Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Методы синтеза, структура и физико-химические свойства нанодисперсного диоксида церия
1.2. Токсичность нанодисперсного диоксида церия
1.2.1. Факторы влияющие на токсичность нанодисперсного диоксида церия 17-20
1.2.2. Накопление в организме и клиренс нанодисперсного диоксида церия 20-22
1.3. Биологическая активность нанодисперсного диоксида церия 22
1.3.1. Энзимоподобная активность нанодисперсного диоксида церия 22-27
1.3.2. Влияние нанодисперсного диоксида церия на репродуктивную систему 27-28 млекопитающих.
1.3.3. Влияние нанодисперсного диоксида церия на пролиферативную 28-29 активность клеток.
1.3.4. Антиоксидантные, УФ- и радиопротекторные свойства нанодисперного 29-35 диоксида церия.
1.4. Адресная внутриклеточная доставки нанодисперсного диоксида 35-36
церия
1.4.1. Наночастицы церия как активное средство внутриклеточной доставки 36-38 лекарств.
1.4.2. Полиэлектролитные микрокапсулы как системы доставки 38 бионаноматериалов.
Заключение по обзору литературы
ГЛАВА 2. Материалы и методы 39
2.1. Химические реактивы, среды и материалы 39
2.2. Схема синтеза и анализ физико-химических характеристик нанодисперсного диоксида церия
2.2.1. Пробоподготовка нанодисперсного диоксида церия 39
2.2.2. Анализ гидродинамического радиуса и дзета-потенциала нанодисперсного диоксида церия
2.2.3. Просвечивающая электронная микроскопия нанодисперсного диоксида церия
2.2.4. УФ видимая спектроскопия нанодисперсного диоксида церия
2.3. Анализ уровня пероксида водорода и гидроксильного радикала 40-41
2.4. Модели окислительного стресса in vitro и in vivo 41-42
2.4.1. Окислительный стресс, индуцированный экзогенным пероксидом водорода
2.4.2.Окислительный стресс, индуцированный воздействием низкотемпературной аргоновой плазмы (НТАП).
2.4.3. Окислительный стресс, индуцированный воздействием ультрафиолетового излучения.
2.4.4. Окислительный стресс, индуцированный воздействием рентгеновского излучения.
2.5. Культуры клеток 42-44
2.6. Анализ жизнеспособности клеточных культур
2.6.1. Приготовление суспензии клеток и подсчет клеток. 44
2.6.2. ЛДГ-тест 44
2.6.3. Метод дифференцированного флуоресцентного окрашивания клеток 44-45
2.6.4. Анализ уровней АФК in vitro. 45
2.6.5. Конфокальная микроскопия клеточных культур 45
2.6.6. Просвечивающая электронная микроскопия клеточных культур 45
2.6.7. Сканирующая электронная микроскопия клеточных культур 46
2.6.8. Проточная цитометрия 46
2.6.9. МТТ-тест 46-
2.6.10. Культивирование клеток в трехмерном матриксе коллагенового геля. 47
2.6.11. Анализ пролиферативной активнсоти клеточной культуры
2.7. Выделение и культивирование ооцитов 47
2.8. Животные 2.9. Микроядерный тест 49
2.10. ПЦР в реальном времени 49
2.10.1.Экстракция тотальной РНК тризоловым методом 49
2.10.2.Электрофорез РНК
2.10.3. Обратная транскрипция 50
2.10.4. ПЦР-амплификация в режиме реального времени 50
2.10.5.Определение уровня экспрессии генов 50
2.10.6. Гены
2.11. Анализ распределения нанодиспесного диоксида церия в организме модельных животных
2.12. Полиэлектролитные микрокапсулы 52-
2.12.1. Синтез полиэлектролитных микрокапсул 52
2.12.2. Просвечивающая электронная микроскопия полиэлектролитных микрокапсул
2.12.3. Сканирующая электронная микроскопия полиэлектролитных микрокапсул
2.12.4. Конфокальная микроскопия полиэлектролитных микрокапсул
2.12.5. Элементный анализ полиэлектролитных микрокапсул 52
2.13. Статистический анализ данных 53
ГЛАВА 3. Результаты 54
3.1. Исследование физико-химических характеристик и агрегативной 54-58
устойчивости цитрат-стабилизированных наночастиц диоксида церия в
различных биологических средах.
3.2. Исследование воздействия нанодисперстного диоксида церия на культуры субстратзависимых клеток млекопитающих.
3.3. Исследование влияния цитрат-стабилизированных наночастиц диоксида церия на активность митохондриальных дегидрогеназ.
3.4. Исследование влияния наночастиц СеО2 на жизнеспособность и 63-69
пролиферативную активность первичных эмбриональных фибробластов in vitro
3.5. Исследование эмбриотоксического действия наночастиц СеО2 и их влияния на эмбриогенез in vitro.
3.6. Исследование влияния нанодисперстного диоксида церия на морфологию клеток
3.7. Исследование влияния цитрат-стабилизированных наночастиц диоксида церия на морфологию и функциональную активность фибробластов человека, культивируемых в трехмерном матриксе коллагенового геля.
3.8. Исследование внутриклеточной локализации цитрат-стабилизированных наночастиц диоксида церия и их влияния на ультраструктуру клеток млекопитающих.
3. 3.9. Протекторное действие цитрат-стабилизированных наночастиц СеО2, вразличных моделях окислительного стресса .
3.9.1. Протекторное действие цитрат-стабилизированных наночастиц СеО2, вмодели окислительного стресса, индуцированного экзогенным пероксидом водорода.
3.9.2. Протекторное действие цитрат-стабилизированных наночастиц СеО2 , 81 вмодели окислительного стресса, индуцированного воздействие УФ излучения.
3.9.3. Протекторное действие цитрат-стабилизированных наночастиц СеО2, 82-84 вмодели окислительного стресса, индуцированного воздействием низкотемпературной аргоновой плазмы.
3.9.4. Протекторное действие цитрат-стабилизированных наночастиц СеО2, вмодели окислительного стресса, индуцированного воздействием рентгеновского излучения.
3.10. Разработка системы внутриклеточной доставки цитрат- 97
стабилизированных наночастиц СеО2 на основе полиэлектролитных
микрокапсул.
3.10.1. Оценка физико-химических свойств и морфологии синтезированных 96-99 микрокапсул
3.10.2. Исследование процесса поглощения и внутриклеточной локализации 99-101 синтезированных микрокапсул.
3.10.3. Исследование защитного действия модифицированных микрокапсул в 102-105 модели окислительного стресса, индуцированного экзогенным пероксидом водорода.
3.11. Анализ перспектив использования полиэлектролитных микрокапсул 105-115
модифицированных наночастицами диоксида церия в биомедицинских
целях.
Заключение
116-1 Выводы
Список основных публикаций по теме диссертации
Список использованных литературных источников
- Энзимоподобная активность нанодисперсного диоксида церия
- Анализ гидродинамического радиуса и дзета-потенциала нанодисперсного диоксида церия
- Сканирующая электронная микроскопия клеточных культур
- Протекторное действие цитрат-стабилизированных наночастиц СеО2, вразличных моделях окислительного стресса
Введение к работе
Актуальность темы:
Современный уровень развития нанотехнологий позволяет получать новые полифункциональные материалы, обладающие уникальными физико-химическими свойствами, которые находят свое широкое применение в биомедицинских приложениях. Одним из наиболее перспективных материалов для биомедицинских целей является нанокристаллический диоксид церия (СеО2) (Patil S. et al, 2007, Colon J. et al, 2011, Rubio L. et al, 2015, Liying H. et al, 2015). Наличие дефектов кристаллической решетки («кислородных вакансий»), двух стабильных степеней окисления (Ce3+ и Ce4+) и низкая энергия их образования, обуславливают уникальную редокс- активность данного соединения, в том числе его антиоксидантное действие в системах in vitro и in vivo (Shcherbakov A. et al, 2015, Walkey C. et al, 2015, Vinardell М. et al, 2015). В отличие от классических природных антиоксидантов (мелатонин, цистеин, аскорбиновая кислота), наночастицы СеО2 способны восстанавливать свою антиоксидантную активность, что позволяет им многократно участвовать во внутриклеточных редокс-реакциях, инактивируя широкий спектр свободных радикалов и активных форм кислорода (АФК) (Dowding D. et al, 2012, Xue Y. et al, 2011).
Ранее показано, что наночастицы СеО2 обладают защитным действием в некоторых моделях окислительного стресса (Zholobak N. et al, 2011) и при воздействии ксенобиотиков (Zhang Q. et al, 2014). Большинство исследователей рассматривают его способность инактивировать АФК и свободные радикалы как основной механизм защитного действия в условиях окислительного стресса (Baker C., 2013, von Montfort C. et al, 2015). Однако совсем недавно было показано, что наночастицы СеО2 также способны модулировать экспрессию ряда генов (Rim T. et al, 2012, , Cai X. et al, 2013) и влиять на внутриклеточные сигнальные пути (Niu J. et al, 2011, Selvaraj V. et al, 2015, Nelson B. et al, 2016). В связи с этим исследование механизмов защитного действия нового типа цитрат-стабилизированных наночастиц СеО2, в условиях окислительного стресса, индуцированного различными физико-химическими факторами, является актуальной задачей.
Ультрамалые размеры и высокая реакционная активность поверхности наночастиц ограничивают возможность их эффективной и высокоточной доставки в целевые ткани и органы (Wilczewska А. et al, 2012). В частности, физико-химические свойства поверхности наночастиц СеО2 обуславливают адсорбцию различных белков (Patil S. et al, 2007), пептидов (Shruti R. et al, 2013), ионов (Horie M. et al, 2011), функциональных групп биомолекул (Singh S. et al, 2011), оказывая влияние на время их циркуляции в кровотоке, органную локализацию и биологический эффект (Portioli C. et al, 2015). Взаимодействие наночастиц с белками крови может приводить к образованию так называемой «белковой короны» на ее поверхности (Horie M. et al, 2009), что определяет тип (Cedervall T. et al, 2007) и время эндоцитоза (Patil S. et al, 2007), а также их финальную внутриклеточную локализацию (Vertegel A. et al, 2007, Maiorano G. et al, 2010). В связи с этим разработка эффективных систем адресной доставки наночастиц СеО2, способных обеспечить процессы их дозирования и контролируемого выхода, а также заданную биологическую активность, является актуальной задачей современной биомедицины.
Вместе с тем существует ряд работ, демонстрирующих токсические эффекты наночастиц СеО2 в моделях in vitro и in vivo (Frieke К. et al, 2015, Pulido-Reyes G. et al 2015), которые связывают с их способностью генерировать АФК за счет их редокс-активной поверхности (Park et al. 2008, Kumari et al. 2014). Вследствие этого основным в определении перспектив применения НДЦ в биомедицинских технологиях является вопрос биобезопасности, в том числе вопрос вопроса клиренса (Yang S. et al, 2013, Li R. et al, 2015, Rui Q. et al, 2013). Форма, размер, кристалличность, заряд поверхности являются ключевыми физико-химическими
характеристиками наночастиц, обуславливающими их биологическую активность (Shin S. et al, 2015, Ould-Moussa et al. 2014, Kim Y. et al, 2014). Данные параметры зависят от схемы и условий синтеза, природы использованных прекурсоров и сурфактантов (Asati A. 2010, Dahle J., 2015). В связи с этим каждая новая схема синтеза наночастиц СеО2 требует проведения комплексной оценки их агрегативной стабильности в различных средах, цитотоксичности и биологической активности в системах in vitro и in vivo.
Цель работы
Исследование физико-химических характеристик и биологической активности цитрат-стабилизированных наночастиц СеО2 в моделях in vitro и in vivo, а также разработка систем их внутриклеточной доставки.
Задачи исследования:
-
Исследовать влияние цитрат-стабилизированных наночастиц СеО2 на жизнеспособность и пролиферативную активность клеток млекопитающих различного типа.
-
Исследовать биологическую активность цитрат-стабилизированных наночастиц СеО2 в моделях окислительного стресса, индуцированного различными химическими и физическими факторами in vitro и in vivo.
-
Разработать систему внутриклеточной доставки наночастиц СеО2 на основе полиэлектролитных микрокапсул.
Научная новизна.
Показано, что цитрат-стабилизированные наночастицы СеО2 не обладают эмбрио- и цитотоксическим действием в широком диапазоне концентраций (10-4-10-9 М) и способны стимулировать пролиферацию первичных эмбриональных фибробластов мыши и мезенхимальных стволовых клеток человека.
Выявлено, что цитрат-стабилизированные наночастицы СеО2 способны эффективно защищать клетки млекопитающих от окислительного стресса, индуцированного различными физико-химическими факторами, включающими ионизирующее излучение и экзогенные оксиданты. Выдвинута гипотеза о комплексном механизме радиозащитного действия наночастиц СеО2.
Показана возможность инкапсуляции цитрат-стабилизированных наночастиц СеО2 в полиэлектролитный матрикс из синтетических (полиаллиламин гидрохлорид 56 кДа и полистиролсульфонат натрия 70 кДа) и биодеградируемых полимеров (поли-L- аргинин 15-70 кДа и декстран сульфат 40 кДа). Показано, что синтезированные микрокапсулы являются биосовместимыми, проникают в клетку и защищают ее от окислительного стресса, индуцированного экзогенным пероксидом водорода, при этом время деградации микрокапсулы зависит от природы инкапсулирующего полимера.
Практическая ценность
Разработанные подходы к культивированию МСК мыши и человека с использованием наночастиц СеО2, регламент их пробоподготовки и схемы внесения в культуру клеток могут быть использованы для создания протоколов клеточных технологий.
Полученные данные биологической активности цитрат-стабилизированных наночастиц СеО2 могут быть использованы при разработке нового класса антиоксидантных препаратов для биомедицинских целей.
Предложенная схема интеграции наночастиц в структуру полиэлектролитных микрокапсул закладывает основы для создания новой системы внутриклеточной доставки терапевтически активных наноматериалов с возможностью сохранения их заданных свойств и контроля конечной концентрации в заданном органе/клетке.
Работа выполнялась в соответствии с планами проектов РФФИ № 14-04-32199 мол_а, 14-44-03615 р_центр_а, проекта УМНИК-2011, а также «Стипендии Президента РФ для обучения за рубежом-2014» в рамках зарубежной стажировки под руководством профессора Сухорукова Г.Б. по теме «Разработка дистанционно управляемых микро-и наноразмерных систем для адресной доставки терапевтических нанобиоматериалов в клетку» в Лондонском университете Королевы Марии.
Личный вклад автора.
Основная экспериментальная часть выполнена лично автором (работа с клеточными культурами, анализ биологической активности наночастиц СеО2 после воздействия различных стресс-факторов, синтез и исследование микрокапсул) в период с 2010 по 2016 гг., а также совместно с сотрудниками лаборатории роста клеток и тканей ИТЭБ РАН. В работе использованы материалы, полученные как автором лично, так и в результате сотрудничества: в части синтеза образцов нанокристаллического диоксида церия с лабораторией синтеза функциональных материалов и переработки минерального сырья ИОНХ РАН (чл.-корр. РАН, проф., д.х.н., Иванов В.К.), в части разработки систем внутриклеточной доставки наноматериалов с лабораторией нано-и биоматериалов Школы инженерии и материаловедения Лондонского университета Королевы Марии (профессор Сухоруков Г.Б.).
Публикации и апробация работы.
По теме диссертации опубликовано 28 работ, включая 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК. Отдельные части работы были представлены на российских и международных конференциях в виде устных и стендовых докладов, в том числе на Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука 21 века» -2011, 2012, 2013, 2014, 2015 (Пущино, Россия), Международной конференции молодых ученых Экспериментальная и теоретическая биофизика – 2011, 2012, 2013, 2014, 2015 (Пущино, Россия), Конкурсе молодых ученых ИТЭБ РАН-2011, 2012, 2013, 2014, 2015 (Пущино, Россия), Международной научной конференции «Полифункциональные химические материалы и технологии» (Томск, 2013), Первой региональной конференции инновационных проектов Московской области «УМНИК»-2011 (Москва), The European Human Genetics Conference 2015, (Glasgow, UК), Конференции молодых ученых «Перспективные направления онкологии и радиологии-2015» (г. Обнинск, Россия), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов- 2015 (Москва, Россия), научной конференции ToxRad-2015 (Санкт-Петербург), Конгрессе молодых ученых-биологов «СИМБИОЗ» 2013, 2015 (Воронеж, Новосибирск), IX Международной конференции «Биоантиоксидант-2015» (Москва), IV и V Съезд биофизиков России-2014, 2015 (Нижний Новгород, Ростов-на-Дону), в рамках Международных школ DoReMi InterRAD Сourse, «Modelling radiation effects from initial physical events -2014» (Pavia, Italy), DoReMi InterRAD course, «Integrating Low Dose Research-2013» (Munich, Germany), DoReMi InterRAD course «The Molecular Mechanisms of Radiation Carcinogenesis-2015» (Munich, Germany), Международной конференции «Актуальные вопросы биологической физики и химии-2016» (Севастополь), Международной конференции «Nanomaterials and Living Systems» NLS-2016 (Москва).
Структура и объем диссертации:
Энзимоподобная активность нанодисперсного диоксида церия
Кислородная нестехиометрия поверхностных слоев нанодисперсного диоксида церия существенно зависит от природы молекул и числа адсорбированных ионов или групп [Kuchma M. et al, 2010]. Дополнительно, добиться увеличения кислородной стехиометрии можно путем допирования наночастиц другими редкоземельными элементами [Bishop S. et al, 2009].
Рисунок 2 3D модель кристаллической решетки нанодисперсного диоксида церия. Graham G. et al 1991 и Weber W. et al, 1993 методом спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) показали, что уменьшением размера нанодисперсного диоксида церия происходят систематические изменения в спектрах КР, в частности в трижды вырожденной моде 464 см -1 (изменение положения и ширины пика). Как показал McBride J. et al, 1994, эти сдвиги, прежде всего, зависят от концентрации кислородных вакансий в наночастиц диоксида церия. Для описания структуры кристалличсекой решетки нанодисперсного диоксида церия предложено несколько моделей [Kosacki I. et al, 2002, Loschen C. et al, 2008]. Методом спектроскопии энергетических потерь установлено, что кислородная нестехиометрия нанодисперсного диоксида церия увеличивается от центра к поверхности. Таким образом, наночастица представляет собой структуру «ядро в оболочке», то есть в центре более стехиометричный диоксид церия, а ближе к поверхности наиболее нестехиометричный (рисунок 2).
Толщина поверхностного слоя наночастиц диоксида церия зависит от схемы и метода синтеза, и с уменьшением размера частиц доля Се2О3 резко возрастает [Wu L. et al, 2004]. Как показал Chen P. et al, 1993, значения параметров ячейки для сильноагрегированных частиц СеО2, синтезированных в присутствии пероксида водорода, составляет 0,542 - 0,560 нм. Увеличение параметра ячейки обусловлено частичным восстановлением ионов Се4+ на поверхности частиц под воздействием пероксида водорода [Tsunekawa S. et al, 2000]. Также стоит отметить, что данные различных авторов относительно корреляций параметра кристаллической решетки и размера нанодисперсного диоксида церия, достаточно противоречивы. Данные различия могут быть связаны с различной формой синтезируемых наночастиц [Tsunekawa S. et al, 2004, Tsunekawa S. et al, 2006]. Так как кислородная стехиометрия прямо коррелирует с каталитической активностью наночастиц, то для биомедицинских приложений желательно использовать наночастицы диоксида церия без ярко выраженной огранки. Также стоит отметить, что наночастицы диоксида церия округлой формы имеют наиболее низкую токсичность в живых системах.
Рассматривая наночастицы диоксида церия как основу будущих биомедицинских препаратов, существует необходимость их прецизионной дозировки, что делает разработку агрегативно устойчивых коллоидных растворов наночастиц диоксида церия, весьма актуальной и необходимой задачей. Для повышения растворимости и устойчивости коллоидных систем используют различные добавки, покрытия, стабилизаторы. На сегодняшний день, наиболее перспективными с биомедицинской точки зрения являются коллоидные растворы наночастиц характеризующиеся высокой стабильностью, низкой токсичностью, округлой формой и наличием биологически совместимого стабилизатора. Стабильность водных золей нанодисперсного диоксида церия, в том числе, определяется зарядом поверхности – дзета потенциалом. Vincent A. et al, 2010 исследовали зависимость дзета-потенциал наночастиц диоксида церия, полученных методом быстрого осаждения аммиаком, от продолжительности выдержки в водном растворе и концентрации наночастиц. Авторами показано, что с течением времени происходило уменьшение дзета-потенциала синтезированного золя наночастиц диоксида церия (рисунок 3А). Наночастицы, выдержанные в водных растворах с низким значением рН, через 40 дней инкубирования меняли свой заряд с положительного на отрицательный (рисунок 3Б). Подобные результаты были получены при уменьшении концентраций наночастиц в исходном растворе. Таким образом, положительно заряженные наночастицы диоксида церия в золе являются весьма неустойчивыми (рисунок 3В). Как показано Tsai Y. et al, 2007 лецитин может быть использован для синтеза биосовместимого коллоидного золя наночастиц диоксида церия размером 3,5 нм, которые были устойчивы в растворе тринатрийцитрата. KannanS.et al, 2014 предложил метод получения редиспергируемых в воде наночастиц диоксида церия, характеризующихся высокой степенью монодисперсности с размером 2,5 ±0,2 нм и гидродинамическим диаметром 4,8 нм. Perez J.et al, 2008 с коллегами, в качестве биологически допустимого стабилизатора для синтеза нанодисперсного диоксида церия, использовал декстран. Полученные наночастицы имели округлую форму с диаметром 4 -10 нм. Подобная схема синтеза была использована для синтеза наночастиц размером 3-17 нм, стабильных как в кислой, так и в щелочной среде, однако, в качестве стабилизаторов были использованы декстран и глюкоза [Alpaslan E.et al, 2015]. Также в качестве нетоксичного стабилизатора было предложено использовать поливинилпирролидон. Размер получаемых наночастиц прямо коррелировал с размером полимера вводимого в раствор. При этом столько крупные размеры наночастиц (30-150 нм) не представляют интереса для практического применения биомедицинских целях.
Помимо получения устойчивых коллойдных систем нанодисперного диоксида церия, весьма актуальным направлением развития нанотехнологичеких подходов в биомедицине является разработка систем их адресной доставки. Для нанодисперного диоксида церия предложено большое количество методов функционализации с целью направленной доставки в клетки и органы. Ранее предложен метод синтеза наночастиц диоксида церия модифицированных эпихлоргидрином и карбоксибензолсульфамидом, блокирующим активность карбоангидразы, ведущей к развитию глаукомы [Patil S. et al, 2007]. Сравнительный анализ запатентованных методов синтеза нанодисперсного диоксида церия показывает, что получаемые золи недостаточно стабильны, используемые стабилизаторы достаточно токсичны для живых систем, а отсутствие способов очистки коллойдного раствора от примесей у большинства предложенных методов серьезно ограничивает возможность их применения в биомедицинских целях. Ранее был предложен метод синтеза нанодисперсного диоксида церия, сочетающий в себе анионитную и гидротермально-микроволновую обработку, обеспечивающий образование наночастиц размером 2-5 нм [Иванова О. и др., 2011, Иванов В. и др., 2010]. Анионитная обработка золя до рН 9,8-9,9 обеспечивает наличие в системе небольшого количества нитрат-ионов, стабилизирующих раствор наночастиц диоксида церия. Анализ микрофотографий полученных золей подтвердил образование хорошо закристаллизованных кристаллов наночастиц диоксида церия. Распределение наночастиц по размерам не претерпевает изменений при варьировании температуры и времени гидротермальной обработки, что говорит о рост частиц идет по механизму ориентированного присоединения кристаллов, а не по механизму растворения и последующей кристаллизации.
Анализ гидродинамического радиуса и дзета-потенциала нанодисперсного диоксида церия
Исследование антиоксидантного действия нанодисперного диоксида церия при воздействии рентгеновского излучения проводили путем определения количества пероксида водорода и гидроксильного радикала в фосфатно-солевом буфере (рН=7,4) после воздействия рентгеновских лучей. Облучение проводили на рентгеновской терапевтической установке РУТ-15 (Россия) в дозе 1 Гр при мощности дозы 1 Гр/ мин, напряжении 200 кВ, фокусном расстоянии 37,5 см и силе тока 20 мА.
Концентpацию пеpоксида водоpода в присутствии наночастиц диоксида церия опpеделяли методом уcиленной xемилюминеcценции в cиcтеме люминол – 4-йодофенол – пеpокcидаза xpена. В качеcтве xемилюминометpа иcпользовали жидкоcтный cцинтилляционный cчетчик «Бета-1» (МедАппаpатуpа, Укpаина) для измеpения -излучения, pаботающий в pежиме cчета одиночныx фотонов (без cxемы cовпадений). Непосредственно перед измеpением cодеpжания Н2О2 к обpазцам наночастиц добавляли по 0,5 мл «cчетного pаcтвоpа», cодеpжащего: 10 мМ тpиc-HCl (pН 8,5), 50 мкМ 4-йодфенола, 50 мкМ люминола и пеpокcидазу xpена. Концентpацию Н2О2 pаccчитывали, иcпользуя калибpовочные гpафики завиcимоcти интенcивноcти xемилюминеcценции образцов от количества добавленной пеpекиcи водорода известной концентpации. Исходную концентрацию Н2О2, используемую для калибpовки, опpеделяли cпектpофотометpичеcки пpи длине волны 240 нм, используя коэффициент моляpного поглощения 43,6 М–1cм–1. Чувствительность метода позволяет определять Н2О2 в концентрации 0,1 нМ [Bruskov V. et al, 2002].
Определение концентрации гидроксильных радикалов, в присутствии наночастиц диоксида церия после воздействия ионизирующего излучения, осуществляли с помощью их реакции с кумарин-3-карбоновой кислотой (ККК), продукт гидроксилирования которой – 7-ОН-ККК – является удобной флуоресцентной меткой для определения образования этих радикалов. Наночастицы диоксида церия (10-3 -10-9 М) добавляли в раствор ККК непосредственно перед облучением. Интенсивность флуоресценции измеряли на спектрофлуориметре SFM 25A (“Kontron Instruments”, Италия) при ex = 400 нм, em = 450 нм в зеркальной кварцевой кювете при комнатной температуре [Chernikov A. et al, 2002]. Для калибровки результатов образования ОН - радикалов использовали растворы аутентичного препарата 7-ОН-ККК известной концентрации.
Скорость разложения пероксида водорода в присутствии наночастиц СеО2 оценивали полярографическим методом с использованием кислородного электрода Кларка.
Индукцию окислительного стресса в субстратзависимых клетках млекопитающих достигали добавлением в культуральную среду 500мкМ (для культуры NCTCL929) и 1,5 mM (для культуры B-50) Н2О2 , на 30 минут. Далее среда заменялась на новую, не содержащую пероксида водорода, и клетки культивировались при 37 С и 5% СО2 в течение 24 часов после чего проводили оценку жизнеспособности клеточных культур.
В качестве СВЧ генератора низкотемпературной аргоновой плазмы (НТАП) использовали исследовательскую установку MicroPlaSter , изготовленную фирмой AD TEK Plasma Technology Co.Ltd., предоставленную в ИТЭБ РАН Объединенным Институтом Высоких Температур РАН (Москва) при содействии Max Planck Institut fur extraterrestrische Physik (Ringberg, Германия). Параметры плазмы были гомогенными по площади при диаметре плазменной струи 30 мм на расстояниях 20 мм от выходного отверстия горелки, при ненулевой величине плавающего потенциала сетки температура выходящей струи газа ниже 40С; при использовании чистого аргона (99,9%) в газовом потоке обнаружены микропримеси NO2; мощность УФ облучения (309 нм и 316 нм) составляет 80 мкВт/см2, излучение в красной и инфракрасных (ИК) областях менее 40мкВт/см2. Для получения плазмы использовался высокоочищенный аргон (99.998 %), протекающий через СВЧ горелку со скоростью 2.2 слм (литров в минуту). Клетки высевались на чашки Петри с плотностью 20-30 тыс/см2 и культивировались в среде ДМЕМ/Т12 (1:1), содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 50мкг/мл пенициллина, 50мкг/мл стрептомицина и 1% L-глутамина при 37С во влажной атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% СО2. После 24 часов культивирования, среда заменялась на среду, содержащую HEPES, и клетки подвергались облучению низкотемпературной аргоновой плазмы в течении 5 минут на расстоянии 20 мм от горелки. После воздействия НТАП среда вновь заменялась на среду ДМЕМ/П2 (1:1), содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Через 24 часа проводили оценку жизнеспособности клеточных культур.
Клетки высевались в 96 луночных культуральные планшеты в плотности 20-30 тыс /см2 и культивировались в среде ДМЕМ/Р12 (1:1), содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 50мкг/мл пенициллина, 50мкг/мл стрептомицина и 1% L-глутамина при 37С во влажной атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% СО2. После 24 часов инкубации с наночастицами подвергались воздействию ультрафиолетового излучения. Облучение ультрафиолетовым излучением проводили с использованием лампы Camelion 26-3UE27 blacklight мощностью 24,6 Кдж/м2. Лампа располагалась снизу облучаемого планшета на расстоянии 15 см.
Сканирующая электронная микроскопия клеточных культур
Уровни экспрессии глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы при добавлении наночастиц диоксида церия в концентрации 10-5 М также увеличивались (ГП в 4 раза и ГР в 3раза). Глутатионредуктазная/глутатионпероксидазная (ГР/ГП) система является важнейшим компонентом антиоксидантной защиты организма, поддерживающим на стационарном уровне интенсивность протекания свободнорадикального окисления. Благодаря функционированию ГР/ГП системы в клетках млекопитающих обеспечивается детоксикация гидроперекисей и перекисей, являющихся основным источником гидроксильного радикала, образующегося в реакции Фентона в присутствии ионов Fe2+. ГР – распространенный флавиновый фермент, катализирующий обратимое НАДФН-зависимое восстановление окисленного глутатиона (GSSG). Ранее на эпителиальных клетках легких человека [Rubio L.et al, 2015] показано, что паракват-индуцированное повышение уровня внутриклеточных АФК в присутствии наночастиц диоксида церия (150М) не индуцируют экспрессию глутатионпероксидазы и сохраняет концентрацию внутриклеточного глутатиона на уровне контрольных значений. Авторы делают вывод о том, что антиоксидантное действие наночастиц СеО2 исключает необходимость активации данного фермента и индукцию его экспрессии. При этом авторы этой работы не проанализировали уровень экспрессии второго фермента ГР/ГП системы - глутатионредуктазы, биологическая роль которой заключается в поддержании высокой внутриклеточной концентрации восстановленного глутатиона (GSH) без увеличения его синтеза. Полученные нами данные показывают, что при действии цитрат-стабилизированных наночастиц СеО2 на эмбриональные фибробласты мыши происходит повышение уровней мРНК как глутатионпероксидазы, так и глутатионредуктазы. Если проанализировать уровни экспрессии ферментов ГР/ГП системы при концентрации наночастиц СеО2 10-7 М, сравнимой с использованной в работе Rubio L.et al, 2015, то видно (рисунок 19), что уровень экспрессии ГП достоверно увеличивается примерно в 2 раза, а ГР в 3 раза. Увеличение экспрессии ГР подтверждает, что уровень глутатиона в клетке может оставаться неизменным при активной работе фермента, который эффективно восстанавливает окислённый глутатион. Подобные расхождения в результатах могут быть связаны с использованием различных схем синтеза наночастиц диоксида церия, а, следовательно, и различными их физико-химическими свойствами. Также стоит отметить, что наши исследования проводились на эмбриональных фибробластах мыши, в том время как Rubio L.et al, 2015 проводили свои исследования на эпителиальных клетках легкого человека.
Концентрации наночастиц СеО2 (10-7 и 10-9 М), которые наиболее эффективно стимулировали пролиферацию мышиных фибробластов также увеличивали экспрессию антиоксидантных ферментов, однако, не в такой значительной степени (СОД1 в 6 раз, СОД2 в 9 раз, каталаза в 3 раза). Это показывает, что существует концентрационная зависимость влияния наночастиц СеО2 на модуляцию экспрессии основных антиоксидантных генов, а следовательно, и на уровень внутриклеточных АФК, что коррелирует со скоростью пролиферации клеток в культуре. По всей видимости, использование высоких концентраций (10-3 -10-5 М) наночастиц СеО2 приводит к их агрегации, за счет высоко активной поверхности, и потере первичных физико-химических характеристик, и вследствие этого исходной биологической активности.
Редокс-баланс является физиологически важным механизмом поддержания нормального внутриклеточного гомеостаза и метаболизма. В связи с этим подбор оптимальных концентраций наночастиц диоксида церия (рисунок 20) является ключевым аспектом в разработке специальных культуральных добавок на его основе. «Идеально подобранные» концентрации наночастиц СеО2 не должны снижать уровень внутриклеточных АФК ниже базальных значений, а также вызывать сверх экспрессию внутриклеточных антиоксидантных ферментов.
В рамках этой части работы нами изучено влияние нанокристаллического диоксида церия на функциональную и пролиферативную активность эмбриональных фибробластов мыши, а также на уровни внутриклеточных АФК и экспрессию основных антиоксидантных ферментов. Показано, что существует концентрационная зависимость влияния наночастиц диоксида церия на пролиферативную активность эмбриональных фибробластов мыши и уровни внутриклеточных АФК. Высокие концентрации наночастиц СеО2 (10-3-10-4М) значительно снижают уровни АФК ниже базальных, что приводит к снижению скорости пролиферации. Использование более низких концентраций наночастиц СеО2 (10-5-10-9М) приводит к небольшому снижению уровней внутриклеточных АФК, обеспечивая ускорения пролиферации эмбриональных фибробластов мыши. 3.5. Исследование эмбриотоксического действия наночастиц СеО2 и их влияния на эмбриогенез in vitro. Рассматривая наночастицы диоксида церия в качестве перспективного материала биомедицинского назначения необходимо проведение комплексного анализа его воздействия на репродуктивную систему млекопитающих. Мы исследовали влияние цитрат стабилизированных наночастиц диоксида церия на развитие эмбрионов мыши in vitro и процесса эмбриогенеза in vivo. Результаты культивирования ранних эмбрионов млекопитающих в присутствии цитрат-стабилизированных наночастиц СеО2 показывают отсутствие эмбриотоксического действия в широком диапазоне исследованных концентраций (10-5-10-9 М), при этом нормализуется развитие и уменьшается количество аномалий развития. Наночастицы СеО2 в концентрации 10-5М оказывали ярко выраженный стимулирующий эффект: все эмбрионы данной группы развивались до стадии бластоцисты (рисунок 21В). Количество эмбрионов в подопытных группах, развившихся до конечной стадии доимплантационного развития – бластоцисты, было на уровне контрольных значений.
Протекторное действие цитрат-стабилизированных наночастиц СеО2, вразличных моделях окислительного стресса
Далее для подтверждения того факта, что процесс интеграции наночастиц диоксида церия в полиэлектролитную микрокапсулу не приводит к изменению их физико-химических свойств и, в частности, антиоксидантной активности, было проведено исследование по оценке протекторного действия микрокапсул в модели окислительного стресса, индуцированного воздействием экзогенной пероксида водорода. Ранее показано, что данная модель может быть использована для адекватной оценки терапевтического потенциала наночастиц диоксида церия [Zhou G.et al, 2014, Clark A.et al, 2013]. Нами была использована высокая концентрация пероксида водорода (1,5 мМ пероксида водорода на 30 минут инкубации) нежели в иных публикациях [Gravina N.et al, 2016]. На рисунке 9А показана калибровочная кривая выживаемости клеток линии В50 в зависимости от концентрации пероксида водорода и оцененная методом МТТ через 24 часа культивирования. Для демонстрации защитного эффекта наноцерия нами была использована заведомо более высокая концентрация пероксида водорода (1,5 мМ). Ранее было показано, что наночастицы диоксида церия обладают каталозоподобной активностью [Singh R. et al, 2015], и способны инактивировать пероксид водорода в различных клеточных культурах [Chen S. et al, 2013, Hosseini A.et al, 2013]. Таким образом, мы использовали LD 20. Добавление 1,5 мМ пероксида водорода на 30 минут в культуру клеток В50 приводит к практически 100% гибели клеток через 24 часа, при этом предварительное внесение микрокапсул приводит к увеличению количества жизнеспособных клеток: до 50% для синтетических микрокапсул и до 70% для биодеградируемых микрокапсул (рисунок 52). При этом стоит отметить, что 1 капсулы недостаточно для эффективной защиты клетки от повреждений, индуцированных введением 1,5мМ пероксида водорода. Введение 10 и 100 микрокапсул на клетку в равной степени защищают клетки. На основании этого можно сделать вывод, что оптимальная концентрация составляет от 5 до 10 микрокапсул на клетку. Внесение в культуру клеток биодеградируемых микрокапсул обеспечивает большую защиту по сравнению с синтетическими капсулами. Данный факт можно объяснить тем, что при попадании в клетку, биодеградируемая микрокапсула быстро разрушается под действием ферментов цитоплазмы, высвобождая наночастицы диоксида церия. Наночастицы диоксида церия, выйдя из слоев
Полиэлектролитные микрокапсулы защищают клетки от окислительного стресса, вызванного воздействием экзогенного пероксида водорода. После 24 часовой инкубации с микрокапсулами, к клеткам на 30 минут было добавлено 1,5 мМ пероксида водорода. Жизнеспособность клеток через 24 часа была определена с помощью МТТ-теста. В качестве положительного контроля был использован 1,5мМ раствор пероксида водорода без добавления микрокапсул, в качестве отрицательного контроля – микрокапсулы без наночастиц диоксида церия. A- выживаемость клеток через 24 часа после воздействия 1,5 мМ пероксида водорода для синтетических и биодеградируемых микрокапсул, Б – схематическое изображение механизма действия наноцерия. полиэлектролита, распространяются по цитоплазме клетки, и тем самым могут более эффективно защищать клетку, обеспечивая покрытие большого объема цитоплазмы, в отличие от синтетических микрокапсул, которые локализуются в цитоплазме в определенных местах и способны инактивировать молекулы пероксида водорода только лишь в непосредственной близости от себя. Таким образом, интеграция наноцерия в полиэлектролитную матрицу не приводит к потере их антиоксидантных свойств (в частности, каталазоподобной активности) и может рассматриваться как безопасная и эффективная система их внутриклеточной доставки.
Нами показана возможность инкапсулирования цитрат-стабилизированных наночастиц диоксида церия в полиэлектролитную структуру из синтетических и биодеградируемых полимеров и проведен комплексный анализ характеристик наночастиц, который подтвердил эффективность их инкапсулирования с сохранением исходных физико-химических свойств, а также биологической активности.
Наличие кислородных вакансий (дефектов в кристаллической решетке) и авторегенеративный цикл окисления-восстановления (Ce3+ Ce4+) обеспечивают возможность использования наночастиц диоксида церия в качестве антиоксидантного препарата широкого спектра действия в условиях нейтральной рН здоровых тканей [Das S. et al, 2009]. При этом ранее показано, что в раковых клетках (при рН7) наночастицы диоксида церия проявляют сильные прооксидантные свойства. [Zhang L. et al, 2014, Asati A. et al, 2009]. Известно [Danhier, F.et al, 2010], что активный опухолевый рост сопровождается значительным снижением рН среды вследствие увеличения количества лактата в процессе анаэробного гликолиза, по которому функционируют большинство раковых клеток, а также гипоксии солидных опухолей вследствие нарушенного ангиогенеза. Нами показано, что синтетические и биодеградируемые микрокапсулы, модифицированные наночастицами диоксида церия, способны проникать в раковые клетки нейробластомы человека, что подтверждает возможность их использования для доставки терапевтически активных наночастиц в раковые клетки. В связи с этим микрокапсулы, функционализированные лигандами, тропными к конкретному типу опухоли, содержащие наночастицы диоксида церия, могут быть направлены непосредственно в опухолевую ткань, обеспечив дополнительный терапевтический эффект. С другой стороны, ранее показано [Briggs А. et al, 2015], что при воздействии низкоинтенсивного рентгеновского излучения (150кВ) наночастицы диоксида церия способны проявлять цитотоксическое действия, за счет генерации вторичных Оже-электронов, таким образом, функционируя в качестве эффективного радиосенсибилизатора. Возможность функционализмами полиэлектролитных микрокапсул дополнительными лигандами или тяжелыми металлами, например соединениями гадолиний или тербий, дает возможность создания на их основе тераностических препаратов, способных одновременно выполнять диагностические и терапевтические функции [Ai H., 2011].
Нахождение наночастиц в структуре слоев микрокапсулы дает возможность инкапсулировать в ядро микрокапсулы дополнительные фармацевтические агенты, белки, пептиды и т.д., которые могут усиливать эффект действия наночастиц. Напримеор, было показано влияние наночастиц диоксида церия на иммуногенность вакцины Vaxigrip [Zholobak N. et al, 2016]. Данная система раскрывает новые возможности доставки ультрамалых терапевтически значимых элементов, при этом сохраняется возможность контроля концентрации используемых компонентов и их доставки в точно заданную область. Использование полиэлектролитов различной природы, молекулярной массы и заряда дает возможность подобрать степень адсорбции и скорость деградации микрокапсулы в клетке. При этом возможность функционализации биодеградируемых полиэлектролитных микрокапсул специфическими антителами к рецепторам на конкретных типах клеток и тканей дает возможность целевой доставки капсулы в конкретную клетку.