Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Общее описание вируса гриппа 11
1.2. Структура вируса гриппа А 12
1.3. Жизненный цикл вируса гриппа А и роль в нем матриксного белка М1 15
1.4. Структура матриксного белка М1 вируса гриппа А 19
1.5. Взаимодействие матриксного белка М1 вируса гриппа А с липидным бислоем 24
1.6. Плазматическая мембрана 30
1.7. Плоские модельные системы биологических мембран 33
1.8. Адсорбция белков 35
1.8.1. Влияние природы белков на их адсорбцию 36
1.8.2. Влияние водного окружения на адсорбцию белков 39
1.8.3. Влияние свойств поверхности на адсорбцию белков. 41
Глава 2. Материалы и методы 44
2.1. Коммерческие реактивы 44
2.2. Выделение матриксного белка М1 из вирионов и его очистка 44
2.3. Идентификация белка М1 45
2.4. Спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса 46
2.4.1. Поверхностный плазмонный резонанс 46
2.4.2. Особенности измерений на ППР-спектрометре «Biosuplar 6» (Mivitec). 50
2.4.3. ППР-спектрометр Biacore T200 (GE Healthcare) 53
2.4.4. Оценка поверхностной концентрации белка 54
2.5. Формирование самособирающихся слоев 56
2.5.1. Создание монослоев тиолов на поверхности ППР-чипов. 56
2.5.2. Создание липидных бислоев на поверхности L1 - чипа (Biacore) 57
2.5.2.1. Приготовление суспензии липосом. 57
2.5.2.2. Иммобилизация липосом на поверхности сенсорного чипа 59
2.5.2.3. Регенерация поверхности чипа. 60
Глава 3. Результаты и обсуждения 61
3.1. Взаимодействие матриксного белка М1 с гидрофильными чипами 61
3.1.1. Влияние рН на формирование слоя белка М1 61
3.1.2 Дезорганизация слоя белка М1 при уменьшении рН среды. 73
3.2. Взаимодействие матриксного белка М1 с гидрофобными чипами 76
3.3. Взаимодействие матриксного белка М1 с липидным бислоем, состоящим из ДФФХ и ДФФС 79
3.3.1. Создание липидных бислоев на гидрофильной полимерной подложке 79
3.3.2. Оценка поверхностной плотности заряда липидной мембраны, состоящей из ДФФХ и ДФФС в различных мольных соотношениях. 83
3.3.3. Формирование слоя белка М1 на липидном бислое при рН 4,7. 87
3.3.4. Формирование слоя белка М1 на липидном бислое при рН 7,0. 91
3.3.4.1. Влияние концентрации белка М1 на формирование слоя при рН 7,0 91
3.3.4.2. Влияние состава липидного бислоя на формирование слоя белка М1 при рН 7,0 . 94
3.3.5. Определение констант связывания белка М1 с липидными бислоями при рН 4,7 и рН 7,0 98
3.3.6. Определение эффективной константы М1-М1 взаимодействия 103
3.3.7. рН-индуцированное разрушение слоя матриксного белка М1 105
Заключение 109
Выводы 114
Благодарности 115
Список используемых сокращений 116
Список литературы 117
- Структура матриксного белка М1 вируса гриппа А
- Поверхностный плазмонный резонанс
- Влияние рН на формирование слоя белка М1
- Влияние состава липидного бислоя на формирование слоя белка М1 при рН 7,0
Введение к работе
Актуальность и степень разработанности темы исследования
Матриксный белок М1 вируса гриппа А (далее белок М1) играет огромную роль в
его жизненном цикле, обеспечивая механическую прочность вириона, выход
генетического материала в цитоплазму клетки, сборку и отпочковывание дочерних
вирусных частиц. В нейтральной среде белок М1 формирует каркас вирусной частицы,
связываясь с ее внешней липидной оболочкой и находящимся внутри
рибонуклеопротеином (РНП), а в кислой среде, напротив, происходит частичная дезорганизация матриксного каркаса и разрушение связей с РНП, позволяющая генетическому материалу вируса выйти в цитоплазму клетки. Матриксный белок М1, в отличие от трансмембранных белков вируса гриппа А, обладает консервативностью среди различных штаммов [1,2]. Эта важная особенность белка М1 может быть использована для создания универсальных противовирусных средств, направленных на блокировку формирования или разрушения матриксного каркаса. Для решения таких задач необходимо понимание механизмов взаимодействия молекул М1 друг с другом и вирусной мембраной при физиологических значениях рН.
Матриксный белок М1 образован тремя доменами: N (2 - 67 а.о.), М (91-158 а.о.), и С (165 - 252 а.о.). На данный момент не удалось получить кристаллическую структуру полноразмерной молекулы. Кристаллические структуры N-концевой части белка, согласно литературным данным, при рН 4,0 и pH 7,0 практически не отличаются [3,4]. Структура нативного полноразмерного белка М1 в растворе определена только при рН 4,7 [5]. Согласно полученным результатам, он представляет собой мономер с выраженной структурной анизотропией: компактный NM-фрагмент диаметром 4 нм и вытянутый слабо упорядоченный С-концевой домен длиной от 2 до 9 нм (наиболее представленная длина составляла 6-7 нм).
Взаимодействие матриксного белка М1 с липидным бислоем и влияние на него рН среды играют большую роль при инфицировании клетки вирусом. Считается, что белок М1 является ключевым при баддинге и полимеризуется на поверхности липидной мембраны, способствуя ее выпячиванию во внеклеточное пространство, однако была показана возможность осуществления таких процессов и без участия белка М1 за счет других вирусных белков. При исследовании влияния кислотности среды на белок-липидную оболочку вируса гриппа была обнаружена частичная дезинтеграция матриксного каркаса при понижении рН.
Амфмипатичная природа белка обуславливает возможность реализации различных механизмов взаимодействия с липидным бислоем. В ранних работах в основном делался вывод о встраивании белка М1 в липидный бислой и потенциальной важности для этого предварительных электростатических взаимодействий. Однако в более поздних
исследованиях вывод о существенном встраивании белка М1 не удалось подтвердить. Методами атомной силовой микроскопии in-vitro изучали структуру сформированного белкового слоя в различных модельных системах, однако из-за различий в условиях проведения экспериментов и подходов к трактованию результатов эти работы не позволили получить однозначное представление о структуре сформированного слоя белка М1 и обратимости его адсорбции.
Исследование кинетики взаимодействия белка М1 с липидным бислоем важно для понимания как процессов формирования белкового слоя, так и происходящих при этом белок-липидных и межбелковых взаимодействий и, более того, для определения влияния большого многообразия внешних факторов. Попытки проведения таких исследований были представлены всего в нескольких работах. В основном, все они были выполнены в лаборатории биоэлектрохимии ИФХЭ им. А.Н. Фрумкина РАН. При этом использовались методы компенсации внутримембранного поля (КВП) и спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса (ППР). На основании полученных результатов делался вывод о важности электростатических взаимодействий при адсорбции белка М1 в нейтральной и кислой средах, однако кинетика и полученные величины адсорбции значительно различались.
Таким образом, на данный момент нет единого мнения о механизме самоорганизации белка М1 в вирусной оболочке, взаимодействии его с липидной мембраной и влиянии на них рН. До сих пор не определены кинетические параметры межбелкового и белок-липидного взаимодействий. Состав липидной мембраны, концентрация белка и его склонность к олигомеризации в нейтральной среде могут существенно влиять на все эти процессы, что требует комплексного подхода для их исследования.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы было исследовать кинетические закономерности формирования матриксным вирусным белком М1 слоя, ассоциированного с липидной мембраной, охарактеризовать его структуру и определить влияние на них природы поверхности и внешних факторов, в первую очередь кислотности среды, являющейся триггером распада белкового каркаса вируса гриппа.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Создать различные системы, моделирующие липидную оболочку вируса гриппа с различной степенью детализации.
-
Методом спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса определить влияние природы поверхности, концентрации белка и рН среды на кинетику формирования слоя матриксного белка М1 и его характеристики.
-
Изучить процесс рН-индуцированной дезинтеграции слоя белка М1.
Научная новизна полученных результатов
С помощью спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса детально исследовано влияние рН среды на кинетику формирования слоя матриксного белка М1 вируса гриппа А на подложках, моделирующих вирусную липидную мембрану.
Впервые показано, что для матриксного вирусного белка М1 характерной чертой является значительное усиление с течением времени его аттракционных взаимодействий с различными модельными системами, приводящее к фактически необратимой адсорбции.
Обнаружено, что наличие отрицательно заряженных липидов в бислое способствует проявлению анизотропных свойств белка М1 в нейтральной среде, приводящих к формированию обратимых полислойных структур.
Впервые при рН 7,0 показана обратимость взаимодействия молекулы матриксного белка М1 вируса гриппа А друг с другом и определена соответствующая эффективная константа связывания.
Впервые определены кинетические константы взаимодействия матриксного белка М1 вируса гриппа А с липидными бислоями различного состава, при рН 7,0 и рН 4,7. Показано, что, несмотря на разрушение белкового каркаса вируса гриппа А при рН < 5,5, матриксный белок М1 при рН 4,7 связывается с липидными бислоями сильнее, чем при рН 7,0.
Исследована кинетика рН-индуцированного разрушения слоя матриксного белка М1 вируса гриппа А на липидных бислоях. На основании полученных результатов, сделан вывод, что различная структура белкового слоя, сформированного в кислой и нейтральной средах определяет его дезинтеграцию при понижении рН, подобную наблюдаемой в ходе вирусного инфицирования. Показано, что существенную роль в этом процессе играет усиление взаимного электростатического отталкивания молекул белка.
Теоретическая и практическая значимость результатов
Проведенные исследования кинетики взаимодействия матриксного белка М1 вируса гриппа А с подложками, моделирующими липидную мембрану, позволили получить новую информацию о влиянии рН среды и природы поверхности на свойства белка, на структуру, формируемого им слоя.
Практическая значимость состоит в возможности использования полученных сведений о взаимодействии молекул матриксного белка М1 вируса гриппа А друг с другом и с липидными бислоями при разработке универсальных препаратов, направленных на блокировку формирования и/или разрушения матриксного каркаса вируса гриппа А. Подходы, реализованные в данной работе, могут быть использованы и в других биофизических исследованиях, связанных с детальным изучением свойств белков и их взаимодействий с различными объектами.
Методология и методы исследования
Методология исследования основывается на системном, исследовательском и экспериментальном подходах. В качестве основного метода исследования использовался современный высокопроизводительный и высокоточный метод спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса, широко применяемый при изучении межмолекулярных взаимодействий.
Научные результаты и положения, выносимые на защиту
-
Обнаружено, что с течением времени связывание матриксного белка М1 вируса гриппа А с широким кругом подложек усиливается, приводя к фактически необратимой адсорбции.
-
Впервые показано, что при рН 7,0 на бислое, содержащем отрицательно заряженные липиды, адсорбированный белок М1 проявляет анизотропные свойства, способствуя формированию его обратимых полислойных структур.
-
Установлено, что с ростом кислотности среды изменение конформации белка М1 при адсорбции усиливается одновременно с усилением связывания с подложкой.
Степень достоверности результатов работы
Достоверность полученных результатов определяется применением современных методик сбора и статистической обработки исходной информации; применением современного высокотехнологичного и высокоточного оборудования для исследования межмолекулярных взаимодействий, соответствующих поставленной цели и задачам; достаточным и репрезентативным объёмом выборок исследования; взаимной согласованностью полученных результатов, а также их соответствием текущему представлению об объекте исследования.
Апробация работы
По материалам диссертации опубликовано 3 статьи из списка ВАК, 10 тезисов докладов на международных научных конференциях и 7 тезисов докладов на отечественных научных конференциях.
Основные результаты исследований, вошедшие в диссертационную работу, были представлены на следующих международных и отечественных научных конференциях: 9-ом и 10-ом Международном Фрумкинском симпозиуме (г. Москва) в 2010 г. и 2016г., «XXI International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics» (Краков, Польша) в 2011 г.; XI Международная молодежная конференция ИБХФ РАН-вузы «Биохимическая физика» (г. Москва) в 2011 г.; III Международной конференции «Супрамолекулярные системы на поверхности раздела» (г. Туапсе, Россия) в 2013 г.; международной междисциплинарной конференции «Биологически активные вещества и материалы: фундаментальные и прикладные аспекты получения и применения» (г. Новый свет) в 2013 г., «6th International conference NANOCON 2014» (Брно, чешская республика) в 2014 г.; 54, 55 и 57-ой международной научной конференции МФТИ» (г. Долгопрудный,
Россия) в 2011, 2012 и 2014 гг.; конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов ИФХЭ РАН в 2010, 2011, 2012, 2014 гг. (г. Москва); конференции «Молекулярная и клеточная биология: прикладные аспекты» (г. Москва) в 2012 г., II Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теории адсорбции, пористости и адсорбционной селективности» (Москва-Клязьма) в 2015 г., XXII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик) в 2015 г. Тезисы представленных докладов опубликованы в сборниках докладов и тезисов указанных конференций.
Личный вклад автора
Все представленные в диссертации результаты получены лично автором, при этом постановка большинства задач была выполнена научным руководителем.
Структура матриксного белка М1 вируса гриппа А
Матриксный белок М1 представляет собой молекулу массой 27.8 кДа (252 аминокислотных остатка, а.о.), состоящую из трех доменов: N (2-67 а.о.), М (91-158 а.о.), и С (165-252 а.о.) [9,10]. Полученное экспериментально в случае более чем 10 штаммов вируса гриппа значение изоэлектрической точки матриксного белка составляет примерно 8.6 [11]. Оно близко к величине, рассчитанной из первичной аминокислотной последовательности, pI = 9.86 [82]. Однако в работе [83] с помощью изоэлектрофокусирования в градиенте рН был сделан вывод, что предположительно нативный белок М1, изолированный из вирусных частиц по методу кислотной солюбилизации [84], имеет изоэлектрическую точку pI=5,0. В данном случае отсутствовала денатурирующая обработка белка (использовался неионный детергент NP-40) и, как предполагают авторы работы, возможно, М1-белок ренатурировал в водном растворе, приобретая нативную конформацию. В этой работе авторы не смогли объяснить такого сильного расхождения полученных результатов с теоретическим расчетом значения изоэлектрической точки, однако позднее было выдвинуто предположение, что агрегация белка М1 и, как следствие, экранировка ряда его заряженных участков, может приводить к сдвигу суммарной диссоциации заряженных групп в кислотную область [85].
В литературе описано несколько попыток закристаллизовать белок М1, однако его полная структура в целом до сих пор неизвестна, так как во всех случаях происходило отщепление С-концевого домена [9,12]. В 1997 г. Sha B. и Luo M. смогли при рН=4 закристаллизовать и определить структуру лишь N концевой части белка (2-158 а.о.) с разрешением 2,08 А [9]. Согласно их данным, закристаллизованная N-концевая часть белка имеет форму правильной глобулы, а N и M –домены представлены четырьмя -спиралями каждый: 1 - 4 и 6 - 9, соответственно. Короткая спираль 5 соединяет эти два домена.
Пространственное расположение спиралей представлено на рисунке 6. Оказалось, что при кристаллизации N-концевая часть белка М1 формирует димеры, образованные сетью водородных связей и гидрофобными взаимодействиями между параллельными 6 –спиралями мономеров. Позднее, независимо друг от друга, две группы исследователей определили структуру N-концевой части белка при рН=7 [10,12]. Из данных следует, что структуры N- и M-доменов в кислой и нейтральной средах имеют лишь незначительные отличия (рисунок 7).
В связи с безуспешностью кристаллизации полноразмерного белка М1 рядом авторов были проведены попытки определения его структуры непосредственно в вирионе [86]. Для этого использовался метод тритиевой планиграфии, при котором осуществлялось бомбардировка вируса A/Aichi/2/68 «горячими» атомами трития. В результате была предложена модель ориентации белка в вирионе (рисунок 8). Позднее, используя эти данные и современные алгоритмы предсказания структуры, была предложена трехмерная структура М1 в вирионе [30]. Тем не менее, проведенные в этих работах исследования не смогли пролить свет на то, какова же структура С-домена белка М1.
Благодаря недавним исследованиям, проведенным методом малоуглового рентгеновского рассеяния, была определена структура нативного полноразмерного белка М1 в растворе при рН 4,7 [13]. Согласно полученным результатам, он представляет собой мономер с выраженной структурной анизотропией: компактный NM-фрагмент диаметром 4 нм и вытянутый слабо упорядоченный С-концевой домен длиной от 2 до 9 нм (наиболее представленная длина составляла 6-7 нм) (рисунок 9). Авторы сделали вывод о том, что, помимо мономеров, в растворе присутствует минорная фракция белковых кластеров. Это согласуется с результатами более ранней работе Жирнова О.П. [67].
Структура полноразмерного белка в нейтральной среде до сих пор неизвестна. На основании результатов исследования раствора белка М1 при рН 7,4 с помощью метода гель-фильтрации авторы работы [10] сделали вывод о том, что белок М1 в нейтральной среде представлен в виде мономера. Однако в более позднем исследовании с помощью того же метода была показана
Помимо поиска ответов на вопросы о пространственной структуре белка М1, многие ученые исследовали, каким образом матриксный белок взаимодействует с вРНП. В работах [88,89] посредством картирования моноклональными антителами было определено два сайта (80 - 109 а.о., и 129 -164 а.о.), ответственных за связывание белка М1 штамма A/WSN/33 с вРНК. Второй сайт содержит мотив «цинкового пальца», ответственный за связывание ДНК и РНК в случае ряда белков, в связи с чем, многие ученые полагали, что и в данном случае он играет немаловажную роль. Однако позднее, исследуя связывание меченой 32P 172-х нуклеотидной РНК с диким типом М1 и мутантными рекомбинантными белками М1, экспрессированными в E.coli, было показано, что за связывание с РНК ответственен участок между 91 и 111 аминокислотной позицией [90]. При исследовании кристаллической структуры М1 также был сделан вывод о малой вероятности участия «цинкового пальца» в связывании М1 с РНК, так как была показана значительная отдаленность элементов, формирующих палец [9]. При исследовании взаимодействия рекомбинантного белка М1 и его доменов с РНП было сделано предположение, что за связывание с рибонуклеопротеином ответственен С-домен матриксного белка [91]. Тем не менее, на основании исследования влияния различных мутаций в области 101-105 а.о., соответствующей М-домену, на взаимодействие белка М1 с РНП и РНК авторы работы [75] сделали вывод об огромной роли участка RKLKR этого домена при взаимодействии матриксного белка с РНП. Однако на данный момент принято считать, что только С-домен белка М1 связывается с вРНП.
Поверхностный плазмонный резонанс
Явление поверхностного плазмонного резонанса состоит в возбуждении и последующем распространении поверхностной электромагнитной волны (ПЭВ) вдоль сред с диэлектрическими проницаемостями разного знака. Для понимания этого явления обычно рассматривают плоскую электромагнитную волну, распространяющуюся в среде с показателем преломления п. Ее можно записать следующим образом: Е = Еа exp[jwt -jkx- jk у - jk z] (1) где Eo - амплитуда электрического поля, w- круговая частота, k - волновой вектор.
Направление волнового вектора совпадает с направлением распространения волны. Его величина определяется как где и с - длина волны и скорость света, соответственно.
Для простоты, не ограничивая общности, обычно рассматривают двумерный случай (kz =0). отражения такой волны от границы между средами 1 и 2 с показателями преломления Пі и Пг, соответственно (рисунок 16). Согласно закону Снеллиуса
Используя уравнения (2) и (3б) можно получить выражение для компонент волнового вектора перпендикулярного границе раздела сред
В предположении, что П2 пі для случая sin щ /гц правая часть уравнения (4) становится отрицательной и, следовательно, ку -чисто мнимая величина. Возвращаясь к уравнению (1) и делая замену y2=jky2 можно получить, что в среде 2 существует только волна, параллельная границе раздела сред: E2=E0e-Ky2yexp[jwt-jkxx] (5)
Более того, такая волна будет экспоненциально затухать по амплитуде вдоль оси у с характерным расстоянием 1/у2. Эту волну обычно называют исчезающей. Уравнение (4) используют для определения глубины ее проникновения в среду, которое составляет порядка половины длины волны падающего света.
Для p-поляризованной волны коэффициент отражения определяется уравнениями Френеля где Ei и Er – падающая и отраженная волна, соответственно. Введем коэффициент отражения по интенсивности:
Согласно Cardona [97] возможно два особых случая: если + =/2, то знаменатель в (6а) становится бесконечно большим и, следовательно, Rp становится равным нулю. Такая ситуация описывается углом Брюстера, когда нет отражения для р-поляризованной волны. Второй особый случай возникает, когда - = /2: в этом случае Rp становится бесконечным (конечная Ег и стремящаяся к нулю ЕІ). Это условие соответствует резонансу. В этом случае cos() = - sin() и kix/ кіу=-П2/пь Для компонентов волнового вектора к (кх, ку) можно записать где ї и 2 - диэлектрические проницаемости соответствующих сред, і = 1 или 2, в соответствии с рассматриваемой средой. Эта дисперсионная зависимость описывает свойства поверхностных поляритонов.
Если среда 2 - металл, то благодаря большому количеству свободных электронов w WPJ а диэлектрическая проницаемость - отрицательна (i 0)
В общем случае, если w wp, электромагнитная волна не может распространяться в металле. В более специфичном случае, когда 2І ї, для границы раздела kyi будут мнимыми, а кх - реальной. Среда 2 в этом случае называется поверхностно-активной средой (ПАС), а частотный диапазон, в котором Res2((D) 0, называется областью аномальной дисперсии. Таким образом, электромагнитная волна существует, распространяясь строго вдоль границы с затухающими хвостами в обе граничащие среды (5). Принимая во внимание тот факт, что золото -16, вода 1,77, можно получить, что глубина проникновения волны в золото почти в 10 раз меньше, чем в вводу.
Наличие потерь энергии (например, поглощения в среде) приводит к ограничению длины пробега L волны по поверхности. Расстояние, проходимое волной тем больше, чем меньше поглощательная способность металла. Кроме этого заметное влияние оказывает микрорельеф поверхности и наличие на ней инородных пленок. Из-за частичного рассеивания поверхностной электромагнитной волны в объемное излучение шероховатости приводит к увеличению затухания [99]. Тонкие диэлектрические пленки, согласно теоретическому анализу, сильно влияют на структуру поля ПЭВ. Так пробег может сокращаться на десятки процентов. Эти величины хорошо иллюстрируют не только уровень требований к состоянию поверхности, исследуемых с помощью ПЭВ образцов, но и уровень чувствительности методик ПЭВ.
На данный момент разработан эффективный призменный метод возбуждения ПЭВ светом. Преобразование света основано на явлении нарушенного полного внутреннего отражения p–поляризованного (в плоскости падения) излучения на ПАС со стороны оптически более плотной среды. Угол падения выбирается из условия где Єз - диэлектрическая проницаемость материала призмы. Метод существует в двух модификациях: геометрии Отто и геометрии Кречманна (рисунок 17) [96,98,99,137]. Этим методом ПЭВ возбуждается на гладкой поверхности. В большинстве случаев источником излучения при возбуждении ПЭВ служит лазер. Эффективность преобразования объемного излучение в ПЭВ в случае геометрии Отто, чаще применяемой в ИК-спектре излучения, составляет десятые доли, а в случае геометрии Кречманна практически равна единице [99]. Длина пробега вдоль поверхности может достигать нескольких сантиметров.
Благодаря своей высокой чувствительности поверхностный плазмонный резонанс, активно используется для исследования связывания различных веществ с поверхностью при изучении таких явлений, как адсорбция, взаимодействия антитело-антиген, белок-ДНК и др.
Влияние рН на формирование слоя белка М1
Формирование самособирающихся монослоев молекул МК осуществлялось согласно описанной выше методике (подраздел 2.5.1.). Эксперименты в такой модельной системе проводились с помощью ППР-спектрометра “Biosuplar 6” (Mivitec). Типичная кинетическая кривая представлена на рисунке 25, где показаны характерные детали проведения измерений. В ходе всего эксперимента через отсеки двухкамерной ячейки с помощью перистальтического насоса по замкнутому кругу прокачивался буферный раствор. Сигнал прибора с одного отсека выступал в роли сигнала сравнения для коррекции температурного дрейфа. Через второй отсек буферный раствор с требуемым значением рН прокачивался до выхода сигнала ППР на стационарное значение, после чего вводили раствор белка М1 в соответствующей концентрации в том же буферном растворе. После выхода сигнала адсорбции на стационарное значение белок из ячейки удаляли путем прокачки через нее буферного раствора на выход вплоть до достижения сигналом нового стационарного уровня.
Формирование слоя матриксного белка М1 и его структуры были исследованы путем изучения кинетики адсорбции матриксного М1 в нейтральной среде. Сразу после введения раствора белка наблюдался быстрый рост сигнала адсорбции с выходом на стационарный уровень. При концентрации белка 250 нМ этот процесс занимал около 20 мин (рисунок 25). В ответ на промывку буферным раствором значительной десорбции белка не наблюдалось, т.е. адсорбция была практически необратимой. Повторное введение белка М1 в той же концентрации также не приводило к заметному изменению сигнала адсорбции.
Для определения влияния концентрации М1 на кинетику адсорбции и параметры формируемого слоя, подобные исследования были проведены в диапазоне 50 - 500 нМ. Оказалось, что во всем этом интервале концентраций величина сигнала адсорбции достигала одинакового уровня, составляющего 300 ± 10 у.е. Промывка и последующее введение повторной дозы белка не приводили к заметному его изменению. Концентрация белка лишь влияла на время достижения этого уровня.
Известно, что необратимому связыванию белка с поверхностью обычно соответствует формирование мономолекулярного слоя [123,151]. Необратимости адсорбции в наших экспериментах соответствовало выполнение ряда критериев. Во-первых, связь белка с поверхностью характеризовалась высокой энергией, на что указывала пренебрежимо малая десорбция. Во-вторых, уровень насыщения достигался в течении значительного времени, что обычно связано с преодолением высокого энергетического барьера. Наконец, при всех концентрациях сигнал адсорбции достигал одного и того же значения. Тем самым можно сделать вывод о том, что при рН 7,0 М1 формировал мономолекулярный слой на слое молекул МК.
Для получения дополнительной информации о структуре адсорбционного слоя белка М1 результаты измерений были пересчитаны в поверхностную концентрацию белка описанными выше способами (раздел 2.4.3-2.4.4). Для расчета согласно формуле (5) раздела 2.4.4. необходимо знать значение показателя преломления белка. В работе [152] была проведена оценка зависимости показателя преломления для различных глобулярных белков от их молекулярной массы. С помощью этих данных было оценено значение показателя преломления для белка М1, имеющего массу 27,8 кДа. Оно составило 1,47. Здесь и далее полученные двумя способами оценочные значения поверхностной концентрации были близки по значению. В описанном случае поверхностная концентрация составила примерно 410 -2 молекул/нм2. Иными словами на одну адсорбированную молекулу М1 приходилась площадь примерно 25 нм2. Это согласуется с размерами белковой молекулы (размер глобулярной части белка составляет примерно 4x4x4 нм3 [19,20]), что дополнительно подтверждает монослойный характер формируемого адсорбционного слоя.
Полученные результаты существенно отличаются от данных работы [25], где в аналогичной модельной системе была обнаружена концентрационная зависимость адсорбции белка М1 при рН 7,0. Такое различие вызвано тем, что, согласно представленным данным, автор указанной работы исследовал адсорбцию в течение 15 минут, когда ее сигнал еще продолжал монотонный рост и не достигал стационарного значения. Соответственно, в более разбавленных растворах, где скорость адсорбции ниже, сигнал к указанному времени оказывался ниже, чем в концентрированных. В связи с этим, сделанное в работе [25] предположение об образовании при рН 7,0 на поверхности сетей белка М1 различной структуры, по-видимому, ошибочно.
Как отмечалось выше, в кислой среде (при рН 5,5) происходит разрушение белок-липидной оболочки вируса гриппа А. Можно было ожидать, что, в этих условиях, в отличие от нейтральной среды, белок не будет адсорбироваться на поверхности подложки или эта адсорбция будет обратимой. Для проверки этого предположения была исследована адсорбция белка М1 при рН 4,0.
После добавления белка М1 в проточную ячейку наблюдался рост сигнала адсорбции в течение 1 ч и более. Интересно, что не только скорость этого процесса, но и достигаемый уровень увеличивались при увеличении концентрации белка (рисунок 26), причем, как и в нейтральной среде, во всем исследуемом диапазоне концентраций (от 50 до 500 нМ), белок адсорбировался практически необратимо. Однако, если его удаляли уже через несколько минут после введения, наблюдалась значительная десорбция. Так, например, после промывки буферным раствором через 1 мин после введения белка, с поверхности уходила почти половина его адсорбированного количества (рисунок 27). Таким образом, доля необратимо адсорбированного М1 увеличивалась со временем. Подобные явления наблюдались и раньше при адсорбции некоторых белков [123,151,153,154]. По-видимому, это обусловлено тем, что белки представляют собой большие молекулы с множеством участков, способных обратимо связываться с поверхностью. По мере роста числа таких связей вероятность десорбции быстро падает, и адсорбция становится фактически необратимой в силу кинетических ограничений (рисунок 28). В пользу этого вывода говорит тот факт, что зачастую такие, на первый взгляд, необратимо связанные с поверхностью белки, могут полностью десорбироваться в результате конкурентной адсорбции более крупных белковых молекул, имеющих большее количество сайтов связывания с поверхностью [151,153,155]. Такое явление носит название эффекта Вромана. В кислой среде, несмотря на высокую начальную скорость адсорбции, время выхода сигнала на насыщение было существенно больше, чем в нейтральной (рисунок 29 а). Так, при концентрации белка 250 нМ оно составляло не 20 минут, как в нейтральной среде, а примерно 2 часа. Несмотря на это, достигнутые значения сигналов адсорбции при рН 4,0 и рН 7,0 при данной концентрации белка практически не отличались. Однако начальная скорость адсорбции в кислой среде, напротив, при той же концентрации была выше (рисунок 29 б), что свидетельствует о более сильном сродстве молекул М1 к поверхности слоя МК в кислой среде. По-видимому, в кислой среде М1 адсорбируется подобно полимерам и белкам с подвижной структурой, когда немонотонность кинетических кривых (вплоть до появления локальных максимумов на них) и большое время достижения уровня насыщенной адсорбции обусловлены укладыванием длинных полимерных цепей вдоль поверхности, сопряженным со значительными стерическими затруднениями, и взаимной конкуренцией за свободные места связывания [123,151], дополненными сильным взаимным электростатическим отталкиванием молекул.
Влияние состава липидного бислоя на формирование слоя белка М1 при рН 7,0
Для определения влияния отрицательно заряженных липидов на адсорбцию М1 в нейтральной среде мы варьировали их долю от 0 до 30% при неизменной концентрации добавляемого раствора белка (50 нМ). Было обнаружено, что с ростом доли отрицательно заряженного липида сигнал адсорбции на таком бислое существенно увеличивался. В качестве примера на рисунке 47 представлены кинетические кривые адсорбции белка М1 для бислоев без ДФФС и с 30% ДФФС. В первом случае сигнал адсорбции был ниже, быстро выходил на насыщение и после промывки системы снижался не так сильно. Его финальное значение было примерно на 20% меньше остаточного уровня адсорбции на заряженном бислое и составляло (1430 ± 50) RU. Иными словами, на одну молекулу М1 приходилось в среднем 30 нм2 поверхности. Исходя из этого можно предположить, что белковые агрегаты практически не адсорбируются и не формируются на незаряженным липидным бислоем. Более того, по-видимому, и одиночные молекулы белка связываются с незаряженной липидной поверхностью в меньшем количестве, чем в присутствии заряженных липидов, о чем свидетельствует более низкий финальный уровень адсорбции.
Вместе с тем, величина итогового сигнала говорит о значительной компоненте необратимой адсорбции даже в отсутствии заряженных липидов. По-видимому, она обусловлена не столько наличием отрицательных зарядов на поверхности, сколько способностью аминогрупп белка М1 формировать водородные связи с карбонильными группами липидов. Примечательно, что итоговый сигнал адсорбции на незаряженном липидном бислое был лишь немного меньше, чем при рН 4,7 (рисунок 44), где бислои при любом липидном бислое из смеси ДФФХ и ДФФС при рН 7,0. Черная кривая соответствует 30%, а красная - 0% ДФФС. Концентрация М1 – 50 нМ.
Различие в итоговых уровнях адсорбции (1430 ± 50 RU и 1790±80 RU, соответственно) для незаряженного и заряженного липидного бислоев свидетельствует о том, что в последнем случае присутствие ДФФС создает на поверхности больше центров связывания, обеспечивая ее отрицательный заряд, тем самым усиливая взаимодействие с противоположно заряженными молекулами М1.
Если привести результаты по исследованию адсорбции на слое МК при рН 7,0 к единицам RU (разделы 2.4.3-2.4.4), будет видно, что с ростом доли отрицательно заряженных групп на поверхности увеличивается уровень необратимой адсорбции, при этом для липидного бислоя из 30% ДФФХ и 70% ДФФС и слоя молекул МК они практически совпадают (рисунок 48). В работе [25], представленные уровни необратимой адсорбции белка М1 в концентрации 500 нМ на липидном монослое из 30% ДФФС и 70% ДФФХ и слое молекул МК также близки, что согласуется с нашими результатами. Можно заметить, что полученный сигналы адсорбции белка М1 на липидном монослое и слое молекул МК близки, что согласуется с нашими результатами. По-видимому, для формирования плотного белкового слоя в нейтральной среде необходимо наличие отрицательного заряда поверхности.
Интересно, что при рН 7,0 на слое МК, также несущем отрицательный заряд, не наблюдалось увеличения достигаемого уровня адсорбции с ростом концентрации белка М1 и, соответственно, последующей десорбции после промывки. Белок при всех концентрациях в растворе адсорбировался практически необратимо и в одинаковом количестве, практически совпадающем, по сделанным оценкам, с количеством белка, необратимо связанным с липидным бислоем. Наблюдаемое различие может быть обусловлено существенно разными скоростями потока жидкости в ячейках при исследовании на этих двух модельных системах. При исследованиях на слое молекул МК ППР-спектрометром «Biosuplar 6» скорость потока в ячейке составляла 960 мкл/мин, в то время как при исследованиях на липидных бислоях с помощью ППР-спектрометра «Biacore T200» она была значительно ниже – 2 мкл/мин. По-видимому, высокая скорость потока не только способствовала более быстрой адсорбции молекул М1, но также затрудняла закрепление на поверхности белковых агрегатов и формирование многослойных покрытий, разрушая их. Низкая скорость потока жидкости в опытах на липидном бислое, возможно, недостаточна для разрушения многослойных белковых структур. Для проверки этого предположения было проведено исследование адсорбции белка М1 в концентрациях 10 и 50 нМ на липидном бислое, содержащем 30% ДФФС прибором «Biacore T200» при максимально возможной скорости потока – 100 мкл/мин. Как видно из рисунка 49, увеличение скорости потока приводило к заметному росту начальной скорости адсорбции. Более того, в полном согласии с нашим предположением, при сравнительно высокой концентрации белка (50 нМ) с ростом скорости потока жидкости доля обратимо адсорбированного белка заметно снижалась. При низкой концентрации М1 (10 нМ) мы предполагали незначительный вклад адсорбции агрегатов, поэтому неудивительно, что рост скорости потока в ячейке приводил лишь к более быстрому достижению финального уровня (соответствующего монослойному покрытию), который, как и ранее, практически не снижался после промывки системы. Со сделанным предположением о влиянии скорости потока согласуются и результаты работы [25], выполненной с помощью ППР спектрометра “Biosuplar 6” на липидном монослое, где даже при концентрации М1 500 нМ практически не наблюдалось десорбции белка.
В ряде работ методами атомно-силовой микроскопии также наблюдалась частичную десорбции белка М1 с различных липидных бислоев в нейтральной среде при промывке [21,26]. На основании этого авторы делали вывод о том, что такую адсорбцию нельзя считать необратимой. Возможно, наблюдаемая в этих работах, частичная десорбция белка в значительной степени обусловлена распадом немонослойных белковых структур, как и в наших экспериментах.