Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературных данных 12
I. 1. Сворачивание белков 12
I. 1.1. Равновесное разворачивание/сворачивание большинства
глобулярных белков описывается переходом типа «все-или ничего» 14
I. 1.2. Кинетические процессы сворачивания/разворачивания белков.
Шевронные графики 16
I. 1.3. Промежуточные состояния белка, находящиеся «на пути» и «вне пути» сворачивания белка 23
I. 1.4. Структурные особенности промежуточных состояний белков 27
I. 1.5. Равновесное и неравновесное плавление белков 30
I. 2. Комплексные подходы, позволяющие исследовать процесс
самоорганизации многостадийно сворачивающихся белков 37
I. 2.1. ф-Анализ 38
I. 2.2. -Анализ 40
I. 2.3. Генно-инженерные подходы при изучении сворачивания и стабильности белков 42
1.3. Характеристика белков, исследованных в работе 51
I. 3.1. КарбоксиангидразаБ 51
I. 3.2. Зеленый флуоресцентный белок 54
I. 3.3. Апомиоглобин 63
II. Экспериментальная часть
11.1. Материалы и методы 67
П. 1.1. Методы выделения и очистки препаратов 67
П. 1.2. Методы исследований и условия измерений 74 з
П. 2. Развитие экспериментальных методов и подходов для анализа процессов самоорганизации многостадийно сворачивающихся белков
П. 2.1. Подход, позволяющий учесть влияние быстро образующихся (за мертвое время приборов) промежуточных состояний белка на последующие медленные фазы его сворачивания 82
П. 2.1(a). Исследование апомиоглобина 85
П. 2.1 (б). Исследование карбоксиангидразы 90
П. 2.1(B). Выводы 98
П. 2.2. Метод сканирующей калориметрии в применении к исследованию неравновесного плавления белков, разворачивающихся в несколько стадий 99
П. 2.2(a). Неравновесное плавление зеленого флуоресцентного белка 101
Прямой кинетический эксперимент по тепловому разворачиванию GFP-сусІеЗ 106
Сравнение констант скоростей тепловой денатурации, рассчитанных из калориметрических данных и из прямого кинетического эксперимента 108
Особенности структуры переходных и промежуточных состояний GFP-сусІеЗ 109
Последовательность этапов денатурации GFP-сусІеЗ 113
Исследование тепловой денатурации GFPметодом ЯМР... 114
Особенности флуоресценции хромофора GFP-сусІеЗ при денатурации белка 125
П. 2.2(6). Неравновесное плавление карбоксиангидразы 131
П. 2.2(B). Выводы 136
П. 2.3. Мутационный подход для определения последовательности сворачивания/разворачивания структурных элементов белка (ц анализ) 136
з II. 2.3(a). Влияние ss-мостиков и замены гидрофобных аминокислотных остатков с большим количеством контактов на разворачивание белка с несколькими промежуточными состояниями 137
П. 2.3(6). Определение последовательности сворачивания структурных элементов зеленого флуоресцентного белка, используя ц-анализ 141
Теоретический анализ кристаллической структуры зеленого флуоресцентного белка 141
Исследования мутантних форм GFP-сусІеЗ 144
Анализ влияния мутаций на GFP-сусІеЗ 149
П. 2.3(B). Определение последовательности сворачивания структурных элементов карбоксиангидразы, используя ц-анализ 153
Выбор мутаций в карбоксиангидразе 154
Исследование мутантних форм карбоксиангидразы 156
П. 2.4. Выводы 160
П. 3. Направленное изменение энергетического ландшафта глобулярных белков 161
П. 3.1. Влияние замен гидрофобных аминокислотных остатков белка на его переходные состояния 162
П. 3.2. Влияние различных видов мутаций на состояние белка типа расплавленной глобулы 167
П. 3.2(a). Исследование влияния замен гидрофобных аминокислотных остатков в гидрофобном ядре белка на состояние расплавленной глобулы апомиоглобина ... 168
П. 3.2(6). Исследование влияния замен гидрофобных аминокислотных остатков на поверхности белка на состояние расплавленной глобулы апомиоглобина... 171
П. 3.2(B). Исследование влияния ss-связи на состояние расплавленной глобулы апомиоглобина 175
4 П. 3.3. Влияние ss-связи на энергетический ландшафт многостадийно сворачивающегося белка 177
П. 4. Пример стабилизации одностадийно сворачивающегося белка введением цистеинового мостика 183
III. Заключение 188
Список литературы
- Промежуточные состояния белка, находящиеся «на пути» и «вне пути» сворачивания белка
- Развитие экспериментальных методов и подходов для анализа процессов самоорганизации многостадийно сворачивающихся белков
- Мутационный подход для определения последовательности сворачивания/разворачивания структурных элементов белка (ц анализ)
- Исследование влияния замен гидрофобных аминокислотных остатков в гидрофобном ядре белка на состояние расплавленной глобулы апомиоглобина
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Большинство белков представляют собой большие образования, формирование нативной структуры которых проходит в несколько этапов. Структурные и термодинамические принципы сворачивания и стабильности таких белков до сих пор остаются неизвестными. Что удерживает такие белки от денатурации? Что представляют собой переходные (активированные) состояния при формировании разных промежуточных состояний белка? Какие факторы и взаимодействия определяют количество промежуточных состояний белка при его сворачивании? Ответить на все эти вопросы можно, только накопив большое количество экспериментальных данных. Однако на сегодняшний день разработано очень мало методов и подходов, позволяющих исследовать промежуточные и переходные состояния многостадийно сворачивающихся белков. Это не удивительно, ведь в большинстве случаев, эти состояния невозможно зафиксировать и изучать равновесными методами. Единственный путь решить вышеуказанные проблемы - это развивать экспериментальные методы, позволяющие исследовать белки в процессе их сворачивания/разворачивания, применять такие методы к изучению белков разных по структуре и свойствам, что и сделано в данной работе.
Цель и задача исследования.
Основной целью данной работы является изучение принципов самоорганизации сложных многостадийно сворачивающихся белков. Разработка методов и подходов, позволяющих изучать такие белки, а также поиск способов направленного изменения свойств глобулярных белков.
Научная новизна диссертационной работы.
В работе развиты и подтверждены экспериментально несколько подходов, позволяющих исследовать многостадийно сворачивающиеся белки. Подход, позволяющий анализировать влияние быстро образующихся промежуточных состояний белка на последующие медленные фазы его сворачивания и подход, позволяющий из данных по неравновесному плавлению белка (методом сканирующей калориметрии) рассчитать константы скоростей денатурации многостадийно разворачивающегося белка. Предложен новый подход, позволяющий определить порядок формирования разных структурных элементов многостадийно сворачивающегося белка на основе исследования мутантных форм белка с заменами гидрофобных аминокислотных остатков и введения цистеиновых мостиков. Возможности этого подхода показаны на двух белках, разных по структуре. Впервые получены параметры, характеризующие гидратацию двух переходных
состояний в белке. Впервые получены данные о влиянии разных видов мутаций на энтропийные и энтальпийные составляющие энергетических барьеров, разделяющих разные состояния белка. Построены профили свободной энергии многостадийно сворачивающихся белков и экспериментально показано, как разные виды мутаций могут повлиять на стабильность, скорость формирования и населенность различных состояний белка.
Основные положения, выносимые на защиту.
Исследование процессов многостадийного формирования/разрушения структуры карбоксиангидразы, апомиоглобина и зеленого флуоресцентного белка. Расчет профилей свободных энергий этих белков. Необходимость и достаточность экспериментов, при использовании подхода, позволяющего учесть влияние быстрой стадии сворачивания белка на последующие медленные.
Исследование процессов неравновесного плавления зеленого флуоресцентного белка и карбоксиангидразы, тепловое разворачивание которых проходит многостадийно. Сравнение констант скоростей двухстадийного разворачивания белков, полученных прямыми кинетическими экспериментами и рассчитанных из кривых неравновесного плавления белков, полученных методом сканирующей калориметрии.
Новый метод анализа последовательности разворачивания структурных элементов белков (д-анализ).
Исследование взаимосвязи между типом мутации, ее положением в белке и влиянием на профиль свободной энергии многостадийно сворачивающихся белков. В частности влияние замен аминокислотных остатков на состояние белка типа расплавленной глобулы, на нативное и переходные состояния.
Практическая значимость диссертационной работы.
Разработанные в данной работе подходы применимы для исследования большинства глобулярных белков. В частности подход, позволяющий определить порядок формирования разных структурных элементов белка на основе исследования его мутантных форм, на сегодняшний день является единственным универсальным экспериментальным подходом для исследования многостадийно сворачивающихся белков. Установленные в этой работе закономерности вносят заметный вклад в понимание процессов формирования нативной структуры глобулярных белков и белковых комплексов. Большое практическое значение имеет изученное в работе влияние
нескольких видов мутаций на свободную энергию нативного, промежуточных и переходных состояний белков. Впервые показана возможность направленного изменения энергетического ландшафта белка, что в свою очередь важно для создания ферментов и белковых комплексов с заданными свойствами.
Апробация работы.
Результаты работы были представлены на отечественных и международных конференциях - на VI-th European Symposium of the Protein Society (г.Барселона, Испания, 2005), на международной конференции "Protein biosynthesis, structure and function" (г.Пущино, Россия, 2007), на III Всероссийском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), на 33-ем конгрессе Европейского биохимического общества (г. Афины, Греция, 2008), на 12-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (г.Пущино, Россия, 2008), на IV-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (г.Новосибирск, 2008), на International Bunsen Discussion Meeting on Structure of Amyloid fibrils and Mechanism of Amyloid Formation (г.Галле, Германия, 2009), на IV-ом съезде биофизиков России (г.Нижний Новгород, 2012), на 39-ом конгрессе Европейского биохимического общества (г. Санкт-Петербург, Россия, 2013), на 10-ом конгрессе Европейского биофизического общества (г.Дрезден, Германия). Работа прошла апробацию на научных семинарах в Институте белка, в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН (г.Пущино), в Институте биоорганической химии РАН (г.Москва), в Санкт-Петербургском государственном университете. По материалам диссертации опубликовано 20 статей в рецензируемых отечественных и международных научных журналах.
Структура диссертации.
Промежуточные состояния белка, находящиеся «на пути» и «вне пути» сворачивания белка
В ранних работах по исследованию сворачивания белка было показано, что при сворачивании и разворачивании кооперативность процесса является ключевой особенностью многих белков [Tanford, 1968]. Для того чтобы исследовать процесс сворачивания/разворачивания белков, обычно, на их структуру (точнее на систему белок - вода) воздействуют различными веществами/факторами. Как правило, это температура, рН, ионная сила, концентрация денатурирующих веществ в растворе (чаще всего мочевины или гуанидингидрохлорида). При этом получают кривую разворачивания/сворачивания белка - это зависимость какого-нибудь параметра связанного с нативностью белка (например, триптофановая флуоресценция, эллиптичность, вязкость раствора и т.д.) от концентрации 14 нативный белок денатурированный белок концентрация денатуранта S-образный вид кривой характерен для кривых равновесного разворачивания «two-state» белков. А- область концентрации денатуранта, в которой белок остается в нативном состоянии, Б - область разворачивания белка, В - область, в которой белок находится в развернутом сотоянии. денатурирующего агента (схематично показано на рисунке 1.1). Такие зависимости выглядят как S-образные кривые, подтверждая, что белок разворачивается/сворачивается в одну стадию и кооперативно [например, Heyda et al, 2011; Jackson & Fersht, 1991a; Patel et al., 2011; Tischer & Auton, 2013]. To есть, при маленьких концентрациях денатуранта (область А на рисунке 1.1) нативная структура белка «сопротивляется» воздействию денатурирующих агентов и белок не меняет свою конформацию. При «средних» концентрациях денатуранта происходит монотонное разворачивание структуры белка (область Б на рисунке 1.1, измеряемый параметр меняется в зависимости от концентрации денатуранта). При больших концентрациях денатуранта белок полностью развернут и его конформация снова не зависит от концентрации денатуранта (область В на рисунке 1.1). Такие кривые 16 равновесного разворачивания белков [например, Heyda et al, 2011; Jackson & Fersht, 1991a; Patel et al, 2011; Tischer & Auton, 2013] подтверждают, что в равновесных условиях маленькие однодоменные белки населяют только два состояния - нативное и развернутое (безусловно, есть исключения, см. например [Staniforth et al., 2000; Ptitsyn, 1995; Kay et al, 1999]). Действительно, достаточно сложно в равновесных экспериментах наблюдать промежуточные состояния белков [Iglesias et al., 2003; Ropson & Frieden, 1992; Samuel et al, 2000]. Также экспериментально было показано, что стабильность белка (изменение свободной энергии) линейно зависит от концентрации денатуранта [Расе & Shaw, 2000; Tanford, 1968)]. При этом наклон зависимости изменения свободной энергии от денатуранта связан с изменением экспонированности гидрофобных групп белка на растворитель при его разворачивании [Myers et al, 1995].
Равновесные исследования белков дают информацию о стабильности белка, об особенностях их нативного и денатурированного состояний, но чаще всего, не позволяют получить информацию о промежуточных состояниях белка. Однако, чтобы понять процесс формирования трехмерной структуры белка из развернутой полипептидной цепочки, необходимо подробное знание энергетического ландшафта белка, включая особенности частично свернутых промежуточных состояний, переходных состояний и их последовательности формирования в процессе сворачивания/разворачивания. Этого можно достичь только при проведении кинетических экспериментов. Для этого, чаще всего, скачком меняют либо температуру, либо состав раствора (например, добавляя мочевину, гуанидингидрохлорид или кислоту для изменения рН). Для быстрого 17 смешивания растворов используют специальные приставки (приставки «останоленного потока»), которые позволяют за время порядка нескольких миллисекунд смешать два раствора в измерительной ячейке. При этом можно исследовать процессы релаксации системы и измерить константы скоростей различных этапов процесса сворачивания/разворачивания белка, а также связанные с ними амплитуды.
Если сворачивание белка происходит в одну стадию, то населенными будут только нативное (N) и денатурированное (D) состояния. Процесс сворачивания/разворачивания такого белка можно описать следующей схемой реакции.
Такое уравнение позволяет выразить видимую константу скорости (0bs) через константы скоростей сворачивания и разворачивания в отсутствии денатуранта (к и ки0, сооответстенно) и через параметры rrif и ти. Эти параметры связаны с наклоном зависимости логарифма соответствующей константы скорости от концентрации денатуранта и, следовательно, как упоминалось выше, с изменением экспонированности гидрофобных групп белка на растворитель при его сворачивании/разворачивании. На рисунке 1.2 показано, как будет выглядеть зависимость логарифмов видимых констант скоростей от концентрации денатуранта для гипотетического белка, сворачивающегося в одну стадию. Сворачивание/разворачивание такого белка можно описать одностадийной моделью (1.1), поэтому линией показана аппроксимация экспериментальных данных (точек) уравнением (1.4). Из-за V-образной формы такие графики принято называть «шевронными графиками» [Jackson 1998]. Кинетические исследования многих белков можно описать одностадийной моделью и их шевронные графики выглядят аналогично рисунку 1.2. Так например, при разных концентрациях денатурантов, были исследованы белки FBP28, убиквитин, нуклеофосмин, SH3 домен а-спектрина, [Petrovich et al, 2006; Viguera & Serrano, 2001; Viguera et al, 2002; Went & Jackson, 2005]. Для этих белков были построены шевронные графики и получены данные о параметрах m и изменении свободной энергии при их разворачивании.
Развитие экспериментальных методов и подходов для анализа процессов самоорганизации многостадийно сворачивающихся белков
Одиночные замены аминокислотных остатков. Наиболее распространенным методом определения функциональной значимости отдельных аминокислотных остатков в белках является их целенаправленная замена на нейтральный аминокислотный остаток, например, аланин. Введение аланина в полипептидные цепи не изменяет их общей конформации, как например, в случае замены на глицин или пролин, и не сопровождается ярко выраженными электростатическими или стерическими эффектами. Кроме того, аланин с одинаковой частотой представлен как на внутренних, так и на внешних участках полипептидных цепей белковых глобул. Так, например, в работе [Mallam et al., 2008] авторы заменили на аланин аминокислоты, боковые группы которых образуют максимальное количество контактов с боковыми группами других аминокислот в свернутой молекуле белка YibK. В работе [Northey et al., 2002] авторы исследовали свыше 40 мутантных форм белка с заменами в 9-ти аминокислотных позициях, входящих в гидрофобное ядро SH3 домена тирозинкиназы. При этом замены производили не только на аланин, но и на Gly, Val, Не, Leu и Phe. Оказалось, что термодинамическая стабильность белка не однозначно связана со скоростями сворачивания и разворачивания. Так, например, две мутантные формы домена SH3 с одинаковой термодинамической стабильностью и структурной топологией отличались по скоростям сворачивания в 35 раз. Также было показано, что -значения для некоторых аминокислотных остатков оказались аномальными, то есть были более 1 или менее 0, что, скорее всего, является следствием различных путей сворачивания мутантов и исходного SH3 домена [Northey et al., 2002].
Мутации дисульфидных связей. Удаление либо введение новых дисульфидных связей в белке часто используется при исследовании процесса сворачивания/разворачивания различных белков. Дисульфидная связь может 48 стабилизировать белок не только благодаря энтропийному эффекту, но и конфигурационному энтальпийному эффекту [Betz, 1993]. При этом исследователи используют два типа замен: замену цистеина (одного или обоих в паре), например, на метионин для разрушения дисульфидной связи [Cooper et al., 1992] или замену двух аминокислотных остатков на цистеины - для создания дисульфидной связи [Matsumura et al., 1989а; Matsumura et al, 1989b]. Так в работе [Kuroki et al, 1992] было показано, что замена в лизоциме человека 77-го и 95-го цистеинов на аланины приводит к тому, что белок без дисульфидной связи примерно на 2 ккал/моль менее стабилен, чем белок, у которого присутствует эта связь. Кроме изучения дестабилизирующего эффекта при удалении дисульфидной связи в белках изучается влияние новых дисульфидных связей. Например, в работе [Kanaya et al, 1991] авторы ввели новую дисульфидную связь в рибонуклеазу Н. При выборе аминокислот для замены на цистеин, они руководствовались тем, что в этом белке уже имеется три цистеина, поэтому подбирали им пару. В работе [Grantcharova et al., 2000] авторы вводили дисульфидные связи в белок src_SH3, руководствуясь стереохимическими требованиями к аминокислотам, формирующим дисульфидную связь. А именно, растояниями: Са-Са (4.4-6.8 А), Ср-Ср (3.5-4.5 А) и двугранным углом (близким к 90). Попытки стабилизировать белок с помощью дисульфидных связей приводят к разным результатам. Так для наиболее исследованного лизоцима фага Т4, который исходно не имеет дисульфидной связи, было введено пять различных дисульфидных связей. Для двух мутантных форм белка было показано, что введенный дисульфидный мостик дестабилизирует белок [Wetzel et al., 1988], в то время как в трех других мутантных формах введенные дисульфидные мостики немного стабилизировали белок [Matsumura et al, 1989а; Matsumura et al., 1989b].
Кроме влияния на стабильность, введение ss-связей влияет на скорости сворачивания/разворачивания белка. Так, например, многочисленные исследования барназы, проведенные в группе Фершта, показали, что введение 49 ss-связей в структурных элементах этого белка, которые формируются до переходного состояния (до основного скорость лимитирующего барьера) могут уменьшить скорость сворачивания, тем самым увеличив «кинетическую стабильность» белка [Clarke & Fersht, 1993]. Этот эффект также был исследован при теоретическом моделировании сворачивания белка в работах Абкевича и Шахновича [Abkevich & Shakhnovich, 2000]. Похожий результат был получен при исследовании термолизина, на котором также было показано, что ss-связь стабилизирует белок, если она введена на участке, который разворачивается первым [Mansfeld et al, 1999]. В работе Рамакришнана [Ramakrishnan et al., 2012] проведено моделирование разворачивания нескольких белков, включая лизоцим, барназу и дигидрофолатредуктазу. Было показано, что ss-связи, введенные на участках полипептидной цепи белка, которые разворачиваются первыми, - стабилизируют белок, а ss-связи, введенные на участках белка, которые разворачиваются последними - дестабилизируют белок. В работе [Sanchez-Romero et al., 2013] был применен метод молекулярной динамики, чтобы найти положение ss-связи в белке, которая повлияет на его термостабильность и «кинетическую стабильность», то есть, на способность к быстрому сворачиванию и отсутствию при этом агрегатов. Этим теоретическим подходом авторы нашли шесть вариантов введения ss-связи в белок фитазу (phytase) и исследовали их неравновесное плавление [Sanchez-Romero et al, 2013]. Авторы делают вывод, что исследованные ss-связи влияют на скорость температурного разворачивания белка, поскольку понижают населенность частично развернутых промежуточных состояний, тем самым увеличивая «кинетическую стабильность» белка.
Мутационный подход для определения последовательности сворачивания/разворачивания структурных элементов белка (ц анализ)
Зависимость степени потери нативной структуры GFP-сусІеЗ от времени инкубации его в соответствующих денатурирующих условиях хорошо продемонстрирована в работах Хуанг с соавторами [Huang et al, 2007; 2008]. Они разворачивали белок в присутствии различных концентраций GdnCl в различных условиях: рН=7.4 при 37 С, рН=6.4 при 37 С, рН=6 при 25 С, в широком временном диапазоне инкубации растворов - от 14 часов до 8 недель. Самые низкие значения середины денатурационного перехода наблюдались в случае инкубации растворов белка в исследуемых условиях в течение 8 недель при рН=6.4 37С (точка полуперехода равна 1.25 М GdnCl). Если рассмотреть усредненные значения для всех равновесных переходов, полученных в работе, то выше З М GdnCl наступает полная денатурация белка, а при концентрации меньше 0.5 М GdnCl белок нативен (в диапазоне рН от 6.4 до 7.4). Причем полное разворачивание белка происходит в 6 М GdnCl в течение 3 часов. Эти значения очень сильно отличаются от тех условий, при которых разворачивается стабилизированный вариант GFP (sfGFP) [Andrews et al, 2007], созданный с целью увеличить скорость сворачивания GFP и минимизировать его агрегацию. Мутантная форма GFP с двенадцатью аминокислотными заменами (sfGFP) теряет свою нативную конформацию в 7.6 М GdnCl при 96-ти часовой инкубации по данным КД, флуоресценции хромофора и триптофановых остатков. Эти данные ещё раз доказывают имеющуюся на сегодняшний день противоречивость в оценке стабильности зеленого флуоресцентного белка.
По количеству стадий сворачивания/разворачивания GFP в литературе также нет единого мнения. В различных работах их число варьирует от 3 до 6 (Enoki et al., 2006), в случае sfGFP разворачивание проходит в 3 стадии, а сворачивание - в 2 стадии по данным флуоресценции хромофора [Andrews et al., 2007]. Причем равновесный переход по сворачиванию не совпадает с переходом, построенным по разворачиванию белка, присутствует зона 60 гистерезиса, которая может быть следствием того, что в экспериментах по сворачиванию/разворачиванию не было достигнуто равновесие.
При исследовании процесса сворачивания авторы в работе [Steiner et al., 2008] выделяют быструю и медленную фазы, последняя, по всей видимости, связана с медленной цис/транс изомеризацией Рго89. Константы скоростей сворачивания средней и медленной фаз близки к константам цис/транс изомеризации пептидил-пролиновых связей. Подтверждением вклада изомеризации пролинов в средней и медленной фазах сворачивания было изменение кинетик в присутствии циклофилина, который обладает способностью увеличивать скорость пролиновой изомеризации [Enoki et al., 2004]. Цис/транс изомеризация является главной причиной безизлучательной дезактивации возбужденного состояния хромофора [Niwa et al, 1996].
На основании совокупности имеющихся данных о процессах сворачивания/разворачивания GFP [Andrews et al, 2008] предполагается следующая последовательность образования его нативной структуры. На первом этапе формируется общая структура белка за времена порядка часов-дней, что сопоставимо со временами сворачивания других глобулярных белков. На втором этапе происходит медленное формирование хромофора и изомеризация пролинов. Этот процесс может продолжаться в течение двух месяцев, что вносит определенные трудности при использовании GFP в прикладных задачах. Сейчас появляется все больше работ, направленных на улучшение характеристик сворачивания GFP [Heim et al, 1994; Cubitt et al., 1995; Pedelacq et al., 2006]. Задачей экспериментов такого плана является получение стабильных вариантов GFP путем введения многочисленных аминокислотных замен. Так в работе [Pedelacq et al., 2006] показано, что введение каждой из мутаций Ser30Arg, Tyr39Asn, Asnl05Thr, Tyrl45Phe, Ilel71Val, Ala206Val приводит к увеличению скорости сворачивания мутантной формы белка. Ренатурация белка с такими заменами происходит в 3,5 раза быстрее, чем у белка дикого типа. Степень воздействия этих аминокислотных 61 замен на GFP дикого типа различна: одни в большей степени отвечают за устойчивость к мочевине, а другие - за скорость сворачивания. Замены Ser30Arg и Tyr39Asn приводят как к ускорению кинетики процесса сворачивания белка, так и увеличивают устойчивость к мочевине при денатурации белка.
Мнения большинства авторов сходятся в том, что в структуре GFP можно выделить области, подверженные денатурации в первую очередь. Таким образом, можно предположить возможную структуру промежуточных состояний. Показано, что в кристаллической структуре GFP число водородных связей между 7 и 8 Р-стрэндами меньше по сравнению с остальными Р-стрэндами [Enoki et al., 2004]. Сейферт с соавторами [Seifert et al, 2003] выяснили, что одна сторона белка, образованная 7-10 Р-стрэндами, имеет повышенную скорость F1/D обмена. В работе Хелмса [Helms et al, 1999] показано, что Р-баррель GFP теряет нативную структуру в районе между 7 и 8 Р-стрэндами при действии денатурирующих агентов. Предполагают, что именно эта часть (7-10 Р-стрэнды) белка разрушается при переходе в промежуточное состояние, что влечет за собой доступность хромофора для молекул воды, тогда как другая часть (3 и 11 Р-стрэнды) молекулы более стабильна.
Доказательства формирования структуры GFP из двух частей представлены в работе [Kent et al., 2008]. Авторы статьи получили GFP из двух кусочков (частей): большой кусок 1-10 Р-стрэнды (обозначается как GFP 1-10) синтезирован рекомбинантно, в то время как, маленький кусок GFP 11 (одиннадцатый Р-стрэнд нативной структуры GFP) - синтетический пептид с первичной последовательностью, идентичной последнему Р-стрэнду в структуре GFP. Они показали, что вновь собранный белок имеет свойства не отличимые от свойств нативного белка. Спектры КД, а также спектры поглощения и флуоресценции, нативного и собранного GFP идентичны. КД спектр GFP 1-10 имеет меньшее значение молярной эллиптичности, чем спектр 62 восстановленного (собранного из двух частей белка) на длинах волн меньших 200 нм, это говорит о том, что в структуре GFP 1-10 больше беспорядочных витков. Недостаток структуры в GFP 1-10 и наблюдаемое формирование хромофора только после добавления одиннадцатого Р-стрэнда GFP (GFP 11) говорит о том, что GFP 11 вызывает прециклизационную структурную напряженность, необходимую для формирования хромофора. Иначе говоря, авторы подчеркивают возможность формирования структуры GFP из двух кусочков.
Таким образом, анализ литературных данных позволяет сделать вывод об этапах сворачивания GFP. Первой формируется общая структура белка, состоящая из 11 Р-стрэндов, причем, число стадий вовлеченных в этот процесс сильно отличается в различных работах. Финальный шаг включает медленные перестройки конформаций аминокислотных остатков, ответственных за созревание хромофора и за правильную изомеризацию пролинов.
Исследование влияния замен гидрофобных аминокислотных остатков в гидрофобном ядре белка на состояние расплавленной глобулы апомиоглобина
Поскольку процесс разворачивания этого белка достаточно медленный, то в геле можно наблюдать две сильно отличающиеся по подвижности фракции, относящиеся к нативному (в нижней части геля) и денатурированному состоянию GFP (в верхней части геля). Видно, что по мере увеличения концентрации мочевины количество нативного белка уменьшается (уменьшается интенсивность окрашивания соответствующих пятен), при этом увеличивается количество денатурированного белка (увеличивается интенсивность окрашивания пятен в верхней части геля). Следует обратить внимание на то, что окраска денатурированного белка более интенсивна в непосредственной близости от слота (верхний край геля), куда наносился препарат белка. Это говорит о том, что при денатурации белка в растворе присутствует большое количество агрегатов, которые плохо входят в гель. При этом по мере увеличения концентрации мочевины, все большее количество белка все-таки входит в гель (пятна удлиняются). В случаях, когда разворачивание белка не осложняется агрегацией пятна, соответствующие развернутому белку, либо располагаются на одном уровне, либо по мере увеличения концентрации денатуранта располагаются ближе к верхней части геля. То есть, расположение пятен практически противоположно тому, которое мы наблюдаем для GFP. Таким образом, из этого эксперимента можно сделать совершенно такие же выводы, как и из предыдущего эксперимента по плавлению GFP в ЯМР-спектрометре. При разворачивании GFP, в растворе присутствует большое количество агрегатов, и только большие концентрации денатуранта или высокие температуры частично разрушают агрегированные частицы и в растворе появляются развернутые мономеры GFP.
С чем связано такое быстрое появление агрегатов при разворачивании GFP? Поскольку в некоторых работах было показано, что олигомерное состояния белка GFP зависит от его концентрации и ионной силы раствора [Зубова и др., 2003; Prendergast & Mann, 1978], то можно предположить, что при высоких концентрациях белка, в которых проводились ЯМР эксперименты (4-6 мг/мл) присутствуют ассоциированные молекулы GFP, то есть, долго живущие водно-белковые частицы. В таком случае, дестабилизация при нагреве может приводить к сильной агрегации белка.
Чтобы проверить присутствуют ли в растворе водно-белковые частицы мы провели так называемые offPJ эксперименты [Prokhorov et al, 2008]. На рисунке 11.18 представлены зависимости нормализованных интегральных интенсивностей ЯМР спектров, измеренных для ароматических протонов (8-6 ррш), для алифатических протонов (3.5 - 1.5 ррт), а так же для протонов воды (-4.76 ррт) от частоты возбуждения спиновой диффузии. Такие зависимости позволяют определить - присутствуют ли в образце водно-белковые ассоциаты, которые проявляются в спектрах как широкий фоновый спектр, «на котором», присутствует обычный спектр белка. Если водно-белковые ассоциаты отсутствуют, то интенсивность спектра белка будет очень быстро уменьшаться, если частота дополнительного насыщающего поля удаляется от области спектра белка. Если же ассоциаты присутствуют в образце, то даже на частоте 10000 Гц, которая далека от области спектра белка, происходит возбуждение спиновой диффузии и это проявляется в спектрах ЯМР.
На рисунке 11.18 видно, что нормализованные интегральные интенсивности сигналов ароматической и алифатической области ЯМР спектров растворов GFP в нативных условиях (рН 7 и Т = 298К) близки к нулю при различных частотах возбуждения. То есть, не наблюдается «откликов» в белковом спектре при возбуждении протонов воды. Это говорит об отсутствии долго живущих водно-белковых ассоциатов. Для того чтобы понять как в таких экспериментах могут проявлять себя водно-белковые ассоциаты, на рисунке 11.18 для примера показаны аналогичные кривые, измеренные для белка карбоксиангидразы. Этот белок хорошо изучен. Это, в основном, бета-структурный белок с молекулярным весом 29 кДа. По многим параметрам белок карбоксиангидраза похож на GFP. Поэтому, мы воспользовались этим белком как, своего рода, маркером. При рН 7 карбоксиангидраза находится в нативных условиях и не образует ассоциатов [Prokhorov et al., 2008], поэтому кривые, полученые в экспериментах offRI, измеренные для карбоксиангидразы в нативных условиях (см. рисунок 11.18) близки к нулю. При рН 4 карбоксиангидраза переходит в состояние расплавленной глобулы и образует водно-белковые ассоциаты [Kutyshenko & Cortijo, 2000], поэтому кривые для карбоксиангидразы при рН 4 выше нулевой линии во всем диапазоне частот насыщающего поля. Сравнивая на рисунке 11.18 кривые, полученные для GFP в нативных условиях, с кривыми, полученными для карбоксиангидразы, можно сделать вывод, что по данным ЯМР в нативных условиях в растворе водно-белковые ассоциаты GFP отсутствуют. Следовательно, причины аномально быстрой агрегации GFP скрыты в каких-то структурных особенностях этого белка.
Зависимости нормализованных интегральных интенсивностей ЯМР спектров, измеренных в области «ароматических протонов» (7.2 - 5.5 ррт) (квадраты), в области «алифатических протонов» (3.5 - 1.5 ррт) (кружочки), а также для протонов воды в области 4.76 ррт (треугольники) от частоты возбуждения спиновой диффузии. Для GFP зависимости показаны темными символами, для карбоксиангидразы - светлыми. Эти зависимости практически совпадают (обозначены на рисунке GFP рН7, ВСАВ рН7).
Как уже отмечалось выше, GFP - это глобулярный белок и по многим параметрам не отличается от других глобулярных белков, за исключением одной особенности. В его структуре (внутри Р-бочонка) присутствует достаточно большое количество воды. При этом понятно, что количество молекул воды внутри GFP в условиях раствора, может быть существенно больше, чем в кристалле. Мы предположили, что взаимодействие молекул воды внутри GFP с его полипептидной цепью может быть причиной нестандартного поведения при денатурации. Для того, чтобы подтвердить наши предположения необходимо каким-то образом «увидеть», что взаимодействие с молекулами воды у GFP гораздо сильнее, чем у других белков. Для этого мы провели следующие эксперименты.
На рисунке 11.19 представлены нормированные зависимости интегральных интенсивностей ЯМР спектров от времени развития спиновой диффузии. Такие зависимости измерены для протонов воды (4.76 ррт) при возбуждении на частоте протонов воды (W{W}, кружочки на рисунке П. 19), для сигналов в алифатической области (3.5 - -1.5 ррт) при возбуждении на частоте протонов воды (al{W} квадратики на рисунке П. 19), а также для сигналов алифатической области (3.5-1.5ррт) при возбуждении на частоте протонов метальных групп (-0.9 ppm) (al{Met} треугольники на рисунке 11.19). Такие измерения проведены для GFP в нативных условиях и для карбоксиангидразы при рН 4 и при рН 7. Параметры всех кривых, приведенных на рисунке 11.19 представлены в таблице П.З. При такой постановке эксперимента медленно затухающие сигналы (W{W} на рисунке 11.19) мы получаем от протонов воды. Кривые, полученные для этих сигналов, являются в наших экспериментах верхней границей, поскольку они отражают самый медленный процесс релаксации в каждом из образцов. Самые быстро затухающие сигналы (al{Met} на рисунке 11.19) - это сигналы, измеряемые в области алифатических групп при возбуждении протонов метальных групп. Такие сигналы можно считать нижней границей, поскольку они отражают самый быстрый процесс релаксации в каждом из образцов. Соответственно, измеряя сигналы в алифатической области спектра ЯМР, но возбуждая при этом образец на частоте протонов воды, (al{W} на рисунке 11.19) мы получили кривые, отражающие взаимодействие воды и полипептидной цепи белка. Близость такой кривой к самой медленной (W{W}) или самой быстрой (al{Met}) кривой говорит о том, насколько белок в данном образце подвержен взаимодействиям со стороны