоваться для неинвазивной оптической биопсии [135].
Схема экспериментальной установки и методика обработки результатов
Основным ограничением проникновения видимого света с длиной волны 400– 700 нм в ткани зуба является рассеяние света [175]. В ИК диапазоне на длинах волн более 1500 нм основным фактором, ограничивающим глубину проникновения в ткань, становится поглощение излучения водой [176, 177]. Поэтому для ОКТ тканей зуба наиболее подходит диапазон длин волн от 700 до 1500 нм. В 2000, Otis и др. достигли высоких результатов, как по качеству ОКТ изображения, так и глубине зондирования тканей зуба, с использованием источников света с длиной волны 1310 нм и 850 нм [61].
В последние годы метод ОКТ получил достаточно широкое распространение в стоматологии [176]. Первые изображения тканей зуба in vitro были опубликованы в 1998 году [178]. Они были получены с использованием временной ОКТ на длине волны 1310 нм и сравнивались с микрофотографией при разрешении 17 мкм. Были продемонстрированы полученные in vitro методом ОКТ изображения переходных слоев «эмаль-цемент» и «десна-зуб» на образцах тканей зуба свиньи. Позднее была осуществлена ОКТ визуализация тканей зуба человека in vivo [179, 180]. На длине волны 1310 нм было достигнуто разрешение 12 мкм при значительной глубине зондирования 3 мм. На ОКТ изображениях уверенно определялись переход между эмалью и дентином и перио-донтальные структуры.
Метод ОКТ успешно применялся для визуализации изменений зубной ткани, вызванных кариесом в начальной стадии [181, 182] и в стадии развитого поражения [83, 181–183], для оценки тяжести поражения [83,183], степени ре-минерализации [184, 185], определения эффективности ингибирования деминерализации химическими агентами [184, 186]. Метод ОКТ использовали для проверки того, как различные агенты, содержащие фтор, ингибируют деминерализацию на модели кариеса in vitro [185], для оценки областей деминерализации вокруг ортодонтических скоб (брекетов) [186], для определения подвижности зубов при ортодонтических нагрузках [187]. Метод ОКТ применялся также для оценки состояния слизистой оболочки полости рта [182], состояния зубных имплантатов [188], целостности зубных протезов [183], их качества и подгонки [181, 182, 184, 188]. Warren и др. выполнили детальное исследование структуры зуба в направлении его вертикальной оси [189] и визуализировали переходные слои между эмалью и дентином, а также между дентином и цементом.
Наряду со структурной визуализацией самих тканей зуба, метод ОКТ использовался также для обнаружения трещин [190–192]. В частности, Imai и др. [190] использовали ОКТ для демонстрации того, как трещины эмали распространяются за границу раздела между эмалью и дентином. Другим важным применением ОКТ явилась визуализация приграничного микропросачивания между тканями зуба и пломбировочным материалом и/или эндодонтическим заполнителем [193–196], например, композитной смолы [196]. Применение ОКТ к комплексу «дентин-пульпа» [197] продемонстрировало возможность отличить пульпу от дентина на ОКТ-изображении и, следовательно, контролировать остаточный слой дентина поверх пульпы, обеспечивая более точный прогноз и тактику лечения зуба. В недавней статье [198] авторы приводят обзор своих ОКТ ex vivo исследований абфракции (микроструктурной потери зубного вещества в областях концентрации напряжения) и аттриции (потери твердых тканей зубов вследствие контакта зубов-антагонистов), дефектов материала и микропротечки на границе зубной ткани и заполнения, качества соединения между твердой тканью зуба и ортодонтическими скобами, результатов протезирования и микропротечки на границе протеза и др. Во всех случаях ОКТ демонстрирует более высокую чувствительность к структурным изменениям материала, чем обычные диагностические методы.
Выше уже кратко упоминалось о применении ОКТ к диагностике кариеса, которым по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в 2009 году страдало 60%–90% детей школьного возраста и подавляющее большинство взрослого населения Земли [199]. Механический износ за счет трения также может приводить к потере зубов. ОКТ обеспечивает возможность раннего обнаружения кариеса [183, 200–202]. Обнаружение сильного двулучепре-ломления в эмали и анизотропного распространения света в тубулярной структуре дентина привело к тому, что многие исследования сосредоточились на применении поляризационно-чувствительной ОКТ к обнаружению кариеса [63, 65, 67, 203–210]. Первые ОКТ изображения кариеса с разрешением по поляризации были получены Baumgartner и др. [67, 203, 204]. Wang и др. измерили двулучепреломление в дентине и эмали и предположили, что призмы эмали ведут себя как волноводы [211] (о модели волноводно-рассеивающей среды [173, 174] для тканей зуба уже говорилось выше). Поляризационно-чув-ствительная ОКТ пригодна для обнаружения вторичного кариеса, так как рассеивающие свойства восстановительных материалов и твердых тканей зуба существенно различаются [206, 207].
ОКТ исследования фотоиндуцированных изменений жировой ткани
Как отмечалось выше, ноготь пальца человека – удобный объект для ОКТ исследований in vivo, отраженных в ряде публикаций (см. ссылки в разделе 3.4). Одним из малоисследованных вопросов остается воздействие химического агента в сочетании с механическим давлением на систему эпителиальных и фиброзных тканей ногтя пальца человека. Результаты ОКТ исследований данного вопроса, излагаемые ниже, подробно описаны в нашей работе [262] и более кратко – в нашем обзоре [109].
Исследовались эпителиальные и фиброзные ткани под ногтем мизинца мужчины-добровольца в возрасте 66 лет. Верхний слой ногтя был частично удален с помощью маникюрной алмазной пилочки. На рис. 5.1 показан схематический разрез пальца с частично удаленным ногтем.
Производилось ОКТ-сканирование в нескольких участках ногтя при касании пластикового ограничителя оптического зонда, ОКТ-сканирование при надавливании ограничителя на ноготь и ОКТ-сканирование после 20 минутного воздействия глицерина на поверхность ногтевой пластинки с частично удаленным верхним слоем. Надавливание осуществлялось с целью уплотнения ткани ногтя и выдавливания части объема крови из области измерений, что должно способствовать увеличению прозрачности и, соответственно, глубины зондирования структур ткани. Как известно из ряда работ, подробный обзор которых недавно выполнен Гениной и соавторами [149], механическое сдавливание, как и иммерсия, является одним из механизмов оптического просветления биотканей. Глицерин также применялся как просветляющий химический агент. При этом сдавливание сильно влияет на перфузию биотканей, тогда как иммерсия главным образом снижает разность показателей преломления.
Обработка полученных данных осуществлялась по методу, описанному в разделе 4.2. При пересчете оптической глубины в геометрическую (zгеом=zопт /n, где п -показатель преломления биоткани) использовались следующие значения показателей преломления иногтя=1,51; «эпидермиса=1,43; «дермы=1,38. Учитывалось также, что для всех биологических тканей коэффициент поглощения в рассматриваемой области длин волн 930+100 нм мал, и основной вклад в ослабление сигнала ОКТ вносит рассеяние [29, 144, 259, 260].
Для трех различных участков ногтя мизинца, отличающихся расстоянием от края ногтя, получены ОКТ изображения, в результате обработки которых построены усредненные А-сканы, по наклону которых затем определены значения среднего коэффициента ослабления для каждого слоя (ноготь, эпидермис, дерма). Основной вклад в ослабление дает рассеяние, поэтому фактически определяется коэффициент рассеяния указанных тканей.
На рис. 5.2а-в показано положение участков 1, 2, 3 и направлений латерального сканирования, а на рис. 5.3 и 5.4 приведены соответствующие ОКТ-изображения и обработанные зависимости сигнала ОКТ от глубины (усредненные А-сканы). Сравнение рис. 5.3 и 5.4 показывает, что усредненный А-скан дает больше информации о структуре слоев ткани, чем простая ОКТ визуализация. В частности, по рис. 5.3а трудно судить о скорости ослабления сигнала в тонком слое ногтя, который выглядит как полоса примерно одинаковой яркости, тогда как обработанный А-скан (рис. 5.4а) такую информацию содержит. Положение границы между эпидермисом и дермой также лучше видно на усредненном А скане, чем на ОКТ-изображении, выводимом на экран монитора. Сказанное относится и к другим участкам ногтя, исследованным в данном эксперименте. (а) (б) (в)
Зависимость ОКТ сигнала от глубины зондирования (усредненный А-скан) для тканей под ногтем мизинца для участков 1 (а), 2 (б) и 3 (в) и рассчитанные значения коэффициента ослабления (рассеяния) для разных слоев ткани. Участок 2 выбирался ближе к краю ногтя (рис. 5.2б), причем направление В-сканирования не отличалось от такового для участка 1. Рис. 5.3б и 5.4б наглядно показывают, что ближе к краю ногтя толщина и структура лежащего под ним эпидермиса меняются по сравнению с участком 1. Участок 3 был выбран на самом краю ногтя (рис. 5.2в). На рис. 5.3в и 5.4в видно, что с переходом в эту область ногтевая пластинка становится толще, меняются также толщина и структура лежащих под ней слоев. Это, конечно, связано с тем, что часть ногтя была спилена, так как у интактного ногтя середина толще. На рис. 5.4 цветом выделены слои ногтя, эпидермиса и дермы, засечками отмечены границы наблюдаемых слоев и численно указаны глубины их расположения. Матрикс ногтевого ложа не попадает в область наблюдения, которая находится ближе к концу пальца. По наклону спадающих участков А-сканов оценены и указаны на рисунках «локальные коэффициенты ослабления» слоев. Эта оценка является весьма условной и требует комментария, так как наклон сигнала ОКТ равен среднему коэффициенту ослабления только в макроскопически однородном слое. Для фантома из чередующихся макроскопически однородных резко разграниченных слоев с большими и малыми сечениями рассеяния назад А-скан имел бы зубчатую форму (рис. 5.5а), причем наклон вершин зубьев и дна впадин между ними был бы связан с ослаблением сигнала каждым однородным слоем.
Если фантом состоит из слоев, у которых сечение рассеяния назад растет с увеличением глубины, то на границах слоев сигнал ОКТ делает скачок вверх, а затем плавно спадает за счет ослабления. В любом случае должен наблюдаться в целом спадающий ход А-скана, поскольку и формирование полезного сигнала (рассеяние назад), и его ослабление (рассеяние во всех других направлениях плюс поглощение) уменьшают мощность предметной волны по мере углубления в среду.
Реальные А-сканы на рис. 5.4. имеют участки плавного возрастания и убывания. Если причиной возрастания может быть только рост отражающей способности среды, то убывание может быть связано как с уменьшением отражения, так и с ослаблением сигнала по пути до зондируемого слоя и обратно. Оценки на рис. 5.4 далее на рис. 5. 7 и 5.9 проведены в приближении, что участки убывания на А-скане обусловлены именно ослаблением (аналогично фантому, показанному на рис. 5.5 (б)), а отражение от слоя к слою только растет. Это предположение нуждается в дополнительной проверке, поэтому приведенные оценки локального коэффициента ослабления слоев являются условными. В частности, плавный рост отражения назад внутри слоя может уменьшать наклон сигнала ОКТ на соответствующем участке А-скана, что даст заниженное значение /л(. Возможно, что именно в этом заключается причина отличия полученных здесь значений /л{ от известных данных для кожи [317].