Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 14
1.1. Электроформование нетканых материалов 14
1.1.1. Принципиальная схема и основные стадии процесса электроформования 15
1.1.2. Теоретические основы процесса электроформования . 19
1.1.3. Влияние технологических параметров на процесс волокнообразования.. 24
1.2. Применение нетканых материалов, полученных методом электроформования, в биомедицине. 28
1.2.1. Применение нетканых материалов, полученных методом электроформования, в тканевой инженерии.. 28
1.2.2. Применение нетканых материалов, полученных методом электроформования, в антибактериальной терапии 31
1.2.3. Применение платформ гигантского комбинационного рассеяния света на основе нетканых материалов, полученных методом электроформования, для мониторинга биохимических процессов in vitro и in vivo... 32
1.2.4. Особенности создания нетканых материалов на основе хитозана... 34
1.3. Применение фотодинамического эффекта: принципы и механизмы 35
1.3.1. Молекулярные механизмы фотодинамического эффекта... 37
1.3.2. Идеальный фотосенсибилизатор... 39
1.3.3. Обзор существующих фотосенсибилизаторов... 40
1.3.4. Нетканые материалы с фотосенсибилизаторами... 43
1.4. Подходы к описанию кинетики высвобождения биологически активных веществ из полимерной матрицы 44
1.5. Выводы к первой главе 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 51
2.1. Получение нетканых материалов на основе хитозана методом электроформования с фотосенсибилизатором «Фотосенс» 51
2.2. Получение нетканых материалов на основе хитозана с поверхностью, модифицированной плазмонно-резонансными наночастицами . 52
2.3. Методы исследования
2.3.1. Измерение динамической вязкости прядильных растворов. 53
2.3.2. Измерение электропроводности прядильных растворов 53
2.3.3. Определение структурных и морфологических характеристик нетканых материалов. 54
2.3.4. Определение оптических характеристик нетканых материалов. 55
2.3.5. Определение равновесной степени набухания нетканых материалов 56
2.3.6. Исследование процесса высвобождения фотосенсибилизатора из нетканых материалов 57
2.3.7. Исследование процесса деградации фотосенсибилизатора под действием лазерного излучения. 58
2.4. Эксперименты in vitro 58
2.4.1. Фотоиндуцированная антибактериальная активность нетканых материалов. 58
2.4.2. Определение биосовместимости нетканых материалов 59
2.4.3. Цитотоксическая активность нетканых материалов под действием лазерного излучения. 61
2.4.4. Пространственный контроль над ростом клеток. 62
ГЛАВА 3. Характеризация нетканых материалов на основе хитозана 64
3.1. Исследование морфологических и оптических характеристик нетканых материалов, содержащих фотосенсибилизатор «Фотосенс» 64
3.2. Кинетика высвобождения фотосенсибилизатора «Фотосенс» из нетканых материалов на основе хитозана 67
3.3. Исследование морфологических и оптических характеристик нетканых материалов с поверхностью, модифицированной плазмонно-резонансными наночастицами 70
3.4. Выводы к третьей главе 73
ГЛАВА 4. Фотоиндуцированная антибактериальная активность нетканых материалов на основе хитозана, содержащих фотосенсибилизатор «Фотосенс» 75
4.1. Определение антибактериальной активности нетканых материалов на основе хитозан, содержащих фотосенсибилизатор «Фотосенс» 75
4.2. Выводы к четвертой главе 78
ГЛАВА 5. Фотоиндуцированная цитотоксическая активность нетканых материалов на основе хитозана, содержащих фотосенсибилизатор «Фотосенс» 79
5.1. Определение биосовместимости нетканых материалов на основе хитозана, содержащих фотосенсибилизатор «Фотосенс», in vitro 79
5.2. Определение фототоксичности нетканых материалов на основе хитозана, содержащих фотосенсибилизатор «Фотосенс», in vitro 81
5.3. Пространственный контроль над ростом клеток 83
5.4. Выводы к пятой главе
Заключение
Список сокращений и условных обозначений
Список использованных источников
- Теоретические основы процесса электроформования
- Получение нетканых материалов на основе хитозана с поверхностью, модифицированной плазмонно-резонансными наночастицами
- Кинетика высвобождения фотосенсибилизатора «Фотосенс» из нетканых материалов на основе хитозана
- Определение фототоксичности нетканых материалов на основе хитозана, содержащих фотосенсибилизатор «Фотосенс», in vitro
Введение к работе
Актуальность работы
Передовое направление регенеративной медицины — тканевая инженерия представляет собой современную инновационную технологию, целью которой является применение фундаментальных знаний биологии, медицины и материаловедения для восстановления функций поврежденных тканей и органов [1]. В ее основе лежит принцип ориентированного заселения функционально активных клеток на матрицу-носитель (скаффолд), представляющую собой синтетическую или биологическую систему, имитирующую функции и свойства внеклеточного матрикса (ВКМ) [Л1]. Нетоксичность, биодеградируемость, механическая прочность, обеспечение пролиферации и дифференцировки нанесенных клеток являются основными требованиями, предъявляемыми к таким носителям.
В ряде случаев при создании скаффолдов для тканевой инженерии возникает необходимость в обеспечении пространственного контроля над ростом клеток [1—3]. Материалы с такой возможностью могут быть полезны, например, при стентировании сосудов. Как правило, при создании таких материалов в качестве модификатора используют антипролиферативные вещества [4], которые характеризуются неспецифичностью действия и могут оказывать влияние не только на клетки-мишени, но и на прилежащие клеточные структуры. Таким образом, для улучшения пространственного контроля над ростом клеток важно добиться повышения избирательности действия данных материалов.
Другой важной задачей тканевой инженерии является разработка раневых покрытий для эффективной антибактериальной терапии. Существующие материалы представляют собой полимерные матрицы, содержащие металлические (серебряные, медные, цинковые и др.) наночастицы или антибиотики. Однако, в связи с резистентностью многих микроорганизмов к антибиотикам и металлам, а также высокой токсичностью последних ведется активный поиск альтернативных подходов к созданию антибактериальных материалов [5,6].
Эффективным способом решения вышеупомянутых проблем является применение фотодинамического эффекта, в основе которого лежит цитотоксическое действие синглетного кислорода и других высокоактивных радикалов, образующихся при поглощении света определенной длины волны и мощности молекулами фотосенсибилизатора. В биологических системах синглетный кислород характеризуется чрезвычайно коротким периодом полураспада (< 0,4 мкс) и радиусом действия (~ 0,1 мкм), что обуславливает локализованность его цитотоксического действия. Кроме того, синглетный кислород и другие АФК взаимодействуют с клетками неселективно и, следовательно, не способствуют развитию резистентности бактерий. В связи с этим метод успешно применяется не только при лечении целого ряда онкологических заболеваний, атеросклероза, неоваскуляризации роговицы в
офтальмологии, но также является перспективным методом борьбы с антибиотикорезистентностью микроорганизмов.
Благодаря уникальному набору свойств полимерные нановолокна, полученные методом электроформования, отлично зарекомендовали себя в качестве скаффолдов для тканевой инженерии и раневых покрытий, а также многих других отраслей биомедицины. Электроформование представляет собой наиболее производительный и эффективный способ получения волокон диаметром от нескольких десятков нанометров до нескольких микрон из полимерных растворов под действием ПОЛЯ высокой электрической напряженности. Волокнистые материалы, полученные методом электроформования, характеризуются высокой удельной поверхностью и пористостью с субмикронным диаметром пор, а также хорошей паропроницаемостью. Кроме того, возможно получение волокон из широкого спектра полимеров (включая биосовместимые и биодеградируемые), а также модификация, функционализация и создание волокон, чувствительных к внешним стимулам, путем включения различных добавок (наночастиц металлов или их оксидов, фотосенсибилизаторов и др.)
На основании вышеизложенного, создание волокнистого материала с добавлением фотосенсибилизатора методом электроформования может решить проблему дистанционного пространственного контроля над ростом клеток. Такой скаффолд может одновременно выполнять две функции: 1) поддерживать адгезию и пролиферацию клеточных культур; 2) обеспечивать дистанционно управляемый и локализованный цитотоксический эффект под действием света определенной длины волны и мощности. Данный материал также может найти применение в качестве раневого покрытия с фотоиндуцированной антибактериальной активностью для терапии длительно незаживающих ран. При этом модификация поверхности нетканого материала плазмонно-резонансными наночастицами позволит проводить мониторинг биохимических процессов, протекающих при заселении клетками ВКМ или регенерации ран, в режиме реального времени посредством спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния света.
Цель работы и задачи исследования
Цель диссертационной работы состояла в реализации индуцированного световым воздействием цитотоксического эффекта с управляемой пространственной локализацией с помощью нетканых материалов, содержащих в своем составе фотосенсибилизатор «Фотосенс» (ФС).
Для достижения данной цели решались следующие задачи:
-
Получение нетканых материалов на основе хитозана с различным содержанием фотосенсибилизатора.
-
Изучение кинетики высвобождения фотосенсибилизатора из нановолокон
-
Исследование биосовместимости нетканых материалов на основе хитозана с различным содержанием фотосенсибилизатора в отсутствие светового
воздействия на примере нормальных (остеобласты мыши МСЗТЗ-Е1) и раковых (клетки рака молочной железы T-47D) клеточных линий.
-
Оценка индуцированной световым воздействием цитотоксичности нетканых материалов на основе хитозана с содержанием фотосенсибилизатора на примере нормальных (остеобласты мыши МСЗТЗ-Е1) и раковых (клетки рака молочной железы T-47D) клеточных
-
Демонстрация возможности дистанционного пространственного контроля над ростом нормальных (остеобласты мыши МСЗТЗ-Е1) и раковых (клетки рака молочной железы T-47D) клеточных линий.
-
Подтверждение фотоиндуцированной антибактериальной активности нетканых материалов на основе хитозана с содержанием фотосенсибилизатора на примере бактериального штамма Staphylococcus aureus.
-
Получение нетканого материала на основе хитозана с поверхностью, модифицированной плазмонно-резонансными наночастицами, для применения в качестве платформы гигантского комбинационного рассеяния света.
Научная новизна исследования
1. Показана возможность создания методом электроформования нетканых
материалов с различным содержанием фотосенсибилизатора «Фотосенс»
(1%, 2.5%, 5% в сух. веществе).
-
Изучен механизм высвобождения фотосенсибилизатора «Фотосенс» из нановолокон хитозана в дистиллированной воде и фосфатно-солевом буфере (рН=7,4).
-
Подтверждена цитотоксичность нетканых материалов с содержанием фотосенсибилизатора на примере различных клеточных культур (МСЗТЗ-Е1 — остеобласты мыши, T-47D — клетки рака молочной железы) под действием светового излучения.
-
Показана возможность дистанционного пространственного контроля над ростом клеток (МСЗТЗ-Е1 — остеобласты мыши, T-47D — клетки рака молочной железы) под действием светового излучения.
-
Показана фото индуцированная антибактериальная активность полученных нетканых материалов на примере бактериальном штамме Staphylococcus aureus.
-
Разработана методика получения нетканых материалов на основе хитозана с поверхностью, модифицированной плазмонно-резонансными наночастицами, для применения в качестве платформ гигантского комбинационного рассеяния света.
Практическая значимость работы
В настоящей работе показана возможность получения методом электроформования чувствительных к световому воздействию нетканых
материалов на основе хитозана с различным содержанием фотосенсибилизатора «Фотосенс». Такие материалы сочетают в себе преимущества фотодинамической терапии, а также волокнистых раневых покрытий и скаффолдов для тканевой инженерии и могут одновременно выполнять две функции: 1) поддерживать адгезию и пролиферацию клеточных культур; 2) обеспечивать дистанционно управляемый и локализованный цитотоксический эффект под действием света определенной длины волны и мощности. Кроме того, описан способ получения платформ гигантского комбинационного рассеяния света на основе нетканых материалов с поверхностью, модифицированной плазмонно-резонансными наночастицами.
Достоверность полученных результатов
Достоверность полученных результатов подтверждается применением научного оборудования, которое верифицируется в соответствии с международными стандартами обеспечения единства измерений и единообразием средств измерений, воспроизводимостью экспериментальных данных, а также использованием математико-статистических методов обработки результатов.
На защиту выносятся следующие положения:
-
Высвобождение фотосенсибилизатора «Фотосенс» из нетканого материала на основе хитозана проходит в два этапа: первый этап характеризуется аномально-диффузным поведением и длится в течение 9-10 часов в фосфатно-солевом буфере и 20 часов в дистиллированной воде, последующий выход красителя обусловлен кинетическими процессами, подчиняющимися законам Фика.
-
Фотоиндуцированная цитотоксическая активность нетканого материала на основе хитозана, содержащего препарат «Фотосенс», подтверждена в отношении штамма Staphylococcus aureus посредством диско-диффузионного метода. Показано, что средний диаметр зоны задержки роста бактерий (с учетом диаметра самого диска нетканого материала) составил около 50 % от диаметра области облучения светодиодным источником (а=660±15 нм, 48 мВт, 4 Дж/см ) и 35 % от диаметра области высвобождения фотосенсибилизатора в агар.
-
Показана реализация дистанционного и локализованного контроля над ростом клеток (остеобластов мыши МСЗТЗ-Е1, клеток рака молочной железы T-47D), инкубированных совместно с образцами нетканого материала на основе хитозана, содержащего препарат «Фотосенс», под действием светодиодного излучения (а=660±15 нм, 70 мВт, 2кДж/см ), попадающего в полосу поглощения фотосенсибилизатора.
Апробация работы
Основные результаты диссертационного исследования были представлены на Ежегодной Всероссийской научной школе-семинаре «Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине-2011» в программе «У.М.Н.И.К.» (Саратов, 2011, устный доклад, победитель конкурса); в ходе работы II международного семинара «Smart nanocomposite scaffold for tissue engineering» (Саратов, 2012, устный доклад); на Ежегодной Всероссийской научной школе-семинаре «Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине-2013» (Саратов, 2013, устный доклад); на IV международном семинаре «Nanoparticles, nanostructured coatings and microcontainers: technology, properties, applications» (Берлин, 2013, устный доклад); в ходе работы III Международной конференции «Супрамолекулярные системы на поверхности раздела» - «Супраз-2013» (Туапсе, 2013, диплом III степени за устный доклад); на Международной конференции «Saratov Fall Meeting-2013», 1st International Symposium on Optics and Biophotonics: Optical Technologies in Biophysics & Medicine XV (Саратов, 2013, постер); на V международном семинаре «Nanoparticles, nanostructured coatings and microcontainers: technology, properties, applications» (Гент, 2014, устный доклад, постер, победитель постерной секции); на VIII международном симпозиуме «Molecular Order and Mobility in Polymer Systems» (Санкт-Петербург, 2014, устный доклад), на VI международном семинаре «Nanoparticles, nanostructured coatings and microcontainers: technology, properties, applications» (Саратов, 2015, устный доклад, диплом III степени за устный доклад), а также на семинарах научной группы и кафедры Саратовского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского в течение всего периода обучения в аспирантуре.
Конкурсная поддержка работы
Финансовая поддержка работы, представленной в диссертации, осуществлялась при помощи следующих проектов: «Разработка технологии создания функциональных раневых покрытий из полимерных нановолокон» в рамках программы «У.М.Н.И.К.» (НИОКР № 9928р/14246 от 11.01.2012); «Дистанционно управляемые наноструктурированные материалы, включающие биосенсоры и инкапсулированные биоактивные вещества» (грант РФФИ № 12-03-33088); «Дистанционно управляемые наноструктурированные системы для адресной доставки и диагностики» (грант Правительства Российской Федерации № 2013-220-04-014); «Комплексное математическое моделирование бескапиллярного электроформования нановолокон и экспериментальное исследование процесса создания нановолокнистых материалов» (грант РФФИ в рамках научного проекта № 12-01-31349-мол_а_2012); «Исследование переноса заряда и спектров поглощения и фотолюминесценции в упорядоченных системах «наночастицы в органической матрице» и разработка физико-технологических основ для создания элементной базы молекулярной электроники» (гранта Российского научного фонда №14-12-00275);
«DINaMIT» по программе Marie Curie International Research Staff Exchange Scheme (FP7-PEOPLE-2013-IRSES), в рамках которого осуществлялись научные стажировки в университетской клиникой «Charite» (г. Берлин), а также при поддержке гранта Правительства Российской Федерации «Дистанционно управляемые наноструктурированные системы для адресной доставки и диагностики» (договор №14.Z50.31.0004 от 4 марта 2014).
Личный вклад диссертанта заключается в самостоятельном выполнении представленных в диссертационной работе экспериментальных исследований и расчетов, включая получение нетканых материалов, а также проведение экспериментов по характеризации образцов, экспериментов in vitro и анализа литературы по соответствующей тематике. Постановка задач исследования и обсуждение результатов проведены под руководством профессора Д. А. Горина. При использовании результатов, полученных в соавторстве, приведены ссылки на соответствующие источники.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 4 статьи — в рецензируемых научных изданиях, 5 статей — в трудах российских и международных конференций.
Структура и объем диссертации
Теоретические основы процесса электроформования
Несмотря на достаточно долгую историю успешного применения метода ЭФ, теоретическим исследованиям процесса уделялось сравнительно мало внимания. На сегодняшний день известно несколько моделей, описывающих образование и движение полимерной струи в электрическом поле, однако единой теории процесса ЭФ пока не разработано.
Электроформование представляет собой сложный процесс, включающий в себя электрогидродинамику слабопроводящих неньютоновских жидкостей и фазовые превращения - испарение растворителя и отвердевание полимерного волокна. В ходе процесса ЭФ струя полимерного раствора проходит несколько стадий - конус Тейлора (появление струи), прямолинейного стационарного течения, нестабильного движения и окончательного формирования полимерного волокна с его осаждением на подложке.
Предшественником метода ЭФ можно считать электрогидродинамическое распыление жидкостей (ЭРЖ), где жидкость с низкой электропроводностью вытекает из дозирующего сопла, находящегося под постоянным высоким электрическим напряжением, и распыляется за счёт отталкивания одноименных электрических зарядов на мелкие капли. Электрогидродинамика заряженных струй изучена достаточно подробно [41-43]. Так, в литературе был исследован механизм появления струи из капли полимерного раствора [43,44], предложены одномерные модели течения стационарной струи [44,45], а также дискретные модели, описывающие поведение нестабильной струи [32, 47,48].
Существование устойчивой заряженной струи является важнейшим условием осуществления процесса ЭФ. В приближенной теоретической модели предполагается, что ньютоновская жидкость с плотностью р, вязкостью //, относительной диэлектрической проницаемостью е и удельной объемной электропроводностью у вытекает с объемным расходом Q из нижнего конца вертикально расположенного металлического капиллярного сопла с внешним радиусом гс в пространство с однородным внешним электрическим полем напряженностью Е.
Предполагается, что при достижении некоторого максимального объема Vk капли жидкости будут отрываться от капилляра с периодом tx, сохраняя некоторое время жидкую перемычку: При этом считается, что капли имеют сферическую форму, а обрыв перемычки происходит при смещении капли на величину ее радиуса. В уравнении движения капли пренебрегаем противодействующими электрической и капиллярной силами, а для силы вязкости принимаем приближение Стокса: m— = mg-arr/U; U(0) = 0, (2) dt с где U - скорость капли, т - ее масса и а - константа порядка . Формула для времени жизни перемычки: t2= — = к сИ (3) U mg Предполагается, что при tx = t2 капли не успевают разделиться, и устанавливается непрерывная стационарная струя.
Далее, составив баланс электрической (4), гравитационной (5) и поверхностной (6) сил на нижнем срезе сопла, при соблюдении которого наступает отрыв капли, получаем в качестве искомых условий перехода капельного течения в стационарную струю систему уравнений (7).
Подстановка в (7) уравнений (3) - (6) и исключение rk позволяют получить искомые условия, сохраняющиеся и в отсутствии электрического поля, в безразмерной критериальной форме:
Данная модель учитывает влияние не только коэффициента поверхностного натяжения, но также плотности, вязкости жидкости, объемной удельной электропроводности и относительной диэлектрической проницаемости.
Было выдвинуто предположение о нарушении баланса давлений на поверхности нижнего конца еще не оторвавшейся от капилляра заряженной сферической капли [49].
Pel+Pg=Psuf (9)
В данном случае предложенная модель описывает способность электрических сил, которые противодействуют капиллярным силам, получить единую стационарную поверхность жидкости, включающую не оторвавшуюся от сопла каплю и вытекающую из нее стационарную струю.
Основным недостатком большинства существующих моделей является их одномерность: они основываются на предположении постоянного распределения свойств жидкости и течения вдоль поперечного сечения струи. Тем не менее, существуют работы, в которых предложены трехмерные модели течения устойчивой осесимметричной струи в электростатическом поле, учитывающие массоперенос вследствие испарения растворителя с поверхности тонких струй, что может привести к существенной нелинейности реологических свойств жидкости по сечению струи и параметров ее течения [50]. Попытки моделирования нестабильной струи в электрическом поле были реализованы в виде представления струи как системы заряженных частиц, соединенных вязкоупругими связями (рисунок 3) [33].
Исходя из данной модели, на каждую частицу (точку) модели действуют вязкоупругая сила Fve, сила кулоновского взаимодействия Рс, сила внешнего электрического поля Fel, а также сила поверхностного натяжение Fsuf и гравитационная сила Fg. Таким образом, основное уравнение динамики для такой системы (рисунок 3) записывается следующим образом: В качестве итогового выражения основного уравнения динамики для /-точки такой системы (рисунок 3) авторы статьи предлагают следующей: — dt 2 f1N R 3 ] h /. !+1 M , (11) где егш - напряжение между / и i+1 точками, adi - напряжение между / и i-1 точками, aui - радиус участка между / и i+1 точками, а ц - радиус участка между / и i-1 точками, /ш- длина участка между і и і+l точками, ldi - длина участка между / и i-1 точками, е - заряд точки, Щ - расстояние между точками / и j, V0 -напряжение между формующим электродом и подложкой, h - расстояние между формующим электродом и подложкой, = —, 0 = 8,854187817е-12 Ф/м электрическая постоянная, – коэффициент поверхностного натяжения, – кривизна, aa - средний радиус участков между верхней и нижней точками.
Математическая модель (11) использовалась для изучения процесса оседания струй на подложку в зависимости от конфигурации собирающих электродов и свойств электрического поля [51]. Однако в данной модели не учитывается интенсивное испарение растворителя с поверхности струи.
Модифицированная модель [33], учитывающая влияние испарения на поведение нестабильной струи и диффузию полимера внутри ее представлена в работе [52].
Описанные модели направлены на исследование течения струи полимерного раствора на начальных этапах её формирования и в процессе нестабильного движения. Моделирование завершающего этапа электроформования, во время которого из изначально жидкой полимерной струи образуется воздушно-сухая нить, оседающая на субстрат в виде случайно или частично упорядоченно ориентированных волокон, до сих пор не рассматривалось.
Получение нетканых материалов на основе хитозана с поверхностью, модифицированной плазмонно-резонансными наночастицами
Фотоиндуцированная антибактериальная активность образцов оценивалась посредством диско-диффузионного метода на примере бактериального штамма Staphylococcus aureus. Бактериальный штамм ATCC 25923 был получен из Саратовского научно-исследовательского института травматологии и ортопедии. Дизайн эксперимента показан на рисунке 8. Для каждой чашки Петри использовали заранее простерилизованные диски диаметром 10 мм, вырезанные из материала на основе хитозана ФС 0% (2 штуки), а также ФС 5% (2 штуки). Образцы помещали на поверхность агара в чашке Петри, предварительно инокулированного Staphylococcus aureus. В течение 2 часов образцы инкубировались при температуре 37 оС. За это время происходила частичная диффузия фотосенсибилизатора в агар. Далее, один из образцов ФС 0% (контроль для исключения влияния теплового эффекта), а также один образец ФС 5% подвергались световому воздействию посредством фототерапевтического излучателя АФС («Полироник», Россия) на длине волны 660 нм при плотности мощности излучения 2,5 мВт/см2 в течение 10 минут. Образцы, не подвергавшиеся световому воздействию, рассматривались как контроль на «темновую» токсичность. После облучения чашки Петри были инкубированы в течение 24 часов при температуре 37 оС. Для оценивания подавления роста бактерий измеряли диаметр зоны задержки роста. Для каждого эксперимента использовали пять чашек Петри. Всего проводилось три таких эксперимента.
Дизайн эксперимента, подтверждающего фотоиндуцированную антибактериальную активность нетканых материалов на основе хитозана, содержащих фотосенсибилизатор
Исследования in vitro проводили на клеточных линиях: T-47D (рак молочной железы), полученные из клиники онкологии и гематологии (Charit, Германия); MC3T3-E1 (мышиные остеобласты), полученные из лаборатории биоматериалов (Институт коллоидов и поверхностей Общества Макса Планка, Германия).
При культивировании клеток MC3T3-E1 использовалась питательная среда альфа-МЕМ, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 0.1 % гентамицина, 0.1 % аскорбиновой кислоты, 1 г/л D-глюкозы и 3.7 г/л бикарбоната натрия. При культивировании клеток T-47D использовалась питательная среда RPMI 1640, содержащая 10% ЭТС и 1% пенициллин-стрептомицина. Клетки инкубировали в условиях насыщенной влажности при 37 оС в атмосфере 3–5% СО2. Питательную среду меняли каждые 3 дня. При достижении 75–85% конфлюентности монослоя клетки диссоциировали с помощью 0.25 % раствора трипсин-ЭДТА и переносили на предварительно простерилизованные образцы нетканого материала, закрепленные в 6-луночных планшетах, в концентрации 105 клеток/мл в 2мл питательной среды на лунку.
Адгезию, распластывание и последующую пролиферацию клеток на нетканых материалах на основе хитозана с различным содержанием «Фотосенса» оценивали посредством конфокального сканирующего лазерного микроскопа (Zeiss LSM 510 Meta, Германия). Флуоресцентные изображения получали по истечении 6 дней культивирования. Образцы предварительно фиксировали 4 % раствором формальдегида, затем окрашивали с использованием флуоресцентных красителей. Для окрашивания актиновых нитей цитоскелета клеток MC3T3-E1 (зелёный цвет) использовали краситель фаллоидин меченый Alexa Fluor 488 (1:20, Invitrogen, США), ядра клеток (красный цвет) были окрашены раствором пропидий йодида (1:300, Invitrogen, США). Возбуждение флуорофоров, фаллоидина меченого Alexa Fluor 488 и пропидий йодида, осуществлялось на длине волны 488 нм с применением 505-530 нм полосового фильтра и на длине волны 543 нм с применением 560 нм длинноволнового пропускающего фильтра, соответственно. Количественную оценку токсичности нетканых материалов с различным содержанием фотосенсибилизатора (0%, 1%, 2.5% и 5%) проводили с помощью стандартного 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолиум бромид (MTT)-теста. Для постановки эксперимента клетки засевали в 96-луночные планшеты (Falcon BD, США) в количестве 5103 на лунку и инкубировали в условиях насыщенной влажности при 37 оС в атмосфере 3–5% СО2 в течение 24 часов, после чего меняли питательную среду и помещали образцы нетканого материала (диметром 5 мм). Через 24, 48 или 72 часа образцы вынимали, затем в каждую лунку добавляли 1 мг/мл МТТ в питательной среде и инкубировали в течение 2 часов при 37 С в атмосфере 3–5% СО2. Образовавшийся в результате формазан экстрагировали в лизирующем растворе (99% ДМСО, 0.6% уксусной кислоты и 0.1 г/мл лаурилсульфат натрия). Оптическую плотность измеряли с помощью микропланшетного спектрофотометра (Biotek PowerWave 340, США) на длине волны 570 нм. За 100 % на калибровочной кривой принимали оптическую плотность клеток пластике.
Влияние лазерного излучения на клетки, культивированные совместно с образцами ФС 0% и ФС 5%, также оценивалось посредством MTT-теста.
Для постановки эксперимента клетки T-47D и MC3T3-E1 раскапывали в концентрации 5 х 104 клеток/мл в 200 мкл полной среды RPMI-1640 в 96-луночные плоскодонные планшеты, которые помещали в инкубатор при температуре 37 C и 5% СО2. По истечение 24 часов в каждую лунку добавляли заранее подготовленные образцы размером 0,5х0,5см и инкубировали с клетками в течение дополнительных 24 часов. Для каждого вида материала (ФС 0% и ФС 5%) и контроля использовали по 6 лунок на планшет, 3 из которых подвергались световому воздействию посредством фототерапевтического излучателя АФС («Полироник», Россия) на длине волны 660 нм при плотности мощности излучения 2,5 мВт/см2 в течение 15 минут.
Для оценки способности раковых клеток к восстановлению метаболической активности по истечении 48, 72 и 96 часов после облучения были проведены дополнительные эксперименты. Для постановки эксперимента для каждого временного интервала использовали два 96-луночных плоскодонных микропланшета. Для каждого вида нетканого материала использовали по 7 лунок на планшет. Контролем служили клетки, инкубированные в отсутствие материала. Эксперимент может быть условно разделен на пять этапов (рисунок 9). На первом этапе клетки засевали в 96-луночные планшеты (Falcon BD, США) в количестве 5103 на лунку и инкубировали в условиях насыщенной влажности при 37 оС в атмосфере 3–5% СО2 в течение 24 часов. На втором этапе к клеткам помещали образцы нетканого материала (диметром 5 мм) и инкубировали в течение дополнительных 24 часов. Далее, образцы материала извлекали (этап 3), а клетки, инкубированные на одном из планшетов, подвергались лазерному излучению в течение 15 минут на лунку. Клетки, инкубированные на втором планшете, служили в качестве «темнового» контроля (этап 4). Оба микропланшета помещали в инкубатор и через 24, 48, 72 и 96 часа проводили MTT-тест (этап 5). Всего проводили пять таких экспериментов, по результатам которых были посчитаны средние значения и 95% доверительный интервал.
Кинетика высвобождения фотосенсибилизатора «Фотосенс» из нетканых материалов на основе хитозана
Показано, что метаболическая активность клеток увеличивается в течение всего периода культивирования. Однако клетки, культивированные совместно с образцами нетканых материалов, характеризуются более низкой метаболической активностью по сравнению с контролем (клетки в отсутствие материала). При этом у раковых клеток T-47D, культивированных совместно с образцами ФС 2,5% и ФС 5%, наблюдается значительное снижение метаболической активности по сравнению с контролем и образцами ФС 0% и ФС 1% (рисунок 20 а). Указанный эффект может быть обусловлен «темновой» токсичностью фталоцианина алюминия, зависящей от его концентрации [160-162]. Следует также отметить, что для данного класса фотосенсибилизаторов минимальная концентрация, обладающая «темновой» токсичностью, до сих пор не точно определена [160,161,163]. Кроме того, некоторый фототоксический эффект может наблюдаться под действием фонового освещения [162]. В отличие от раковых клеток T-47D метаболическая активность нормальных клеток MC3T3-E1 не зависит от количества фотосенсибилизатора в материале (рисунок 20 б).
Зависимость метаболической активности раковых T-47D (а) и нормальных MC3T3-E1 (б) клеток, культивированных с образцами нетканых материалов с различным содержанием фотосенсибилизатора (0%, 1%, 2.5% и 5%) с течением времени.
Влияние лазерного излучения на клетки, культивированные совместно с образцами ФС 0% и ФС 5%, оценивалось посредством MTT-теста. Эксперимент проводили согласно методике, описанной в п. 2.4.3. После облучения наблюдалось значительное снижение ( 90%) метаболической активности раковых клеток (рисунок 21 a), при этом нормальные клетки демонстрировали относительную резистентность к фотодинамическому эффекту (рисунок 21 б).
Для оценки способности раковых клеток к восстановлению метаболической активности по истечении 48, 72 и 96 часов после облучения были проведены дополнительные эксперименты. В течение 96 часов культивирования после светового воздействия клетки оставались метаболически не активны (рисунок 22). При этом метаболическая активность клеток, культивированных с образцами ФС 0% и подвергшихся облучению, также как контроля и «темнового контроля» увеличивалась в течение всего периода культивирования. Таким образом, предполагается, что угнетение метаболической активности клеток обусловлено действием фотодинамического эффекта, а не нагревом или какими-либо другими факторами.
Влияния светового воздействия на метаболическую активность раковых T-47D (а) и нормальных MC3T3-E1 (б) клеток, культивированных с образцами нетканых материалов ФС 0% и ФС 5%), по истечении 24 часов после облучения [150] Механизмы различной чувствительности раковых и нормальных клеток к ФДЭ до сих пор не изучены. Существуют несколько теорий, объясняющих данное явление. По одной из них быстро растущие раковые клетки более чувствительны к действию ФДЭ из-за интенсивного метаболизма и, по этой причине, более интенсивного захвата фотосенсибилизатора. Однако в ряде исследований показано отсутствие принципиальных различий в захвате фотосенсибилизатора в раковых и нормальных клетках [162,164-166]. По другой теории нормальные клетки обладают лучшей способностью к восстановлению окислительных повреждений. При этом раковые клетки претерпевают больший оксидативный стресс, что приводит к полной или частичной инактивации антиоксидантных механизмов [167,168]. У большинства раковых клеток часто представлен небольшой набор антиоксидантных ферментов, защищающих клетки от АФК [169-174]. Таким образом, отсутствие надежной антиоксидантной защиты делает раковые клетки более чувствительными к оксидативному стрессу. Показано, что клетки T-47D, трансфектированные геном, кодирующим экспрессию антиоксидантного фермента глютатиона S-трансфектазы, демонстрируют большую устойчивость к пероксидному окислению липидов и повреждениям, инициированным свободными радикалами, по сравнению с нетрансфектированными клетками [175].
На данном этапе исследования была показана возможность пространственного контроля над ростом клеток T-47D и MC3T3-E1 (5х104 клеток/мл в 200 мкл полной среды), культивированных совместно с образцами нетканого материала ФС 5%, под действием излучения (1,75 Вт/см2, 15 минут). Для фокусировки светового пучка диода в пятно с диаметром 2 мм использовали собирающую линзу (рисунок 23 а). Для визуализации разницы между живыми и мертвыми клетками их предварительно окрашивали флуорогенными красителями DHR-123 (обеспечивает флуоресценцию зеленого цвета у метаболически активных клеток) и пропидий йодидом (обеспечивает флуоресценцию красного цвета у мертвых клеток), результаты эксперимента оценивали посредством конфокальной лазерной сканирующей электронной микроскопии (рисунок 23 б-г).
Определение фототоксичности нетканых материалов на основе хитозана, содержащих фотосенсибилизатор «Фотосенс», in vitro
Характерный спектр поглощения «Фотосенса» в водном растворе включает небольшой максимум на 608±2 нм и узкий интенсивный пик с максимумом на 676±2 нм. По результатам спектроскопии диффузионного рассеяния для образцов, содержащих фотосенсибилизатор, наблюдается существенное снижение показателя отражения, начиная с длины волны 720 нм, и достигает минимума в районе 680 нм, второй минимум приходится на длину волны 605 нм (рисунок 12 б). При этом глубина минимумов увеличивается с повышением содержания фотосенсибилизатора в формовочных растворах, используемых для получения нетканых материалов. В спектре образца волокон хитозана в отсутствие фотосенсибилизатора таких минимумов не наблюдается. Таким образом, минимумы на спектрах диффузного отражения могут быть ассоциированы с наличием «Фотосенса» в составе волокна.
Средние диаметры волокон нетканых материалов с различным содержанием фотосенсибилизатора, полученные по СЭМ-изображениям; (б) Спектры диффузионного отражения нетканых материалов на основе хитозана с различным содержанием фотосенсибилизатора «Фотосенс»: 1) 0%; 2) 1%; 3) 2.5% и 4) 5% [150]
Хитозан демонстрирует характерный спектр комбинационного рассеяния с несколькими пиками в области между 1000 см-1 и 1200 см-1, которые ассоциированы с колебаниями растяжения C-OH связей (рисунок 13 a). Спектр комбинационного рассеяния «Фотосенса» отличен от спектра хитозана и включает два характерных максимума, расположенных на 764 см-1 и 1348 см-1. Первый пик соответствует колебаниям связей C-N-C и Al-N, второй пик обусловлен совместными колебаниями, включающими изгиб валентных углов между связями C-N-C и N-C-N, растяжением связи C-C во внешних бензольных кольцах, а также растяжением связи Al-N [151]. Относительная равномерность распределения фотосенсибилизатора в нетканом материале была показана методом картирования с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния по интенсивности второго характеристического пика фотосенсибилизатора.
Спектры комбинационного рассеяния порошка «Фотосенса» (синяя линия), нетканого материала на основе хитозана ФС 0% (зеленая линия) и нетканого материала на основе хитозана ФС 5% (красная линия). Фокусировка лазерного луча на образце осуществлялась с помощью 50x объектива микроскопа при длине волны возбуждения 785 нм (0,05 мВт), время накопления сигнала составляло 10 секунд; (б) Результат картирования поверхности нетканого материала на основе хитозана ФС 5% методом спектроскопии комбинационного рассеяния. Относительная интенсивность пика по отношению к фону в области 1312-1360 см-1 показана синим цветом. Изображение получено при мощности лазера 0,3 мВт и длине волны 785 нм в линейном режиме сканирования (30 секунд на линию) [152]
На данном этапе исследования оценивался выход фотосенсибилизатора из нановолокон хитозана в фосфатно-солевом буфере (PBS) со значением рН 7,4 и дистиллированной воде в течение 96 часов при помощи спектрофотометра (U-2800, Shimadzu). Кинетика высвобождения фотосенсибилизатора описана с помощью уравнения Ritger-Peppas (15). Результаты аппроксимации экспериментальных данных представлены в Таблице 4.
Предполагается, что быстрое высвобождение фотосенсибилизатора происходит вследствие набухания полимера. В связи с этим на данном этапе исследования оценивалась степень набухания S нетканого материла на основе хитозана в фосфатно-солевом буфере со значением рН 7,4 и дистиллированной воде. Материал демонстрирует резкое набухание с достижением равновесного состояния в течение первых 60 минут (рисунок 16 в).
Аппроксимации экспериментальных данных по высвобождению фотосенсибилизатора из нетканых материалов на основе хитозана с различным содержанием фотосенсибилизатора «Фотосенс» с помощью уравнения Ritger-Peppas (15): a, б, в – из ФС 5%, ФС 2.5% и ФС 1% в PBS, соответственно; г – из ФС 5% в воде. Таким образом, на первом этапе происходит быстрое высвобождение несвязанного фотосенсибилизатора в процессе набухания волокон хитозана. Последующая стадия соответствует высвобождению «Фотосенса» из полиэлектролитного комплекса с хитозаном. При этом интенсивность высвобождения фотосенсибилизатора в фосфатно-солевом буфере (рН=7,4) значительно выше, чем в дистиллированной воде, что объясняется изменением физико-химических свойств скаффолда при изменении значения pH (рисунок 15 б) [153]. Рисунок 15. (а) - кинетика высвобождения фотосенсибилизатора из нановолокон хитозана с различным содержанием «Фотосенса» в фосфатно-солевом буфере в течение 96 часов (на вставке показаны кривые высвобождения «Фотосенса» в течение первых 3 часов); (б) - спектры поглощения надосадочной жидкости после 96-часового высвобождения «Фотосенса» из нетканого материала ФС 5% в дистиллированной воде и фосфатно-солевом буфере; (в) – степень набухания нетканого материала на основе хитозана ФС 0% в фосфатно-солевом буфере с течением времени [150]
Для получения нетканых материалов на основе хитозана с поверхностью, модифицированной золотыми наночастицами, использовали двухэтапную процедуру [154]. На первом этапе образец нетканого материала размером 1x1 см2 помещали в водный раствор тетрахлороаурата(III) водорода HAuCl4. На этой стадии ионы золота взаимодействуют с карбоксильными группами в структуре хитозана (рисунок 16). На втором этапе происходил синтез частиц за счет восстановление ионов золота при добавлении раствора цитрата натрия. Образцы приобретали темно-красный цвет (вставки на рисунке 17). Изменение поверхности модифицированного нетканого материала видны более отчетливо на СЭМ-изображениях, полученных в режиме отраженных электронов (Рисунок 17). Установлено, что частицы формировались не только на поверхности, но также и внутри волокон. Характерный размер наночастиц составлял порядка 4 нм и 20 нм (рисунок 16 б).