Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Основные принципы атомно-силовой микроскопии и области е применения в биомедицинских исследованиях 10
1.2. Изменения биофизических и морфометрических показателей эритроцитов крови человека в процессе онтогенеза 19
1.3. Современные подходы к определению качества эритроцитсодержащих сред 33
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Материал исследования 37
2.2. Методы исследования 39
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований
3.1. Влияние процесса консервации на гематологические, биофизические и структурные показатели эритроцитов цельной крови 50
3.2. Динамика изменений гематологических показателей трансфузионной среды в процессе е хранения 61
3.3. Динамика значений модуля Юнга эритроцитов трансфузионной среды в процессе хранения 79
3.4. Динамика структуры эритроцитарных популяций проб трансфузионной среды в процессе хранения 82
3.5. Изменения морфометрических показателей эритроцитов трансфузионной среды в процессе хранения по данным атомно-силовой микроскопии 89
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследования.. 97
Выводы 114
Практические рекомендации .115
Список литературы .
- Изменения биофизических и морфометрических показателей эритроцитов крови человека в процессе онтогенеза
- Современные подходы к определению качества эритроцитсодержащих сред
- Методы исследования
- Динамика значений модуля Юнга эритроцитов трансфузионной среды в процессе хранения
Изменения биофизических и морфометрических показателей эритроцитов крови человека в процессе онтогенеза
Особенности режимов работы необходимо учитывать при выборе биообъектов и их подготовке для сканирования. В этом контексте ключевую роль играет фиксация объектов на подложке, что является сложной задачей с учтом необходимости сохранения исходных биофизических параметров образцов и достижения их однослойности [41]. Для исследования клеток подходит стеклянная подложка или подложка на основе полистирола, так как выбор варианта с идеальной гладкостью будет препятствовать иммобилизации. Отсутствует дополнительная необходимость фиксации бактериальных клеток и клеток с выраженным цитоскелетом и адгезивными свойствами, АСМ-сканирование допустимо проводить сразу после высушивания [48]. Наиболее подходящими для сканирования с помощью АСМ являются чтко отграниченные друг от друга и имеющие типичную форму объекты, легко выделяемые из ткани или культуры. По этой причине АСМ широко применяется для визуализации и изучения биофизических свойств вирусов, бактериальных клеток, волос, спермиев, почечных клеток, клеток костного мозга и клеток крови [163, 148, 162, 18, 75]. Особое место в АСМ занимает сканирование эритроцитов вследствие особенностей их строения и простоты получения образцов [123, 155, 98].
Начиная с момента изобретения АСМ в 1986 году, он активно используется в биологии и медицине. Это обусловлено рядом ключевых особенностей, таких, как высокое разрешение получаемых изображений, возможность построения объмных моделей объектов и измерения их свойств. Разработка режимов и методик, позволяющих проводить сканирование в воздушных и жидких средах, повышает доступность метода для исследователей и дат возможность сканировать биологические объекты в их физиологической среде. Это создат благоприятные условия для внедрения АСМ в медицинские исследования.
Пристальное внимание в АСМ уделяется изучению структуры белковых молекул и их функций. Группой авторов была проведена большая работа по изучению олигомеров белка сеипина (seipin), выработка которого связана с генерализованной липодистрофией человека. На этом примере были показаны возможности АСМ по получению изображений биологических молекул высокой чткости и измерению их адгезивных сил [70]. С помощью АСМ можно измерять внутримолекулярные взаимодействия крупных белковых молекул, что продемонстрировано в работе по анализу механизмов димеризации человеческого амилоида -protein (A) [134]. С момента использования АСМ для измерения и манипуляций с отдельными молекулами, измерения их химических связей, этот метод стал активно использоваться для исследования контактов между клетками на молекулярном уровне [110, 87]. АСМ позволяет следить за взаимодействием фармакологических препаратов с клетками и тканями, визуализировать изменения в молекулярной структуре белков и росте кристаллов. Некоторые работы показывают, что в ближайшем будущем АСМ может быть использована в ультра-чувствительных иммунологических исследованиях без какого-либо маркирования для более быстрой и качественной оценки результатов тестов [140].
Возможности АСМ по изучению структуры биологических молекул всецело используются при изучении ДНК, РНК, комплексов белков с нуклеиновыми кислотами, хромосом, при подробном рассмотрении строения и функций мембранных рецепторов и трансмембранных каналов живых клеток. В настоящее время большое количество работ посвящено подробному изучению структуры биополимеров. Группа исследователей продемонстрировала возможности применения АСМ в колебательном режиме для получения изображений высокого разрешения отдельных молекул белка и конденсированных цепочек ДНК [146]. При сканировании ДНК с помощью АСМ важнейшую роль играют методы приготовления препаратов и фиксация молекул на подложке [67, 131, 83]. Визуализация динамики образования комплексов ДНК с белками в жидкой среде и возможности АСМ по измерению механических свойств лигандов позволяют также лучше понять биологические процессы на мономолекулярном уровне и получить больше информации о регуляции генов [166].
Атомно-силовой микроскоп больше, чем прибор только для визуализации поверхностей: с помощью электросиловых измерений он позволяет определить физические параметры таких процессов, как взаимодействия молекул, гидрофобность поверхности, электрический заряд образца и механические свойства [140]. Появление АСМ дало импульс к подробному изучению вирусных частиц, их строения и адгезивных свойств [121, 138, 92, 133]. Группа авторов исследовала вирусные частицы гриппа А с помощью АСМ и установила роль белков оболочки в поддержании формы вируса, его инвазивной активности и дальнейшей внутриклеточной сборки вирионов [153, 161].
АСМ активно применяется в исследовании структуры и физических свойств вируса иммунодефицита человека и инфицированных им лимфоцитов [74]. Ряд авторов измеряли упругость вирусных частиц HIV и показали связь между биофизическими параметрами вируса и его инвазивной активностью. Тем самым был продемонстрирован новый уровень регуляции репликации [164, 64]. Другая группа исследователей, используя АСМ, показала влияние некоторых веществ на адгезивные и цитотоксические характеристики вирусов иммунодефицита человека [160].
Современные подходы к определению качества эритроцитсодержащих сред
Для получения консервированной крови и е дальнейшего фракционирования на компоненты использовались закрытые системы «Гемакон» для сбора крови фирм «Baxter» (США) и «Terumo» (Япония) объмом 450 мл, содержащие антикоагулянт «CPDA-1» в объме 63 мл. В 100 мл данного антикоагулянта содержится 0,327 г лимонной кислоты (моногидрата), 2,63 г цитрата натрия (дигидрата), 0,251 г натрия фосфата одноосновного (дигидрата), 2,9 г декстрозы (антигидрида), 0,027 г аденина и воды для инъекций. В процессе сбора донорской крови, после венепункции, происходило постоянное медленное перемешивание антикоагулянта и поступающей в пластиковый контейнер крови. При достижении требуемого объма крови в контейнере (450 мл), магистраль герметично запаивалась специальным прибором «Biosealer CR6», контейнер подвергался процедуре центрифугирования. Центрифугирование осуществлялось на оборудовании компании Sorvall в режиме 4000 об/мин в течение 7 минут с поддержанием температуры +4С и мягким торможением ротора. Далее проводилась процедура фракционирования в условиях стерильного бокса с использованием механического экстрактора и получением плазмы, лейко-тромбоцитарного слоя (ЛТС) и эритроцитарной массы без ЛТС, контейнеры с которой помещалась в холодильную установку и хранились при T +4С в течение 35 суток. На каждом этапе исследования (1, 7, 14, 21 и 35 суток) образцы трансфузионной среды извлекались из холодильной установки, плавно перемешивались, штуцер контейнера вскрывался, определнный объем среды извлекался для последующей обработки.
Стандартные измерения показателей состояния хранящихся образцов эритроцитарной взвеси включали определение гематологических показателей эритроцитсодержащей среды, а также уровня гемолиза (УГ). Согласно действующему «Техническому Регламенту» эти методы должны характеризовать состояние совокупности клеток исследуемого образца эритроцитсодержащей среды [2]. Для определения гематологических показателей трансфузионных сред в настоящей работе был использован анализатор «Elite 3» (рис. 1). Прибор используется в рутинной практике отделов контроля качества центров крови. «Elite 3» состоит из трх основных частей: гидравлической системы, системы обработки данных, панели управления. Полученные данные могут быть распечатаны на внешнем или встроенном принтерах. Для подсчта клеток и определения их размера данный тип анализатора использует импендансный метод, или метод Коултера (рис. 2). Метод Коултера основан на измерении изменений электрического сопротивления при прохождении частиц, взвешенных в проводящей жидкости, через апертуру. Каждая клетка, проходящая через апертуру, вызывает изменение сопротивления проводящей суспензии клеток крови. Эти изменения регистрируются как увеличение электрического напряжения между электродами. Количество импульсов пропорционально количеству частиц. Амплитуда каждого импульса пропорциональна объму клетки. Импульсы подсчитываются только в границах, которые находятся между заранее установленными на программном уровне нижним и верхним пределами. Измерение количества гемоглобина прибором «Elite 3» производится фотометрическим методом после лизирования эритроцитов в специальной камере.
С помощью гематологического анализатора «Elite 3» были измерены 15 параметров: концентрация лейкоцитов (WBC 109/л) и эритроцитов (RBC 1012/л); концентрация гемоглобина (HGB г/л); гематокрит (HCT %); средний объем эритроцитов (MCV фл); среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH г/л); средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах (MCHC г/л); концентрация тромбоцитов (PLT 109/л), лимфоцитов (LYM 109/л), моноцитов/эозинофилов (MON 109/л) и гранулоцитов (GRA 109/л); относительная концентрация лимфоцитов (LYM %), относительная концентрация моноцитов/эозинофилов (MON %) и относительная концентрация гранулоцитов (GRA %); ширина распределения популяции эритроцитов (RDWc %). Гематокрит - показатель, отражающий соотношение объма эритроцитов и жидкой части среды, в которой они взвешены. Ширина распределения популяции эритроцитов - это показатель, демонстрирующий распределение эритроцитов по размеру в исследуемой клеточной популяции. Рис 1. Гематологический анализатор «Elite 3».
Средний объем эритроцита – показатель, характеризующий средние значения размера эритроцитов исследуемого образца. Средний объм эритроцита выражается в фемтолитрах (фл). Показатель среднего содержания гемоглобина в эритроците позволяет оценить среднее значение содержания гемоглобина эритроцитов в пробе. Среднее содержание гемоглобина в эритроците (MCH), выражается в пикограммах (пг). Средняя концентрация гемоглобина в эритроците отражает его насыщенность гемоглобином (г/л).
В образцах эритроцитсодержащей среды разного срока хранения производилось также определение УГ (табл.1). С целью определения УГ измерялся уровень внутриэритроцитарного гемоглобина и уровень свободного гемоглобина в среде. Для определения УГ использовался прибор «МиниГем-540», уровень свободного гемоглобина измерялся с помощью фотоколориметра «Гемокью» (рис. 3). Результаты заносились в таблицу значений.
Методы исследования
Для сравнительной характеристики изменений стандартных показателей трансфузионной среды и МЮ эритроцитов, происходящих в процессе хранения, сначала был произведен анализ динамики гематологических показателей с помощью автоматического анализатора. Полученные результаты выражали графически в виде диаграмм среднего арифметического значения и стандартного отклонения (M±) на исследованные сутки хранения среды.
Средние арифметические значения концентрации лейкоцитов в пробах эритроцитсодержащей среды в первые сутки хранения составляют 2,84±0,66x109/л (рис. 15). Далее наблюдается снижение значений этого показателя в течение последующих двух недель хранения трансфузионной среды до уровня 2,32±0,36x109/л – 2,45±0,35x109/л (7-14 сутки соответственно), и в дальнейшем снижение его к концу срока хранения до уровня значений 1,4±0,28x109/л. Однофакторный дисперсионный анализ концентрации лейкоцитов на разных сроках хранения эритроцитсодержащей среды не показывает статистически значимой динамики этого показателя (F=1,6; p 0,19).
В первые сутки хранения в образцах трансфузионной среды концентрация лимфоцитов составила 0,5±0,13x109/л, далее наблюдалась относительная стабилизация этого показателя в течение последующих 7 суток хранения на уровне 0,32±0,11x109/л (рис. 16). Рост этого показателя наблюдается к концу первых двух недель хранения до 0,58±0,32x109/л с последующим равномерным снижением до 0,02±0,08x109/л к концу срока хранения, на 35 сутки. Однофакторный дисперсионный анализ концентрации лимфоцитов на разных сроках хранения эритроцитсодержащей среды также не обнаружил статистически значимую общую динамику значений этого показателя (F=1,7; p 0,2).
Как видно из представленной на рис. 17 динамики изменения концентрации моноцитов/эозинофилов в клеточной взвеси, их содержание в трансфузионной среде на первые сутки составляет 0,28±0,05x109/л и практически не изменяется в течение первых 7 дней хранения. Существенный рост этого показателя наблюдается к концу первых двух недель хранения до 0,92±0,27x109/л с последующим равномерным снижением до 0,32±0,06x109/л к концу срока хранения на 35 сутки. Дисперсионный ANOVA-анализ динамики концентрации моноцитов показал наличие выраженных различий между его значениями на разных сроках хранения (F=4,5; p 0,004). При анализе статистической значимости различий значений этого показателя в разные сроки хранения c помощью критерия Бонферрони было установлено, что максимальное его значение, отмеченное на 14 сутки хранения, -0,92±0,27x109/л, достоверно отличается от значений 1-х суток (p 0,005), 7-х суток (p 0,007) и 35-х суток хранения (p 0,024). Трактовать обнаруженный факт как реальный рост концентрации моноцитов и эозинофилов в середине срока хранения не представляется возможным. Скорее всего, это обусловлено ростом числа разрушающихся эритроцитов, обломки или тени (освободившиеся в результате лизиса от гемоглобина клетки) которых «симулируют» значения сопротивления моноцитов и эозинофилов, распознаваемых прибором как реальные клетки. Этот факт (и приведнные в этом разделе результаты) показывают проблематичность точной интерпретации результатов, полученных с помощью автоматического гематологического анализатора для оценки состава эритроцитсодержащих компонентов крови.
Концентрация гранулоцитов, согласно результатам, представленным на рис. 18, в первые сутки составила 3,77±0,28x109/л. Далее наблюдается постепенное снижение этого показателя в течение последующих двух недель хранения на уровне 2,24±0,36x109/л – 1,1±0,26x109/л (на 7-14 сутки, соответственно). В последующем уровень значений незначительно повышается к концу срока хранения до 1,25±0,25x109/л. Однофакторный дисперсионный анализ концентрации гранулоцитов на разных сроках хранения эритроцитсодержащей среды показывает статистически значимую общую динамику его изменений (F=14,1; p 0,000). С помощью критерия Бонферрони установлено достоверное различие средних арифметических значений уровня гранулоцитов образцов трансфузионной среды, находящихся на хранении в течение суток от хранящихся 7 суток (p 0,005) и от находящихся на хранении 14 и 21 сутки (p 0,000), а также от значений этого параметра в среде в конце срока хранения (p 0,000). Рост значений концентрации гранулоцитов в трансфузионной среде можно трактовать либо как появление артефактов при исследовании образцов с помощью гематологического анализатора, либо как образование клеток de novo при хранении среды. В любом случае это свидетельствует о недостаточной эффективности оценки состава среды на основании данных, полученных на гематологическом анализаторе, параметры которого рассчитаны для анализа цельной крови.
Динамика значений модуля Юнга эритроцитов трансфузионной среды в процессе хранения
В настоящее время в центрах заготовки и переливания крови проводится исследование различных параметров трансфузионных сред. Согласно «Техническому регламенту» [2], отделами контроля качества измеряются общие гематологические показатели и уровень гемолиза на конец срока хранения образцов трансфузионной среды. Продолжительность срока хранения, в соответствии с рекомендациями Совета Европы по производству и исследованию качества компонентов крови, для антикоагулянта типа «CPDA-1» установлена 35 суток [115]. Анализ стандартных методов показывает, что они могут лишь косвенно характеризовать свойства консервированных эритроцитов. Вопрос о корректности существующих методов определения качества образцов трансфузионной среды в процессе их хранения является актуальным и диктует необходимость поиска новых критериев оценки состояния красных кровяных телец. Ведущая роль в выполнении основных функций эритроцитов, как и их устойчивости к изменению формы, отводится состоянию мембраны. Одними из основных характеристик мембраны являются е ригидность и форма. Основной целью настоящего исследования явилось установление динамики биофизических и морфометрических показателей эритроцитов крови человека в процессе их хранения в виде эритроцитсодержащей среды. Был произведн поиск метода, который бы одновременно позволил измерить морфометрические и биофизические показатели эритроцитов. В определнной мере такой комплекс показателей можно исследовать современным видом микроскопии – атомно-силовой микроскопией. Она позволяет измерить не только ригидность отдельных эритроцитов, но и их диаметр, толщину, оценить форму клетки.
При постановке задач исследования учитывалось несколько важных аспектов. Для корректной оценки значений изучаемых показателей эритроцитов образцов трансфузионной среды в процессе хранения в банке крови необходимо было сначала установить влияние на них процесса консервации крови человека, ее дальнейшего фракционирования и охлаждения до +4С. При этом рассматривался комплекс гематологических, биофизических и морфометрических параметров. Далее необходимо было проанализировать динамику гематологических показателей проб трансфузионной среды в процессе е хранения на основе стандартных методов исследования. Третьей задачей явилось измерение МЮ эритроцитов образцов трансфузионной среды во время хранения в течение 35 суток по данным АСМ. Наличие данных, полученных с помощью стандартных методов контроля качества образцов трансфузионной среды и АСМ, позволило сопоставить их достоверность и корректность. Ещ одной задачей был анализ динамики состава эритроцитарной популяции трансфузионной среды в процессе хранения, на основе значений МЮ, полученных с помощью АСМ, что позволило рассмотреть не только состояние отдельных эритроцитов, но и всего массива клеток. С учтом возможностей АСМ по одновременному измерению биофизических параметров и формированию изображения объекта во время сканирования в последнюю задачу исследования было вынесено выявление динамики структурных показателей эритроцитов образцов трансфузионной среды в процессе хранения для сопоставления их с биофизическими тестами.
Проведнное исследование позволило на первом этапе получить ряд данных об изменениях МЮ эритроцитов крови человека, связанных с процедурами консервации, фракционирования и охлаждения крови до +4С. Было выявлено статистически значимое снижение средних арифметических значений МЮ эритроцитов образцов цельной крови человека с 3,23±0,02 KPa до 1,81±0,02 KPa. Приведнные данные МЮ эритроцитов сходны с результатами, полученными группой исследователей во главе с M. Lekka, которая установила значения МЮ эритроцитов крови здоровых людей с помощью АСМ, используя метод Герца. Полученные ими значения МЮ составили 3,6±0,4 KPa [103].
Дальнейшее построение формулы распределения средних значений МЮ клеток по сформированным интервалам в 0,4 KPa эритроцитарной популяции цельной крови (20%, 36%, 22%, 14%, 8%) и трансфузионной среды после суток хранения при стандартных условиях (10%, 10%, 52,5%, 27,5%), продемонстрировало значительные изменения структуры разнородности популяции клеток. Кроме того, отмечено смещение границ и ширины интервала значений МЮ. Так, типичные для консервированной крови эритроциты со значениями МЮ в диапазоне от 2,4 KPa до 4,4 KPa не встречаются в образцах трансфузионной среды, эритроциты которых имеют интервал распределения значений МЮ от 0,8 KPa до 2,4 KPa. Аналогичные данные о значительной гетерогенности эритроцитарных популяций, полученные с помощью тестов на осмотическую и кислотную резистентность, показаны в работе Лазько А.В. [31].
Снижение упругости эритроцитов цельной крови после консервации и фракционирования можно объяснить воздействием антикоагулянта CPDA-1 на эритроциты. Этот тип антикоагулянта содержит цитрат натрия, лимонную кислоту, фосфат натрия, декстрозу и аденин. Антикоагулянтный эффект обеспечивается путм связывания катионов Са2+ цитрат-анионами. Фосфат натрия участвует в поддержании буферной системы крови, декстроза и аденин являются энергетическими субстратами и оказывают значительное мембранстабилизирующее воздействие на эритроциты. Невозможно исключить и влияние жесткого режима центрифугирования контейнеров с консервированной кровью, дальнейшего фракционирования с сепарацией жидкой части – плазмы, отделения ЛТС и охлаждения до +4С.
Перечисленные факторы оказывают влияние и на динамику стандартных гематологических показателей образцов цельной крови. Результаты настоящего исследования демонстрируют статистически значимое увеличение средних арифметических значений концентрации эритроцитов от 5,28±0,4х1012/л до 7,19±0,9х1012/л, концентрации гемоглобина в среде от 149,7±0,5 г/л до 192,1±1,7 г/л, гематокрита с 45±0,2% до 61,7±0,5%, широты распределения популяции эритроцитов от 12,55±0,08% до 13,9±0,05%. При этом отмечено снижение средней концентрации гемоглобина от 331,7±0,9 г/л до 313,91±0,75 г/л и средних значений содержания гемоглобина в эритроците от 28,25±0,3 пг до 26,9±0,2 пг. Это можно объяснить разрушением части эритроцитов и выходом гемоглобина в межклеточное пространство трансфузионной среды во время центрифугирования и фракционирования.
Процедура фракционирования предполагает обязательную тромбо- и лейкодеплецию, что направлено на минимизацию разрушительного действие активных ферментов тромбоцитов и лейкоцитов на мембраны хранящихся эритроцитов [60]. Удаление ЛТС отражается на составе неэритроцитарного клеточного ряда отобранных образцов цельной крови в виде статистически значимого снижения значений ряда показателей. Однако данные гематологического анализатора показали, что полного удаления ЛТС не происходит, более того, некоторое число клеток лейкоцитарного ряда персистирует в среде вплоть до последних дней хранения. Средние арифметические значения концентрации тромбоцитов, согласно полученным результатам, снизились от 208,8±16,3х109/л до 0,8±0,4х109/л, лейкоцитов от 6,02±0,31х109/л до 2,84±0,66х109/л, лимфоцитов от 2,1±0,12х109/л до 0,5±0,13х109/л, моноцитов от 0,61±0,03х109/л до 0,28±0,05х109/л. Процентная концентрация этих показателей также снизилась. При этом наблюдалась тенденция роста абсолютной и относительной концентрации гранулоцитов в исследуемых образцах от 3,32±0,19х109/л (55±0,4%) до 3,77±0,28х109/л (84±1,2%). Это можно объяснить тем, что, предположительно, электрические или размерные характеристики мембраны, подобные клеткам лейкоцитарного ряда, могут иметь эритроциты, изменившиеся в процессе консервации, фракционирования и охлаждения.