Содержание к диссертации
Введение
CLASS CLASS ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1 Синтез магнитных наночастиц 11
1.2. Подходы, используемые для стабилизации наночастиц 14
1.2.1 Низкомолекулярные стабилизаторы 15
1.2.3 Модификации поверхности наночастиц неорганическими материалами 17
1.2.4 Методы векторизации наночастиц для биомедицинских приложений... 18
1.3 Свойства и параметры наночастиц 19
1.3.1 Размер наночастиц 19
1.3.2 Токсичность частиц 20
1.3.4 Магнитные свойства наночастиц 22
1.4 Применение наночастиц магнетита 24
1.4.1 Магнитная сепарация 24
1.4.2 Гипертермия 25
1.4.4 Тераностика 26
1.4.5 Магнитно резонансная томография 27
1.5 Композитные материалы, содержащие наночастицы оксида железа, и их применение 32
1.5.1 Магнитолипосомы и их применение 33
1.5.2 Композитные микрокапсулы, полученные методом последовательной адсорбции полиэлектролитов и наночастиц 34
Выводы к 1 главе 36
ГЛАВА 2. Материалы и методы 38
2.1 Синтез коллоидов оксида железа 38
2.1.1 Синтез водного раствора коллоидного магнетита стабилизированного цитрат-ионами 38
2.1.2 Методы характеризации полученных наночастиц магнетита 39
Характеризация полученных наночастиц магнетита 39
2.1.4 Экстракция наночастиц магнетита в неполярный растворитель 44
2.2 Приготовление и характеризация магнитолипосом 44
2.3 Формирование объектов методом полиионной сборки 47
2.3.1 Формирование нанокомпозитных покрытий, содержащих катионные и анионные наночастицы магнетита 47
2.3.2 Исследование морфологии, состава и магнитных характеристик нанокомпозитных покрытий з
2.3.3 Формирование и характеризация полиэлектролитных микрокапсул, содержащих наночастицы магнетита 49
Выводы ко 2 главе 51
ГЛАВА 3. Оценка воздействия наночастиц оксида железа на живые системы на клеточном и тканевом уровнях. Контрастирование наночастиц магнетита и магнитолипосом при МРТ 52
3.1 Получение и характеризация наночастиц магнетита для оценки их воздействия на живые системы 52
3.2 Взаимодействие коллоида магнетита с нейтрофильными гранулоцитами. Метод определения жизнеспособности клеток по результатам окрашивания постмортальным красителем пропидиумом йодидом (PI) 53
3.3 Исследование морфологических изменений органов лабораторных крыс с перевитым раком печени при внутрибрюшинном введении цитрат-стабилизированных наночастиц магнетита 53
3.4 Магнитно-резонансная томография 54
3.5 Интратуморальное введение магнитных липосом 55
3.6 Взаимодействие коллоида магнетита с клетками крови 55
3.7 Исследование морфологических изменений органов лабораторных крыс с перевитым раком печени при внутрибрюшинном введении цитрат-стабилизированных наночастиц магнетита 56
3.8 Контрастирование наночастиц магнетита и магнитолипосом при МРТ 58
3.9 Интратуморальное введение магнитных липосом 61
Защищаемые результаты исследования 65
ГЛАВА 4. Полиэлектролитные слои и микрокапсулы 66
4.1 Изучение магнитных свойств наночастиц оксида железа и полимерных структур, их содержащих 66
4.2 In vitro контрастирование биодеградируемых полиэлектролитных микрокапсул, содержащих наночастицы магнетита 73
4.3 Внутривенное введение магнитных микрокапсул 78
Выводы к 4 главе 84
Защищаемые результаты исследования 85
Заключение 86
Список использованных источников
- Модификации поверхности наночастиц неорганическими материалами
- Методы характеризации полученных наночастиц магнетита
- Взаимодействие коллоида магнетита с нейтрофильными гранулоцитами. Метод определения жизнеспособности клеток по результатам окрашивания постмортальным красителем пропидиумом йодидом (PI)
- In vitro контрастирование биодеградируемых полиэлектролитных микрокапсул, содержащих наночастицы магнетита
Модификации поверхности наночастиц неорганическими материалами
Магнитные наночастицы, в частности наночастицы оксидов железа, широко используются для биомедицинских целей in vivo, например, для усиления контрастирования и повышения диагностической чувствительности в магнитной резонансной томографии [1-6], целевой доставки и специфического связывания терапевтических агентов в биоткани [7-9], гипертемии с помощью переменного магнитного поля [10,11], тканевой инженерии [12]. Тематике магнитных наночастиц и их применению посвящено большое количество обзоров и монографий [13-16].
Распространенными модификациями оксидов железа являются гематит, маггемит и магнетит [17]. Анализ магнитных и токсикологических свойств показывает, что наночастицы на основе оксидов железа наряду с достаточно эффективными магнитными характеристиками обладают значительно меньшей токсичностью по сравнению с аналогами на основе никеля, кобальта и других элементов [18-20]. С точки зрения параметров и характеристик, описывающих магнитные свойства различных кристаллографических модификаций оксида железа, а значит и эффективность их дальнейшего медицинского применения в качестве контрастирующего агента для МРТ и для гипертермии переменным магнитным полем, наиболее оптимальным является магнетит.
Множество химических методов может быть использовано для получения магнитных наночастиц - синтез в микроэмульсии [21], золь-гель синтез [22], сонохимические реакции [23], гидротермальные реакции [24], гидролиз и термолиз прекурсоров [25] и др. Наиболее простым в реализации методом синтеза магнитных наночастиц является метод химической преципитации из растворов солей двух- и трехвалентного железа в присутствии основания [26-29]. Хотя процесс преципитации оксидов железа из раствора достаточно прост в исполнении, на результат влияет значительное число факторов, поэтому важно добиться воспроизводимости состава, распределения по размерам, электрокинетического потенциала получаемых наночастиц [30]. Основополагающим принципом химического синтеза наночастиц является инициация химической реакции и последующий контроль над процессами нуклеации и роста образующегося продукта. Понимание сути этих процессов и уровень контроля над ними определяют успешность достижения цели -получения монодисперсных наночастиц с желаемым составом и формой.
Современные методы получения наночастиц магнитных материалов можно разделить на две группы - основанные на получении наночастиц из компактных материалов или же, в противоположность, основанные на сборке наночастиц из атомов, ионов, молекул. По сравнению с методами получения магнитных наночастиц путем измельчения (испарение-конденсация [31.], лазерная абляция [32.], дробление компактных материалов в шаровых мельницах [33], концепция сборки «снизу» располагает большим числом возможностей для контроля над размером, формой, составом, структурой, процессами самоорганизации и физическими свойствами наночастиц. Удобным инструментом воплощения такого подхода являются методы химического синтеза наночастиц, представляющие собой и сочетающие в себе подходы неорганического, металлорганического и органического синтеза с процессами гетерогенного фазообразования в коллоидных системах.
Химический метод соосаждения, вероятно, является наиболее простым и эффективным способом получения магнитных частиц. Оксиды железа (РезС 4 либо или у-БегОз), как правило, получают путем смешивания солей двух и трехвалентного железа в пристутствии основания. Процесс можно представить следующим химическим уравнением для получения Без04 Fe2+ + 2Fe3+ + 80Н" = Fe304 + 4Н20 (1) Согласно термодинамике этой реакции полного осаждения Без04 следует ожидать при рН от 8 до 14, при стехиометрическом соотношении 2:1 (Fe / Fe ) в отсутствии кислорода [34].
Основным преимуществом процесса соосаждения является то, что может быть синтезировано большое количество наночастиц. Тем не менее, в данном случае контроль распределения частиц по размеру ограничен. Процесс соосаждения происходит в два этапа: [35-38] процесс быстрого зародышеобразования имеет место, когда концентрация вещества достигает критического пересыщения, а затем идет медленный рост зародышей путем диффузии растворенных веществ к поверхности кристалла. Для получения монодисперсных наночастиц оксида железа, эти две стадии должны быть разделены, т.е. зарождения следует избегать в период роста [39]. В перенасыщенном растворе, когда зародыши формируются одновременно, последующий их рост приводит к образованию частиц с очень узким размером распределением по размерам [40].
Контроль над размером и полидисперсностью, как правило, может быть осуществлен в течение очень короткого периода нуклеации, так как конечное число частиц определяется окончанием процесса зародышеобразования и оно не меняется в процессе роста частиц. В ряде исследований было рассмотрено влияние различных факторов на размер, магнитные характеристики или поверхностные свойства получаемых частиц [41-44]. Размер и форма наночастиц может относительно успешно варьироваться путем регулирования рН, ионной силы, температуры, природы солей (перхлораты, хлориды, сульфаты, и нитраты) или соотношения концентраций Fe(II)/Fe(III). Было изучено влияние различных параметров на процесс соосаждения солей (состав среды, соотношение Fe(II)/Fe(III), скорость инжекции потоков, температура, присутствие кислорода) на магнитные свойства и размер частиц [45].
Процесс соосаждении без использования стабилизирующих добавок был описан Массартом и им же был получен первый стабильный образец суперпарамагнитных частиц оксида железа путем осаждения солей FeCb и FeCb в щелочной среде [46]. В исходном синтезе, частицы магнетита (БезС ) имели приблизительно сферическую форму, а их размер составлял 8 нм [47]. Тщательное исследование параметров этого процесса позволило продемонстрировать влияние типа выбранного основания (аммиак, метиламин, гидроксид натрия), величины рН, добавок катионов и Fez7FeJT и их соотношения на выход реакции, размер и полидисперсность наночастиц [47]. Другие исследования показали, что изменение формы наночастиц связано с изменением поверхностной плотности заряда [48]. В работе [49] была подробно исследована зависимость размеров наночастиц магнетита и его коллоидная стабильность в водных щелочных и кислотных растворах, а также составлена диаграмма окислительно-восстановительного равновесия в системе магнетит/гематит/Бе(П). В частности установлено, что средний гидродинамический диаметр (определенный методом динамического светорассеяния) наночастиц БезС 4 в растворе соляной кислоты (рН 1.7-4.6) составляет 82 нм, а в растворе тетраметиламмония (рН 9.4-12.2) - 58 нм, а наиболее стабильные дисперсии образуются в интервалах рН 2-4 и 10-12. Вжно отметить, что частицы могут быть диспергированы в водном носителе или неполярных жидкостях, таких как масла или органические растворители, что позволяет получать магнитные эмульсии, капсулы, везикулы, липосомы [50-52].
Было показано, что увеличение концентрации цитрат-ионов в процессе соосаждения позволило уменьшить размер цитрат-стабилизированных наночастиц от 8 до 3 нм. Эффект добавок цитрата можно пояснить двумя процессами: 1) комплексообразование цитрата с ионами железа предотвращает нуклеацию, и 2) адсорбция цитрата на зародышевых частицах способствует гидролизу, что, в свою очередь, ингибирует рост частиц [53]. Размер частиц можно изменить путем пептизации, то есть добавления раствора электролита или осадителя к стабильному коллоидному раствору для его разрушения, в результате чего частицы большего размера образуют осадок, оставляя меньшие и практически монодисперсные частицы в надосадочной жидкости [54, 55]. Соотношение ионов Fe /Fe также влияет на состав, размер, морфологию и магнитные свойства осажденных наноразмерных частиц. Так, средний размер частиц увеличивается с ростом соотношения ионов Fe /Fe , что было подтверждено другими авторами [56]. Средний размер частиц магнетита также существенно зависит от кислотности и ионной силы [57, 58]. Так, чем выше рН и ионная сила, тем меньше размер частиц и ширина распределения по размерам, так как именно эти параметры определяют химический состав поверхности кристалла и, следовательно, ее электростатический заряд [39]. Некоторые другие факторы также оказывают влияние на размер наночастиц, например, увеличение скорости перемешивания приводит к его уменьшению. Таким же образом, уменьшение размера и полидисперсности наблюдается при добавлении основания к реакционной смеси [59]. Напротив, скорость инжекции потока, по-видимому, не имеет выраженного влияния на формирование наночастиц [60]. Было показано, что образование частиц магнетита уменьшается с ростом температуры [60]. Пропускание газообразного азота через реакционную смесь не только защищает магнетит от окисления, а также уменьшает размер частиц по сравнению с синтезами в присутствии кислорода [61, 62]. Однако немостря на простоту метода и его широкое использование, ряд вопросов, связанных с механизмом протекания реакции и факторами, влияющими на размер и стабильность наночастиц магнетита, остается не разрешенным до сих пор.
Методы характеризации полученных наночастиц магнетита
Наночастицы магнетита получали методом химической преципитации из раствора солей двух- и трехвалентного железа под действием основания. Первоначально готовили растворы используемых реагентов: 0.65 г БеСЬбЫгО и 0.24 г FeCi2 4H20 растворяли в 12 мл воды при перемешивании магнитной мешалкой при комнатной температуре. В реакционную камеру помещали 100 мл 0.1М раствора NaOH. Для последующей стабилизации коллоида предварительно готовили 100 мл раствора лимонной кислоты с концентрацией 20 мг/мл. Через камеры с раствором солей, раствором для стабилизации и реакционную камеру, содержащую гидроксид натрия, барботировали поток азота в течение 10 мин для удаления растворенного кислорода (рисунок 2.1, канал 1). Далее, раствор солей железа под давлением азота в течение нескольких секунд впрыскивали при активном перемешивании в раствор гидроксида натрия (рисунок 2.1, канал 2) и оставляли при перемешивании на 30 минут в атмосфере азота. Полученный черный осадок наночастиц магнетита осаждали с помощью постоянного магнита и сливали надосадочную жидкость, вытесняя её азотом в сливную камеру (рисунок 2.1, канал 4). Затем, при перемешивании, к осадку добавляли 25 мл раствора лимонной кислоты с концентрацией 20 мг/мл (также под давлением азота) (рисунок 2.1, канал 3), перемешивали и процесс осаждения повторяли. Подобную процедуру проводили 4 раза (пока не израсходуется раствор лимонной кислоты). Важно отметить, что за счет стабилизирующего эффекта карбоксилат-ионов лимонной кислоты размер частиц уменьшается и, соответственно, скорость осаждения коллоида в процессе промывки снижается. В процессе последней промывки оставляли 5-10 мл жидкости и интенсивно перемешивали. Полученный коллоидный раствор магнитных наночастиц помещали в диализную пленку и погружали в емкость с водой объёмом 1-1.5 л при слабом перемешивании и диализовали 4 дня. Все процессы смешивания реагентов и промывки проводили под атмосферой азота, управляя давлением газа в каналах системой клапанов. Концентрация полученного магнитного коллоида по методу сухого остатка составила 5 мг/мл.
Капли водного коллоидного раствора магнетита помещали на медную сеточку, покрытую углеродной пленкой. Измерения проводились с помощью просвечивающего электронного микроскопа ZeissEM 912 Omega (Zeiss, Германия). Для получения распределения по размерам образца наночастиц проводили анализ ПЭМ-изображений в программном пакете ImageJ [349].
Все спектры комбинационного рассеяния света были получены с помощью комбинированной системы ИНТЕГРА Спектра (NT-MDT), используя твердотельный лазер с длиной волны 473 нм (мощность лазера в точке 3.5 мВт). Измерения проводили с использованием х100 объектива с числовой апертурой 0.90 и пространственным разрешением 1 мкм. Время экспозиции составило 60 с.
Химическое осаждение оксидов железа из смешанных растворов солей двух-и трехвалентного железа в присутствии основания позволяет получать значительные количества наночастиц [350,351]. Химическая реакция, соответствующая формированию наночастиц магнетита, представлена ниже [352, 353, 354] Fe2+ + 2Fe3+ + 80H = Fe304 + 4H20.
Формирование наночастиц магнетита происходит в диапазоне значений рН от 9 до 14 при условии, что соотношение молярных концентраций Fe : Fe = 2:1, в отсутствии кислорода. Для предотвращения агрегации наночастиц их поверхность покрывали молекулами лимонной кислоты, -потенциал наночастиц магнетита составлял -30 ± 2 мВ при рН 6.5 ±0.1.
Распределение наночастиц по размерам было изучено методами динамического рассеяния света (рис. 2.2) и ПЭМ (рис. 2.3), при этом средний размер наночастиц составил 12±3и6±2нм соответственно. Значение размера наночастиц, установленное методом динамического рассеяния света, превышает таковое, полученное из анализа ПЭМ-изображений. Данный факт объясняется тем, что в первом случае измерение размера наночастиц происходило в водной среде, и, таким образом, полученный результат соответствует гидродинамическому радиусу частиц. Анализ ПЭМ-изображений (рис. 2.3) показал, что наночастицы достаточно монодисперсны и имеют форму, близкую к сферической.
С помощью спектрометра комбинационного рассеяния света зондовой нанолаборатории ИНТЕГРА Спектра регистрировали спектры различных образцов магнетита. На представленных на рисунке 2.4 спектрах можно видеть два основных пика: при 670 см-1 и около 700 см-1, относящихся к магнетиту [355] и маггемиту [356] соответственно. В образце 1, синтезированном в атмосфере азота, присутствует только магнетит, а образец 2 представляет собой смесь магнетита и маггемита, которая образуется при окислении магнетита на воздухе.
Рентгено-фазовый анализ порошка наночастиц магнетита проводили с помощью дифрактометра Xcalibur/Gemini (Oxford difraction) (излучение Cu-Ка, коллиматор 0,8 мм). Полученный спектр представлен на рисунке 2.5, где основные дифракционные пики соответствуют гристаллографическим плоскостям кубической обращенной шпинели БезОф (Ш), (220), (311), (222), (400), (333), (440), (533). Полученные результаты хорошо согласуются со спектрами, полученными из базы данных дифрактограмм.
Так как окисление наночастиц происходит от поверхности к центру, то использование метода КР позволяет оценить кинетику их окисления на начальных стадиях благодаля тому, что данный метод, в отличие от РФА, позволяет исследовать приповерхностный слой.
Важным вопросом для последующего использования коллоидных систем, является их устойчивость, которая приобретает особую значимость при биомедицинском применении коллоидов. При биомедицинском применении модификация поверхности наночастиц позволяет не только обеспечить их стабильность, но и управлять характером их взаимодействия с объектами, который определяет биосовместимость наночастиц. Кроме этого тип стабилизатора определяет технологические особенности дальнейшего использования частиц и свойства композитов, их содержащих. Одним из направлений применения наночастиц оксида железа в биомедицине является использование их в качестве компонента различных нанокомпозитных структур, таких как покрытия и микрокапсулы, получаемые методом последовательной адсорбции. Свойства таких структур сильно зависят от объемной доли наночастиц оксида железа, а на количество адсорбированных частиц магнетита влияет величина их электрокинетического потенциала. При этом изменение знака С,-потенциала позволяет применять различные материалы при получении подобных структур. Тем самым, используя различные полиэлектролиты для создания матрицы нанокомпозитных структур можно дополнительно управлять свойствами получаемых объектов.
Для получения различного знака электрокинетического потенциала частиц в качестве стабилизатора применялись лимонная и соляная кислоты, а также полиэлектролиты: поли акриловая кислота-со-малеиновая кислота (ПАК/МК) и полиэтиленимин (ПЭИ).
Процесс получения отрицательно заряженых наночастиц оксида железа стабилизированых цитрат-ионами был подробно описан в разделе 2.1. Частицы, стабилизированные цитрат-ионами были исследованы наиболее подробно в связи с тем, что основные исследования, связанные с биомедицинским применением магнитных коллоидов, проводились с использованием именно такого типа частиц.
Для получения положительно заряженых наночастиц магнетита использовали раствор 2М НС1. Водный коллоид был получен по методике соосаждения солей, описанной выше за исключением этапа промывки. Промывка проводилась деионизованной водой в таком же количестве как и в случае с цитрат-стабилизированными частицами. После промывки к коллоиду приливали 400 мкл 2М раствора соляной кислоты. Затем коллоидный раствор центрифугировали 1 мин при 18000 G. Размер полученных таким способом наночастиц составлял 25-30 нм, а дзета-потенциал - +58±2 мВ (по данным ДРС).
Также показана возможность перезарядки поверхности наночастиц с помощью полиэлектролитов. Для этого был использован раствор наночастиц магнетита (размер 8нм, дзета потенциал -31мВ) концентрацией 1,9 мг/мл. И был приготовлен водный раствор ПЭИ (молекулярная масса ЮкДа) концентрацией 0,1 мг/мл. Раствор наночастиц магнетита медленно прикапывали к раствору ПЭИ в течение 5 мин при сильном ультразвуковом воздействии. При этом были получены частицы размером 66 нм, имеющие дзета-потенциал 73 мВ и индекс полидисперсности 0,194. Характеризация раствора проводилась методом динамического рассеяния света. 2.1.5 Экстракция наночастиц магнетита в неполярный растворитель
Для получения коллоидного раствора магнетита в неполярной среде использовали наночастицы, предварительно синтезированные в воде. Водный раствор наночастиц магнетита получали методом химической преципитации из раствора солей двух- и трехвалентного железа по технологии, описанной выше, за исключением этапов промывки и диализа. Для перевода полученных наночастиц в неполярный растворитель использовались два способа.
В первом случае для перевода частиц использовали ультразвук. Для этого сразу после промывки смешивали полученный водный коллоид и керосин в соотношении 1:1,5 соответственно и добавляли олеиновую кислоту. В результате перемешивания с помощью ультразвука в течение 30 мин частицы оксида железа переходили в керосин и были стабилизированы олеиновой кислотой. Затем коллоидный раствор в органическом растворителе и воду разделяли методом центрифугирования.
Во втором случае для перевода частиц использовали ацетон. Для этого после промывки к раствору наночастиц приливали 5%(по объему) олеиновой кислоты и 75% ацетона при сильном перемешивании. После этого раствор центрифугировали 30 секунд при 1000 G и отбирали надосадочную жидкость. Затем наночастицы были диспергированы в неполярном растворителе. В случае избытка олеиновой кислоты частицы промывались аналогичным способом: раствор разбавляли ацетоном в несколько раз, затем центрифугировали 30 секунд при 4000 G и отбирали надосадочную жидкость. Осадок диспергировали в чистом неполярном растворителе.
Взаимодействие коллоида магнетита с нейтрофильными гранулоцитами. Метод определения жизнеспособности клеток по результатам окрашивания постмортальным красителем пропидиумом йодидом (PI)
Объем наночастиц оксида железа в нанокомпозитном покрытии представляет собой произведение объема нанокомпозитного покрытия (Vcoating) и объемной доли наночастиц оксида железа. Объем нанокомпозитного покрытия (VCOating) равен произведению площади поверхности (А) на толщину покрытия (dth). Мы использовали значения толщины покрытий (dth), измеренные методом АСМ (таблица. 4.1). Оценку объемной фракции наночастиц оксида железа в нанокомпозитных пленках проводили в рамках модели эффективной диэлектрической среды с помощью приближения Бруггемана. При рассчете объемной фракции были использованы результаты измерений аналогичных структур методом эллипсометрии[368]. Метод эллипсометрии используется для характеризации не только поверхности нанокомпозитов, но и всего их объема.
Значения объемной доли наночастиц оксида железа в нанокомпозитных покрытиях составили 0.37±0.02 для 6 слоев, 0.45±0.02 для 11 слоев и 0.75±0.12 для 16 слоев наночастиц оксида железа. Относительная погрешность при этом составила менее 15 %. Большой вклад в относительную погрешность расчета значений объемной доли наночастиц вносит погрешность определения площади поверхности (А). Массу наночастиц оксида железа рассчитывают как произведение объема наночастиц оксида железа в покрытии на плотность магнетита (5,15 г/смЗ).
На рисунке 5 (а) - (с) показана зависимость намагниченности образцов от приложенного магнитного поля при 193 и 473 К. Кривые М (Н), представленные на рис. 4.4 имеют типичную сигмоидальную форму с очень маленькой (приблизительно ноль) петлей гистерезиса в области слабого приложенного поля. Значения намагниченности насыщения MS зависят от числа магнитных слоев как при низкой, так и при высокой температуре (см. таблицу 4.3). Значения MS для наночастиц оксида железа хорошо коррелируют с данными, полученными в предшествующих работах[384]. -400
Данные, представленные в таблице 4.3, отражают немонотонную зависимость Ms от числа слоев наночастиц оксида железа при 193 К. Эта зависимость имеет максимум (72.35 emu/g.) при 11 слоях наночастиц оксида железа. Это значение хорошо согласуется с данными, полученными для наночастиц магнетита [384] и меньше чем значение Ms для объемного материала [385,386]. Обычно значение Ms для наночастиц меньше, чем для объемного материала [384]. Значения Ms равны 73.5 emu/g [385] и 92 emu/g [385] или 84 emu/g [386] для объемного маггемита и магнетита соответственно. При высокой температуре мы получили достаточно высокую намагниченность насыщения для образца 3. Значение это очень близко к намагниченности насыщения, измеренной нами при более низкой температуре (193 К), поэтому, полученный результат является очень важным с практической точки зрения.
В табл. 4.3 представлены значения магнитной проницаемости fi, полученные из кривой М(Н) для лразных температур при 193К и 473 К. Где М - намагниченность, а Н - приложенное магнитное поле. Зависимость магнитной проницаемости образцов от числа слоев оксида железа имеет немонотонный характер и имеет максимум при 11 слоях наночастиц. Немонотонный вид зависимости величины магнитной проницаемости от количества слоев оксида железа можно объяснить, используя предположение о различном химическом составе образцов. Поэтому было необходимо изучить химический состав полученных образцов. В данном случае наиболее удобным способом определения химического состава наноструктурированных материалов является спектроскопия комбинационного рассеяния [355, 383, 356].
Были изучены спектры КР образцов покрытий (оксид железа/РАН)п. Кремниевая подложка служила в качестве внутреннего стандарта для измерений КР. При этом использовался комбинационный сдвиг кремниевых пиков при 521 и 622 см-1 [387]. На КР спектрах присутствуют два характерных пика: при 670 см-1 и около 700 см-1, соответствующие магнетиту [355, 383] и маггемиту [356], соответственно.
In vitro контрастирование биодетрадируемых полиэлектролитных микрокапсул, содержащих наночастицы магнетита
Для изучения влияния полиэлектролитных микрокапсул, содержащих наночастицы магнетита, на формировние MP сигнала были получены биосовместимые композитные микрокапсулы на основе полиаргинина и декстран сульфата, содержащие три слоя наночастиц магнетита в составе оболочки. Было проведено in vitro исследование MP контрастирования суспензий микрокапсул в физиологическом растворе при их различных концентрациях. На рисунке 4.5(а,б) показаны ТІ и Т2 взвешенные томограммы пробирок, содержащих коллоид магнетита (левый столбец) и водную суспензию магнитных полиэлектролитных микрокапсул (правый столбец) в диапазоне концентраций 0,002 - 2,7 мг/мл в расчете на магнетит. Из рисунка видно, что микрокапсулы не контрастируют на MP изображениях, но при концентрациях выше 1 мг/мл начинают создавать артефакты. В ходе эксперимента проводили ферментативную деградацию оболочек полученных микрокапсул путем добавления трипсина, который разрушает пептидные связи поли-Ь-аргинина и, следовательно, оболочку микрокапсулы. ТІ и Т2 взвешенные томограммы разрушенных микрокапсул изображены на рисунке 4.5(а,б, средний столбец). При деградации оболочек микрокапсул наночастицы, находящиеся в них, высвобождаются и начинают контрастировать на MP изображениях. Исследование суспензии высвобожденных наночастиц методом ДРС показало, что наночастицы в процессе формирования/разрушения микрокапсул агрегировали не значительно. Это подтверждается данными МРТ (рис. 4.5(а,б), средний столбец) и ПЭМ (рис.4.6(а,б)). Таким образом, продемонстрирована возможность оценки деградации полиэлектролитных микрокапсул, содержащих наночастицы магнетита, in vitro и in vivo, используя MPT.
In vitro контрастирование биодеградируемых полиэлектролитных микрокапсул, содержащих наночастицы магнетита
Через сутки после введения микрокапсул в легких наблюдали уменьшение полнокровия по сравнению 4 часами после введения. Сохраняется перибронхиальная эозинофильная инфильтрация, до 30-40 эозинофилов в поле зрения. Микрокапсулы единичны в поле зрения. Через неделю после введения микрокапсул в легких эозинофильная инфильтрация сохраняется перебронхиально до 30±8 эозинофилов, также инфильтрация переваскулярно, преимущественно вокруг сосудов мелкого калибра. Наблюдали очаги ателектазов и отложения пигмента на периферии легочной ткани. Через месяц после введения микрокапсул в легких отмечали резчайшую гиперплазию лимфоидной ткани вокруг главного бронха, гиперплазия мышечного слоя сосудов, с лимфоидной инфильтрацией вокруг сосудов всех калибров.
Таким образом, максимальные изменения в легочной ткани наступают через 4 часа от момента введения, в виде резко выраженного полнокровия крупных сосудов, очаговых кровоизлияний, перибронхиальной эозинофильной инфильтрации, выраженность данных изменений уменьшается к суткам от внутривенного введения капсул. Наибольшее количество капсул, также через 4 часа в среднем количестве 20 в поле зрения в просвете сосудов среднего калибра, между бронхов, в строме. При этом, после суток к неделе выраженность аллергической реакции нарастает, с вовлечением бронхов и сосудов.
В селезенке через 75 минут отмечается полнокровие красной пульпы. В фолликулах, наряду с гемосидерином, наблюдали микрокапсулы до 2 в поле зрения. Также есть подозрения на разрушенные капсулы или гранулы гемоседерина, что дифференцировать очень сложно. Через 1 час отмечали увеличение количества микрокапсул до 3-4 в поле зрения. Нельзя исключить деградацию микрокапсул. Через 4 часа от момента введения отмечается выраженное полнокровие, микрокапсулы встречаются до 9 в поле зрения, в красной пульпе до 4 в поле зрения, а так же гранулы гемосидерина, при этом капсулы лежат конгломератами по 4 ли 5 микрокапсул. Через сутки после введения отмечали сохранение полнокровия красной пульпы. Количество микрокапсул уменьшилось: В белой пульпе до 3, в красной - до 6-7 капсул, которые лежат в макрофагах. Наблюдали косвенные признаки деструкции микрокапсул: в стенках сосудов наблюдается большое скопление оболочек капсул, а так же диффузное увеличение количества пигмента, нельзя исключить, что это их содержимое. Через неделю после введения микрокапсул в селезенки целые микрокапсулы определяются единично, но отмечали резкое увеличение содержания пигмента как в белой, так и красной пульпе. Граница между красной и белой пульпы четкие. Через месяц после введения микрокапсул в селезенки уменьшение пигмента в красной пульп, в белой пульпе остается пигмент. Границы между белой и красной пульпой четкие, фолликулы оформлены.
Таким образом, максимальные изменения в селезенке наступают через 4 часа от момента введения, в виде резко выраженного полнокровия, увеличения количества микрокапсул (в белой пульпе до 9 в поле зрения, в красной до 4), через сутки наибольшее накопление микрокапсул и также отмечаются косвенные признаки их деградации. При этом важным фактом является то, что признаки деградации отмечаются во все временные промежутки. Через неделю единичные капсулы отмечали в белой пульпе, пигмент диффузно. Через месяц в красной пульпе пигмент исчезает, в белой пульпе остается.
В почках по данным гистологии через 75 минут после введения отмечали умеренное полнокровие сосудов клубочков, расширение, а так же некроз эпителия извитых канальцев, ближе к базальным мембранам эпителия извитых канальцев наблюдали обрывки капсул. В просвете каждого клубочка встречается до 3 микрокапсул. Подозрение на белок в собирательных трубочках. Через 1 час отмечали выраженное полнокровие сосудов среднего калибра, в мозговом веществе, клубочков. Микрокапсулы наблюдали по 2 штуки в 20% клубочков. Через 4 часа клубочки полнокровны, в мозговом веществе кровообращение восстанавливается. В эпителии извитых канальцев наблюдали содержимое капсул - раствор магнетита. Микрокапсулы встречаются единично, только в 10% клубочков. Через сутки отмечали кровоизлияния в корковом веществе, петли расширены, встречается содержимое капсул, локализующееся вокруг ядра, иногда встречаются целые микрокапсулы в эпителии извитых канальцев. Через неделю после введения микрокапсул в почках отмечали нормальное строение, но сохранялось полнокровие стромы и клубочков, в эпителии извитых канальцев единично встречаются гранулы магнетита. Через месяц после введения микрокапсул в почках наблюдали нормальное строение, пигмента не обнаружено.
Таким образом, максимальные изменения в почках наблюдаются через сутки от момента введения, в виде кровоизлияний в корковом веществе, расширения петель, а также отмечается деградации капсул с накоплением содержимого в эпителии извитых канальцев, что не дает однозначного ответа: капсулы проходят через мочевой фильтр и содержимое реабсорбируется с мочой назад в канальца или капсулы попадают в эпителий через капилляры питающие эпителий. При этом максимальное содержание целых капсул наблюдается в первый периоды от введения (15 минут и час). Через неделю целых капсул не обнаружено. Но выявлен магнетит в эпителии извитых канальцев. Через месяц наблюдается нормальное строение почек и отсутствие пигмента. В сердце через 75 минут после введения отмечали умеренный отек, выраженное полнокровие сосудов. Отмечали зернистую дистрофия кардиомиоцитов. Микрокапсулы в межклеточном пространстве до 1- в поле зрения. Через 1 час после введения отек нарастает. Наблюдали единичные небольшие очаговые кровоизлияния. Зернистая дистрофия сохраняется. Микрокапсул не более 2-3 в поле зрения. Через 4 часа отмечали выраженный отек, уменьшение полнокровия. Микрокапсулы единичны в поле зрения. Через сутки отмечали выраженный отек, нарастающий к эндокарду, полнокровие не выражено. Капсул нет, сохраняется зернистая дистрофия и отмечается набухание единичных кардиомиоцитов. Через неделю после введения микрокапсул отмечали зернистую дистрофию, полнокровие крупных артерий и микро-циркуляторного русла, зонально участки отека. Через месяц наблюдали нормальное строение миокарда.
Таким образом, в сердце, максимальные изменения наблюдаются через 1 час после введения в виде выраженного отек и единичных очаговых кровоизлияний и максимального содержания капсул до 2-3 в поле зрения. Через час выраженность изменений уменьшается и капсулы не выявляются, так умеренно выраженный отек и зернистая дистрофия сохраняются к неделе после введения и через месяц наблюдается нормальное строение.
В печени через 75 минут от момента введения отмечали полнокровие и периваскулярное, а так же в капиллярах расположение конгломератов микрокапсул по 4 в поле зрения с количеством капсул в конгломерате до 10 штук. Через 7 час наблюдали единичные кровоизлияния, появление белковых капель, микрокапсулы видны в виде конгломератов, по 6-7 в поле зрения, содержащих до 5-6 капсул. Через 4 часа полнокровие в синусоидах ярко выражено, конгломераты из микрочастиц лежат группами по 2-4, иногда встречаются, в просвете сосудов вместе с эозинофилами. Через сутки не наблюдали конгломератов. Отмечали деструкцию микрокапсул, а часть лежащими не разрушенными и по большей части в макрофагах. Через неделю после введения микрокапсул в почках сохранялось балочное строение, отмечали полнокровие крупных сосудов, умеренную дистрофию гепатоцитов и пигмент в клетках Купфера и пигмент и едичные капсулы в синусоидах между гепатоцитами. Через месяц после внутривенного введения микрокапсул в печени отмечали нормальное строение, пигмент и капсулы отсутствуют.