Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 10
1.1. Основные принципы и методы фотодинамической терапии 10
1.1.1. История развития метода фотодинамической терапии, краткая характеристика традиционных фотосенсибилизаторов 10
1.1.2. Физико-химические основы ФДТ 14
1.1.3. Биологические механизмы действия ФДТ 19
1.1.4. Требования к фотосенсибилизаторам и их классификация 21
1.2. Фуллерены и их производные 26
1.2.1. Химико-физические свойства фуллеренов 27
1.2.2. Водорастворимые производные фуллерена 29
1.2.3. Токсичность и биологическая активность фуллерена 31
1.2.4. Фуллерены как потенциальные фотосенсибилизаторы для ФДТ 35
1.3. Гибридные диады фуллерен-краситель в ФДТ 42
1.3.1. Физические принципы создания диад фуллерен-краситель для ФДТ 42
1.3.2. Фотофизические характеристики диад фуллерен-краситель 47
1.3.3. Триады и тетрады на основе фуллеренов и красителей 52
1.3.4. Биологическая активность ковалентных диад фуллерен-краситель 55
ГЛАВА 2. Материалы и методы 63
2.1. Материалы 63
2.1.1. Приборы и аппаратура 65
2.2. МЕТОДЫ 66
2.2.1. Метод оценки фотохимической активности 66
2.2.2. Приготовление суспензии лецитиновых липосом 67
2.2.3. Определение коэффициента распределения октанол-вода 68
2.2.4. Оценка фотодинамического повреждения ДНК 68
2.2.5. Оценка фотодинамической активности на культуре опухолевых клеток 70
2.3. Статистическая обработка результатов 71
ГЛАВА 3. Фотохимические и фотофизические свойства гибридных структур ппф краситель в водном растворе
3.1. Комплекс «ппф+эозин» 72
3.1.1. Фотохимичеcкая активность комплекса «ППФ+эозин» 72
3.1.2. Исследование спектров стационарной флуоресценции и кинетики затухания флуоресценции эозина в присутствии ППФ- 1 76
3.1.3. Исследование спектров поглощения эозина в присутствии ППФ-1 и НСТ 81
3.1.4. Анализ механизмов тушения флуоресценции эозина соединением ППФ-1 в составе комплекса 84
3.1.5. Исследование влияния НСТ, НАДН, ЭДТА на интенсивность флуоресценции эозина Y 87
3.1.6. Влияние ППФ-1 на фотостабильность эозина в составе нековалентного комплекса
3.2. Комплексы «ппф+флуоресцеин» и «ппф+эритрозин» 92
3.3. Комплекс ппф-1 с коммерческим препаратом фотосенс 95
3.4. Гибридные структуры на основе ковалентных конъюгатов производных фуллерена с красителями флуоресцеин и рубоксил 101
ГЛАВА 4. Фотохимическая активность гибридных структур ппф-краситель в структуре липосом 111
4.1. Определение коэффициента распределения октанол-вода для гибридных структур ппф-краситель 111
4.2. Фотохимическая активность нековалентных комплексов «ппф+краситель» в структуре липосом 114
4.3. Изменение спектров поглощения красителей в присутствии ппф-1 в структуре липосом 120
4.4. Исследование спектров стационарной флуоресценции красителей в присутствии ппф-1 в структуре липосом 122
4.5. Анализ механизмов фотохимической активности гибридных систем ппф-краситель в структуре липосом 125
ГЛАВА 5. Фотодинамическое действие конъюгатов ппф(к)-флуоресцеин и ппф рубоксил в биологических модельных системах 131
5.1. Фотодинамическое действие ппф на плазмидную ДНК 131
5.1.1. Фотодинамическое действие диады ППФ-Рубоксил на плазмидную ДНК 133
5.1.2. Фотодинамическое действие диады ППФ(К)-флуоресцеин на плазмидную ДНК 135
5.2. Фотодинамическое действие конъюгата ппф(к)-флуоресцеин на клетки hela 137
Заключение 140
Выводы 144
Литература 145
- История развития метода фотодинамической терапии, краткая характеристика традиционных фотосенсибилизаторов
- Приготовление суспензии лецитиновых липосом
- Исследование спектров стационарной флуоресценции и кинетики затухания флуоресценции эозина в присутствии ППФ-
- Фотохимическая активность нековалентных комплексов «ппф+краситель» в структуре липосом
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время большое внимание уделяется исследованию биологической активности фуллерена С60 и его водорастворимых производных. Особый интерес представляют выраженные прооксидантные свойства фуллерена, обусловленные его способностью с квантовым выходом порядка единицы переходить в возбужденное триплетное состояние при поглощении кванта света. С этой точки зрения перспективно использование фуллеренов в качестве фотосенсибилизаторов (ФС) для фотодинамической терапии (ФДТ).
Однако слабое поглощение исходного С60 в красной области видимого
света, в так называемой области окна проницаемости живых тканей, а также
нерастворимость его в воде делает проблематичным применение нативного С60
для ФДТ. Перспективным путем создания нового типа фотосенсибилизаторов
может быть создание гибридных структур путем присоединения к
водорастворимому производному фуллерена подходящего красителя, хорошо поглощающего в красной области спектра и способного передать возбуждение или электрон на ядро фуллерена.
Выбор потенциальных препаратов для ФДТ в настоящее время ограничен достаточно узкой группой соединений: как правило, это производные порфирина, фталоцианина или хлорина. Данные соединения чрезвычайно гидрофобны и не соответствуют в полной мере современным требованиям, предъявляемым к фотосенсибилизаторам.
Создание водорастворимых диад фуллерен-краситель могло бы существенно расширить спектр красителей, пригодных для применения в ФДТ. Фуллерен в подобной структуре оказывается способным осуществлять перевод энергии возбужденного в триплетное или в синглетное состояние красителя в эффективную генерацию активных радикальных частиц.
Настоящая работа посвящена исследованию фотофизических свойств и
фотодинамического действия гибридных структур фуллерен-краситель на основе
водорастворимых полизамещенных производных фуллерена С60 (ППФ),
синтезированных в ИПХФ РАН.
Цели и задачи работы. Основной целью работы являлось исследование
фотофизических и фотодинамических свойств водорастворимых гибридных
структур фуллерен-краситель для развития научных основ создания
фотосенсибилизаторов нового поколения.
Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:
-
Разработка методов создания комплексов фуллерен-краситель, образованных за счет нековалентных взаимодействий и ковалентных конъюгатов фуллерен-краситель.
-
Исследование процессов дезактивации возбужденных состояний красителя в составе комплекса и ковалентного конъюгата с фуллереном.
-
Исследование фотодинамической активности комплексов и ковалентных конъюгатов фуллерена и красителя в водных растворах и в модельных биологических мембранах при облучении светом в полосе поглощения красителя.
-
Изучение фотодинамического действия структур фуллерен-краситель на биологические модельные системы: на молекулы ДНК и на эукариотические клетки при облучении светом в полосе поглощения красителя.
Научная новизна работы. В работе впервые исследуются фотофизические
свойства и фотодинамическое действие нового уникального класса
водорастворимых производных фуллерена и их гибридных структур с красителями, образованных как за счет нековалентных взаимодействий, так и с помощью образования ковалентной связи. Объединение красителя и фуллерена в одну гибридную структуру вызывает эффективную дезактивацию как триплетных, так и синглетных возбужденных состояний красителей в водных растворах.
Обнаруженный эффект интенсивного тушения именно синглетных возбужденных состояний красителя ядром фуллерена позволяет значительно повысить фотохимическую и фотодинамическую активность диад фуллерен-краситель по сравнению со свободными красителем и фуллереном, даже в случае, если свободный краситель не проявляет фотодинамической активности.
Научно-практическая значимость исследования. Результаты данной работы представляют большой интерес для дальнейших фундаментальных и прикладных исследований фотодинамического действия водорастворимых диад фуллерен-краситель.
Была показана возможность использования синглетно возбуждаемых красителей для применения в фотодинамической терапии, что значительно расширяет круг красителей для создания новых потенциальных препаратов-фотосенсибилизаторов.
Личный вклад автора. Все включенные в диссертацию данные получены
лично автором или при его непосредственном участии. Постановка экспериментов
по определению фотодинамического действия на плазмидной ДНК проводилась
совместно с к.б.н. Файнгольд И.И., экспериментов по определению
фотодинамического действия на клеточной культуре HeLa проводилась совместно с к.б.н. Пархоменко И.И. Планирование исследований, обсуждение и обобщение полученных результатов осуществлялось совместно с руководителем д.ф.-м.н., проф. Котельниковым А. И.
Положения, выносимые на защиту.
-
Разработана концепция создания фотодинамически активных водорастворимых гибридных структур на основе полианионных или поликатионных производных фуллерена и красителей, образованных за счет нековалентных взаимодействий или за счет образования ковалентной связи.
-
Установлено, что в составе водорастворимых гибридных структур на основе фуллерена и красителя происходит эффективная дезактивация не только триплетных, но и синглетных возбужденных состояний красителя за счет переноса электрона или возбуждения на фуллерен, что значительно расширяет возможности поиска новых красителей для создания фотодинамически активных структур.
-
На биологических модельных системах показано значительное усиление фотодинамической активности гибридных структур на основе фуллерена и
синглетно-возбуждаемых красителей по сравнению со свободными фуллереном и красителем, что позволяет рекомендовать подобные структуры для дальнейших исследований в качестве потенциальных фотосенсибилизаторов.
Апробация работы. Результаты проведенных исследований были
представлены в виде устных и стендовых докладов на российских и
международных конференциях: на XII Всероссийской научно-практической
конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые
препараты» (Москва, 2015), на конкурсе молодых ученых ИПХФ РАН им. С.М.
Батурина (г. Черноголовка, 2015), на VI Троицкой конференции «Медицинская
физика и инновации в медицине» (Троицк, 2014), на Всероссийской научно-
практической конференции с международным участием «Противоопухолевая
терапия: от эксперимента к клинике» (Москва, 2014), на Первой Российской
конференции по медицинской химии с международным участием
(MedChem Russia, Москва, 2013), на третьем Международном Симпозиуме имени академика А.Н. Теренина «Молекулярная фотоника» (Репино, Санкт-Петербург, 2012), и на V Троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине» (Троицк, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них 4 статьи в реферируемых журналах, входящих в перечень ВАК, две главы в монографиях и 10 тезисов в сборниках Всероссийских и международных научных конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа содержит 38 рисунков и 10 таблиц. Список литературы включает 270 источников.
История развития метода фотодинамической терапии, краткая характеристика традиционных фотосенсибилизаторов
Высокая избирательность действия ФДТ достигается как за счет способности светочувствительного вещества преимущественно накапливаться в злокачественных клетках, так и за счет локального облучения светом. Терапевтический эффект зависит от концентрации ФС, глубины проникновения светового излучения в ткани опухоли, и, как правило, от концентрации молекулярного кислорода [3, 4].
Первое подробное описание эффекта химической фотосенсибилизации и фотодеструкции живых клеток было опубликовано в 1900 году в Мюнхенском университете, когда Оскар Рааб установил, что низкие концентрации акридинового оранжевого и других красителей, инертных в темноте, приводят к быстрой гибели инфузорий при облучении обычным солнечным светом [5].
Для определения данного феномена научный руководитель Оскара Рааба, профессор Герман фон Таппейнер ввел термин «фотодинамический эффект», который используется и в настоящее время [6]. Впоследствии фон Таппейнер совместно с дерматологом Альбертом Джесионеком использовал фотодинамическое действие красителя эозина для лечения пациентов с раком кожи [7]. В 1960 г. Ричард Липсон с соавторами [8] обнаружил, что инъекции неочищенного препарата гематопорфирина (HP) приводят к флуоресценции неопластических образований, отчетливо наблюдающейся во время операций. Эта смесь была частично очищена до HPD (производного гематопорфирина) [9], который был запатентован в 1974 году под именем «Фотофрин-I» [10].
Первое время HPD использовался только для флуоресцентной диагностики неопластических новообразований. Однако Липсон увидел терапевтический потенциал у данного препарата, и в 1966 году были доложены результаты лечения рака груди с использованием HPD как фотосенсибилизатора [11].
Начало широкого использования производных гематопорфирина в качестве фотосенсибилизаторов для ФДТ в клинической практике началось в 70-х годах с работ Томаса Доугерти с соавторами в Мемориальном институте онкологических исследований Розуэлл-Парк [9]. В работе [12] была показана высокая эффективность метода фотодинамической терапии в онкологии (из 113 злокачественных новообразований в 98 случаях наблюдалось полное и в 13 – частичное излечение, и только двое пациентов оказались резистентными к лечению), что вызвало интерес у исследователей по всему миру и положило начало широкому применению данного метода в клинической практике.
В 1993 году было получено разрешение на использование Фотофрина для лечения больных с ранней и поздней стадией рака легких, пищеварительного тракта и мочеполовой системы в Канаде, Нидерландах, Франции, Германии, Японии и США [13].
Отечественным аналогом Фотофрина является препарат Фотогем, созданный под руководством профессора Андрея Федоровича Миронова в Московской академии тонкой химической технологии имени М. В. Ломоносова. Клинические испытания, начатые в 1992 г., показали его высокую эффективность, и в 1996 году Фотогем был разрешен Министерством здравоохранения РФ для широкого клинического использования [14].
В России активное развитие метода ФДТ и внедрение его в клиническую практику началось с конца 80-х – начале 90-х годов [15]. К настоящему моменту, помимо препарата Фотогем, были созданы и прошли клинические испытания другие отечественные препараты — Фотосенс, Аласенс, Фотодитазин и Радахлорин [1].
Активно развивается не только синтез новых ФС, но и предлагаются принципиально новые подходы в ФДТ. Так, наряду с введением в организм экзогенных ФС, в 1990 году Джеймс Кеннеди с коллегами предложил элегантный метод использования эндогенных порфиринов для ФДТ [16]. Повышенное образование порфирина в организме достигается путем введения в организм 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК), которая является природным прекурсором протопорфирина IX (ПП-IX).
Также существуют попытки улучшить имеющиеся ФС путем присоединения к ним новых функциональных групп. Например, в работе [17] предлагается доставлять в опухолевые клетки неактивный комплекс ФС 13 (белковый линкер)-тушитель; его активация происходит только после разрыва линкера в результате взаимодействия с онкомаркерами внутри клетки. В другой работе описано использование магнитных наночастиц с присоединенным ФС, что позволяет значительно повысить избирательность его накопления в опухолевой ткани за счет воздействия внешнего высоко неоднородного магнитного поля [18].
Сегодня фотодинамическая терапия представляет собой самостоятельное и активно развивающееся направление в онкологии. В медицинской практике наиболее широко применяются препараты на основе порфирина и производных хлорина: Фотофрин — в США и Канаде, Фотосан — в ФРГ, HPD — в Китае, Фотогем, Фотодитазин и Радахлорин — в России [19, 20], также идет активный поиск новых фотосенсибилизаторов.
В последние десятилетия фотодинамическая терапия стала применяться не только для лечения злокачественных новообразований.
Устойчивость патогенных возбудителей к традиционным антибиотикам стимулировала развитие антимикробной фотодинамической терапии (АФДТ).
Одной из первых в этой области была опубликована работа Малик с соавторами [21], где сообщалось о бактерицидном действии ФДТ на S. aureus, Streptococcus pyigenes, Clostridium perfingens, E. coli, Micoplasma hominis, грамотрицательные бактерии и дрожжевые грибки. Помимо антибактериального действия, показана возможность фотоинактивации оболочечных вирусов, в том числе ВИЧ [22], используя метиленовый синий в качестве ФС.
Интерес к АФДТ главным образом обусловлен тем, что данный метод, в отличие от традиционных антибиотиков, не приводит к образованию резистентности у микроорганизмов и для него требуются значительно меньшие дозы препарата, что снижает нагрузку на здоровые ткани организма [21].
Приготовление суспензии лецитиновых липосом
В настоящее время опубликовано лишь небольшое количество работ, посвященных применению диад фуллерен-краситель в ФДТ, в отличие от многочисленных работ по применению диад подобного типа в фотовольтаике и фотокатализе. Как правило, это связано с их нерастворимостью в воде, что затрудняет проведение биологических исследований. Однако с активным развитием химии фуллеренов были найдены различные пути перевода диад в водную фазу, что отражается в постепенном увеличении числа работ в данной области.
Механизм фотодинамического пути генерации активных форм кислорода для водорастворимых диад С60-краситель, по-видимому, как и для производных С60, не имеющих в своем составе красителя, зависит от полярности растворителя.
Так, для водорастворимой диады С60-фениллизин показана выраженная способность повреждать молекулу ДНК, которая не изменяется при добавлении тушителей 1О2, но ингибируется супероксиддисмутазой, что говорит о фотодинамическом действии данной диады по механизму I типа [107]. Для водорастворимой диады С60-порфирин ингибиторы 1О2 и O2- не влияли на способность диады фотодинамически повреждать цепь ДНК, в отличие от ДМСО, значительно снижающего время жизни ОН [215].
В то же время для растворимой в неполярных растворителях диады С60-периленбисимид показана ее высокая способность генерировать 1О2, превышающая таковую для немодифицированного С60 в три раза при одинаковых концентрациях С60 и диады [203].
В работе [200] синтезировали диаду С60-акридин (растворимую в 1%-ном водном растворе ПВП) и исследовали ее способность повреждать молекулу ДНК (плазмиду pBR322). Эксперимент показал, что фотодинамический эффект диады С60-акридин значительно превышает эффект исходного С60. Авторы работы предполагают, что повышенная фотодинамическая активность диады С60-акридин может возникать вследствие интеркаляции акридина в ДНК, благодаря чему осуществляется локализация С60 и генерация активных форм кислорода в непосредственной близости от цепи ДНК. При этом в работе [200] не обсуждается вопрос заселения возбужденного триплетного состояния фуллерена за счет переноса энергии возбуждения с синглетного ( S1) уровня акридина на фуллерен
Данный вопрос также не рассматривается в другой работе [216], в которой был создан ряд диад фуллерен-триазин, где производные триазина использовались как интеркаляторы для усиления фотодинамического действия фуллерена на молекулу ДНК. При этом было обнаружено, что свободные производные триазина способны вызывать повреждения ДНК при облучении светом видимого диапазона спектра, в то время как диадам фуллерен-триазин для получения такого же эффекта требовалась концентрация на два порядка меньше в тех же условиях. Причиной наблюдаемого усиления фотодинамического действия авторы также считают локализацию фуллеренового ядра диад в районе двойной цепи ДНК за счет интеркаляции, при этом они не приводят спектры поглощения и флуоресценции диад и не обсуждают другие возможные механизмы наблюдаемого усиления фотодинамического действия диад.
В работе [217] было показано усиление фотодинамической активности немодифицированного фуллерена при встраивании фуллерена совместно с красителем DiD (1,10-диоктадецил-3,3,30,30-тетраметилиндодикарбоцианин) в мембраны липосом. Данный эффект усиления был показан как на модельных системах по генерации 1О2, так и на культуре клеток HeLa.
Как полагают авторы, данное усиление происходит за счет переноса возбуждения или электрона с красителя DiD, хорошо поглощающего свет в красной области спектра, на фуллерен. Предположительно, С60 и краситель DiD образуют комплексы в липидном бислое липосом за счет нековалентных взаимодействий. При этом достаточно слабое тушение интенсивности флуоресценции красителя DiD в присутствии С60 (всего на 40% относительно свободного красителя) говорит о небольшой эффективности данного переноса в условиях эксперимента. Однако, несмотря на слабое тушение флуоресценции, для данных липосом с С60 и DiD наблюдается значительное усиление фотодинамической активности, наблюдаемое по генерации 1О2. По отсутствию наблюдаемого образования O2- и по влиянию избирательных антиоксидантов на 1О2 и O2- авторы заключают, что в липосомах, несущих одновременно краситель DiD и С60, фотодинамическая реакция протекает преимущественно по II типу.
Также было показано, что липосомы, несущие DiD и С60, обладают выраженной фототоксической активностью на клетках HeLa при облучении красным светом (610-740 нм), в то время как в темноте данные липосомы не токсичны.
В серии работ по применению диад С60-порфирин в ФДТ [218, 219] была исследована фотодинамическая активность диады порфирина с ковалентно присоединенным С60 и диады порфирин(Zn)-С60. Так как данные структуры нерастворимы в воде, их лиофилизировали и исследовали фотофизические свойства и действие на культуру клеток Hep-2 (карцинома легких). Как утверждают авторы, эти исследования представляют первую оценку диад с точки зрения их способности формировать фотоиндуцированное состояние с разделением заряда и действовать как агенты в ФДТ.
Спектроскопические исследования методами поглощения и флуоресценции в толуоле и N,N-диметилформамиде (ДМФ) показали, что эмиссия порфиринового фрагмента в диаде сильно потушена (на 70-90% по сравнению со свободным порфирином) за счет присоединения к фуллерену. С помощью 9,l0-диметилантрацена (ДМА) обнаружена генерация 1О2. Эффективность генерации сильно зависит от полярности растворителя, и уменьшается при переходе от толуола к ДМФ. В более полярных растворителях имеет место стабилизация состояния с переносом заряда, при которой снижается эффективность образования триплетного состояния порфирина. Обнаружено, что обе диады фотосенсибилизируют распад L-триптофана в ДМФ.
Показано отсутствие темновой токсичности данных диад, в то время как они обладают выраженной фототоксичностью, как в присутствии молекулярного кислорода, так и в атмосфере аргона. Авторами отмечена зависимость типа фотодинамической активности от полярности среды, при этом в воде происходит преимущественное образование O2-. Учитывая, что исходный порфирин не обладает фототоксичностью в атмосфере аргона в отличие от диад, следует заключить, что для исследуемых диад возможен кислородонезависимый тип фототоксичности (III тип), предположительно за счет образования долгоживущего возбужденного состояния с разделенными зарядами. Кроме того, в присутствии кислорода фотодинамическое действие диад вызывало преимущественно апоптоз, в то время как в атмосфере аргона – некроз. Как отмечают авторы, полученные результаты показывают, что молекулярные диады, которые могут формировать фотоиндуцированное состояние с переносом заряда, являются перспективными моделями для ФС, как для потенциального применения как в ФДТ опухолей, так и в антимикробной ФДТ.
В работе [220] исследовалось действие двух диад фуллерен-порфирин в качестве агентов антимикробной ФДТ. Данные диады нерастворимы в воде, но растворимы в диметилформамиде (ДМФ); в них обнаружено сильное тушение флуоресценции порфирина. Показана способность данных диад генерировать 1О2 в толуоле и ДМФ, отмечено значительное влияние полярности растворителя на квантовый выход 1О2. Исследование фотодинамического действия данных диад обнаружило их высокую эффективность как на грамположительных бактериях S. aureus, так и на грамотрицательных E. coli, что показывает перспективность применения подобных структур в АФДТ.
Исследование спектров стационарной флуоресценции и кинетики затухания флуоресценции эозина в присутствии ППФ-
Так как соединение ППФ-2 качественно не отличается от соединения ППФ-1, то можно ожидать, что ППФ-2 будет образовывать нековалентные комплексы «ППФ+флуоресцеин» аналогично структурам, рассмотренным в главе 3.2.
Анализ фотохимической активности диады ППФ(К)-флуоресцеин в растворе бидистиллята показал, что интенсивность фотохимической реакции ППФ(К)-флуоресцеин с НСТ превышает фотохимическую активность индивидуальных ППФ-2 и флуоресцеина в 28 и 9.4 раза, соответственно (рис. 30, А). Это указывает на эффективный перенос возбуждения от флуоресцеина на ядро фуллерена, в пользу чего свидетельствуют приведенные выше данные по изменению спектров поглощения и по тушению флуоресценции.
Напротив, фотохимическая активность конъюгата ППФ(А) флуоресцеин превышает суммарную фотохимической активность исходных ППФ-3 и флуоресцеина всего в 1.5 раза, что указывает на слабое взаимодействие фуллернового ядра с красителем в данной диаде (рис. 30, Б). Наблюдаемый эффект хорошо согласуется с приведенными выше данными по изменению спектров поглощения и флуоресценции красителя в структуре данной диады.
Для сравнения измерялась фотохимическая активность эквимолярной смеси ППФ-3 и флуоресцеина, она была практически равна суммарной активности исходных ППФ-3 и флуоресцеина. Это говорит об отсутствии образования комплексов за счет нековалентных взаимодействий между ППФ-3 и флуоресцеином в растворе, вероятнее всего, из-за одноименно заряженных полярных групп, которые данные соединения несут в растворе (рис. 30, Б).
Анализ фотохимической реакции конъюгата ППФ-Рубоксил в растворе бидистиллята показал, что фотодинамический эффект данного конъюгата в реакции с НСТ в водном растворе превышает фотодинамический эффект индивидуального ППФ-4 в более чем в 4 раза, причем исходный Рубоксил не проявляет фотохимической активности (рис. 30, В). В контрольном эксперименте была исследована фотохимическая активность эквимолярной смеси ППФ-4 + Рубоксил. Было обнаружено значительное увеличение фотохимической активности эквимолярной смеси ППФ-4 и Рубоксила по сравнению с активностью индивидуальных соединений. Так как Рубоксил, как и родственный ему доксорубицин, имеет положительный заряд при нейтральных pH [248], наблюдаемый эффект может быть обусловлен образованием нековалентного комплекса «ППФ+Рубоксил» в полярных растворах за счет электростатического взаимодействия. Следует отметить, что конъюгаты ППФ(А)-флуоресцеин и ППФ Рубоксил показали хорошую растворимость в воде, вплоть до концентраций порядка 10-2 М. В отличие от этих соединений, конъюгат ППФ(К) флуоресцеин имел заметно меньшую растворимость: для растворения в воде сухую навеску данного соединения необходимо было сначала растворить в этаноле с последующим разбавлением бидистиллятом. Обобщая приведенные выше данные, можно предположить, что в растворе конъюгат ППФ(К)-флуоресцеин принимает сложенную конформацию, в которой дианион флуоресцеина контактирует с катионными аддендами ППФ и компенсирует часть их заряда, что снижает растворимость данного конъюгата в бидистилляте.
Напротив, для конъюгата ППФ(А)-флуоресцеин можно
предположить, что при наличии отрицательных зарядов на аддендах фуллерена и на красителе в силу их электростатического отталкивания они будут разнесены на максимально возможное расстояние и конформация данной диады в растворе будет значительно отличается от свернутой конформации соединения ППФ(К)-флуоресцеин.
Более близкое расположение флуоресцеина к аддендам, а значит, и к ядру фуллерена в диаде ППФ(К)-флуоресцеин значительно облегчает перенос электрона или возбуждения с красителя на фуллерен. Этим фактором мы объясняем как сильное тушение флуоресценции в диаде ППФ(К)-флуоресцеин, так и более эффективное протекание фотохимической реакции.
Наблюдаемое различие в водорастворимости диад из-за разного количества заряженных аддендов достаточно характерно и для других производных фуллерена. Согласно эмпирическому правилу, для подобных полизамещенных производных фуллерена требуется наличие не менее четырех ионогенных групп для получения высокой растворимости в воде [106].
В дальнейшем мы не исследовали фотохимическую активность диады ППФ(А)-флуоресцеин в модельной системе липосом, а также фотодинамическое действие этой диады на молекулу ДНК и клеточные культуры по причине ее слабой фотохимической активности, показанной в бидистилляте (рис. 30, Б). По нашему мнению, данная диада не представляет интереса для дальнейшего исследования в качестве потенциального препарата для ФДТ, но она могла бы найти применение во флуоресцентной диагностике или при оценке распределения ППФ в организме, так как она обладает выраженной флуоресценцией (рис. 28).
Таким образом, наличие разноименно заряженных групп на производном фуллерена и красителе значительно влияет на эффективность дезактивационных процессов не только в нековалентных комплексах «ППФ+краситель», но и в ковалентных конъюгатах ППФ-краситель. Причем, в случае ковалентных диад количество полярных групп является решающим фактором, определяющим как ее структуру и фотодинамическую активность, так и растворимость в воде.
Следует заключить, что при создании водорастворимых фотохимически активных ковалентных диад ППФ-краситель для ФДТ необходимо учитывать конформацию диады в растворе, которая в значительной мере влияет как на эффективность дезактивации возбужденных состояний красителя в диаде, так и на растворимость всего соединения в воде.
В описанных в настоящей главе исследованиях показано, что в результате объединения в одной гибридной структуре красителя и фуллерена за счет нековалентных типов взаимодействий или за счет ковалентной связи значительно повышается фотодинамическая активность красителя. Обычно считается, что способность красителей генерировать активные формы кислорода обусловлена переносом возбуждения или электрона с триплетных уровней данных красителей. В наших исследованиях методами стационарной и кинетической флуориметрии показано, что в структуре данных комплексов происходит эффективная дезактивация синглетных возбужденных состояний красителя за счет переноса возбуждения или электрона с красителя на фуллерен. Далее фуллерены практически со 100% вероятностью могут конвертировать это возбуждение в генерацию активных радикалов. Это открывает возможность создания на основе фуллеренов эффективных фотодинамических препаратов нового поколения с использованием красителей, возбуждаемых как в триплетное, так и в синглетное состояние, что значительно расширяет возможности выбора красителей.
Создание подобных гибридных структур на основе фуллеренов и красителей, поглощающих в красной области спектра, может оказаться перспективным в плане создания новых эффективных фотосенсибилизаторов для применения в медицине.
Фотохимическая активность нековалентных комплексов «ппф+краситель» в структуре липосом
Как показано методом динамического светорассеяния, ППФ склонны образовывать ассоциаты в водных растворах в силу их выраженных амфипатических свойств [255]. Способность ППФ образовывать ассоциаты в водных растворах также подтверждает эффект нелинейного усиления эффективности тушения стационарной флуоресценции при повышении концентрации тушителя (рис. 14 для красителя эозина). Как было продемонстрировано в главе 3 настоящей работы, при повышении концентрации ППФ образуют ассоциаты, которые эффективнее взаимодействуют с молекулами противоположно заряженного красителя, чем отдельные молекулы ППФ.
При введении в мембраны ассоциатов С60 на отдельные молекулы может происходить разрушение таких ассоциатов на отдельные молекулы, как для производных фуллерена, так и для нативного С60, что подтверждено расчетными [125] и фотофизическими методами [126].
Разрушение ассоциатов на отдельные молекулы ППФ при встраивании ППФ в липидный бислой мембран может снижать как эффективность образования нековалентных комплексов «ППФ+краситель», так и общую эффективность протекания фотохимической реакции в данных комплексах.
При переходе ассоциатов ППФ в мембрану липосом, по нашим представлениям, молекулы ППФ не будут образовывать плотные монослои (или кластеры) на поверхности липосом. Учитывая большую разницу (в 250 раз) концентраций фосфатидилхолина (5-Ю"4 М) и ППФ (2-Ю"6 М) в условиях фотохимического эксперимента, отдельные молекулы ППФ могут находиться достаточно далеко друг от друга. При условии того, что 100% молекул ППФ перешли из водного раствора в мембрану липосом, среднее расстояние между ними во внешнем монослое липосом составит более 15 нм.
Одним из доказательств разрушения ассоциатов ППФ в структуре мембран липосом может служить изменение характера зависимости тушения флуоресценции в координатах Штерна-Фольмера с квадратичного для бидистиллята на линейный для липосом, как было показано для нековалентных комплексов «ППФ+эозин» (рис. 33, Б: кривые 1 и 3) и «ППФ+Фотосенс» (рис. 33, Г: кривые 1 и 3).
На эффективность образования нековалентных комплексов «ППФ-краситель» в структуре липосом также может негативно сказаться ионная сила среды в районе полярных головок липидов мембран, которая должна влиять на прочность образования нековалентных комплексов «ППФ-краситель» за счет электростатических взаимодействий. Можно ожидать, что плотно упакованные полярные головки фосфолипидов в мембране липосом создают эффект, аналогичный концентрированному буферному раствору, что позволяет прогнозировать значительное снижение эффективности образования нековалентного комплекса «ППФ+краситель» в мембранах липосом в результате электростатических взаимодействий.
Прямое свидетельство негативного влияния ионной силы раствора на стабильность нековалентных комплексов «ППФ+краситель» было наглядно продемонстрировано для систем «ППФ+эозин» (рис. 33, Б: кривая 2) и
Снижения эффективности образования нековалентных комплексов «ППФ+краситель» для систем «ППФ-эозин» и «ППФ-Фотосенс» в структуре липосом показано как методами абсорбционной спектроскопии (рис. 32), так и методами стационарной флуоресцентной спектроскопии (рис. 33 и таблица 10).
Данные эффекты – распад ассоциатов ППФ и снижение прочности образования комплексов «ППФ+краситель» в структуре мембран должны отрицательно сказаться на эффективности протекания фотохимической реакции для нековалентного комплекса «ППФ+краситель», но не должны отразиться на эффективности протекания фотохимической реакции для отдельных молекул красителя.
При сопоставлении реакции образования супероксид анион-радикала в результате фотохимической реакции на поверхности мембраны и в объемной фазе воды важным является вопрос о локальной концентрации молекулярного кислорода в бидистилляте и в модельной системе липосом.
Известно, что молекулярный кислород значительно хуже растворим в полярных средах, чем в неполярных. Для мембран лецитиновых липосом концентрации кислорода в водной фазе примерно в 10 раз меньше, чем в области гидрофобных хвостов липидов мембран [259, 260]. Кроме того, в неполярных средах фуллерены при возбуждении светом образуют преимущественно синглетный кислород [100], который не детектируется красителем НСТ, что может значительно снизить наблюдаемую эффективность фотохимической реакции в модельной системе липосом, как для отдельных молекул ППФ, так и для нековалентного комплекса «ППФ+эозин».
При встраивании ППФ и красителя в мембраны липосом, помимо вышеперечисленных факторов, меняется и вязкость микроокружения встроившихся в мембраны красителя и ППФ. Вязкость липидного бислоя данных мембран превышает вязкость свободной воды примерно в 100 раз [261], что должно отрицательно сказываться на эффективности протекания фотодинамических реакций с участием ППФ, если они контролируются диффузионными процессами.
Как можно увидеть из рис. 31 и таблицы 9, в структуре липосом действительно происходит усиление фотохимической активности для всех исследуемых свободных красителей (эозина, Фотосенса, флуоресцеина) в 1.2-4 раза по сравнению с их фотохимической активностью в бидистилляте.
В то же время для всех исследуемых нековалентных комплексов «ППФ+краситель» эффективность протекания фотохимической реакции в липосомах значительно снижается: величина индекса синергизма падает в 3-5.4 раза (таблица 9), и их фотохимическая активность незначительно превышает суммарную фотохимическую активность свободных ППФ и красителя (рис. 31). Приведенные данные, как мы полагаем, говорят о практически полном разрушении нековалентных комплексов «ППФ+краситель» в структуре липосом.
В то же время фотохимическая активность диад ППФ(К)-флуоресцеин и ППФ-Рубоксил значительно превышает суммарную фотохимическую активность свободных ППФ и красителей в структуре липосом (рис. 31 и таблица 9) благодаря наличию прочной ковалентной связи между ядром фуллерена и красителем.
Таким образом, на примере модельной системы из лецитиновых липосом показано значительное влияние липидного бислоя мембран на стабильность, и, в результате, на фотохимическую активность нековалентных комплексов «ППФ+краситель», что может осложнить возможность использования подобных нековалентных комплексов в реальных многокомпонентных биологических системах в качестве потенциальных фотосенсибилизаторов.
В отличие от нековалентных комплексов, фотохимическая активность конъюгатов не снижается при введении их в структуру липосом. Это позволяет ожидать, что при дальнейшем исследовании на биологических объектах фотодинамическая активность ковалентных конъюгатов будет превышать суммарную фотодинамическую активность свободного красителя и ППФ.