Атомно-силовая спектроскопия одиночных вирусных частиц и их субъединиц Корнеев Денис Владимирович

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1 Атомно-силовая спектроскопия. 11

1.1.1 Модификация зондов АСМ 22

1.1.2 Интерпретация результатов АСС 27

1.1.3 АСС вирусных частиц 32

1.2 Диэлектрофорез 37

1.2.1 Диэлектрофорез вирусных частиц 39

1.3 Флавивирусы 41

1.3.1 Проникновение в клетку. Рецепторы 42

1.4 Вирус осповакцины 45

1.5 Глицирризиновая кислота 47

1.6 Бактериофаг AP22 48

1.7 Заключение по обзору литературы 50

ГЛАВА 2. Материалы и методы

2.1 Оборудование и реактивы .51

2.2 Объекты исследований 56

2.3 Программный пакет ForceReader 59

ГЛАВА 3. Фиксация вириона на зонде АСМ

3.1 Модификация геометрии острия зонда 61

3.2 Химическая функционализация зондов 65

3.3 Изучение сорбции вирионов на поверхности зонда 68

3.4 Использование диэлектрофореза 71

ГЛАВА 4. Атомно-силовая спектроскопия (эксперименты)

4.1 Изучение системы «ЛСБ – белок E ВЗН» .75

4.2 Изучение системы «вирус осповакцины – эритроцит человека» 83

4.3 Изучение системы «бактериофаг AP22 – A.baumannii» 87

Заключение .90

Выводы .91

Благодарности 92

Список литературы

• Модификация зондов АСМ
• Объекты исследований
• Изучение сорбции вирионов на поверхности зонда
• Изучение системы «вирус осповакцины – эритроцит человека»

Введение к работе

Актуальность исследования. Вирусы являются облигатными

внутриклеточными паразитами, распространены повсеместно и имеют

исключительно высокое значение для всего живого на планете. Пути репликации вирусов отличаются большим разнообразием, но общим начальным этапом заражения клетки является адгезия вириона к её поверхности (Филдс Б., 1989; Haywood A.M., 1994; Kendall K. et al., 2011). На данном этапе происходит узнавание между молекулами, расположенными на поверхности клетки (рецепторами), и молекулами вириона. Изучение данного процесса является актуальной задачей современной биофизики и имеет большое теоретическое значение для понимания механизма проникновения вируса в клетку (Kendall K. et al., 2011). Прикладным аспектом в данной области является изучение влияния различных химических агентов на адгезию вирионов к поверхности клетки (Haywood A.M., 1994; Bhella D., 2015).

Атомно-силовой микроскоп (АСМ) (Binning G. et al., 1986) помимо визуализации рельефа поверхности позволяет осуществлять механическую манипуляцию наноразмерными объектами и измерять действующие на них силы в режиме атомно-силовой спектроскопии (АСС) (Cappella B., 1999). Данная техника предоставляет принципиально новые возможности для изучения взаимодействия вирусной частицы с поверхностью клетки – осуществима механическая манипуляция одиночным вирионом, возможно экспериментальное определение его механических параметров и измерение сил, возникающих при контакте с поверхностью клетки (Kol N. et al., 2006; Mateu M.G., 2012; Herrmann A. et al., 2015).

Флавивирусы вызывают ряд опасных заболеваний человека (Филдс Б., 1989): клещевой энцефалит, лихорадка Денге и др. Для большинства из них в настоящее время отсутствуют специфические средства лечения и профилактики, а процесс проникновения РНК вируса в цитоплазму клетки до сих пор не полностью ясен (Lindenbach B.D. et al., 2007; Fernandez-Garcia M.-D. et al., 2009;

Perera-Lecoin M. et al, 2014). Изучение молекулярного механизма заражения клетки флавивирусом является задачей, актуальной как в теоретическом, так и в практическом плане.

Ламининсвязывающий белок (ЛСБ) является одним из рецепторов для флавивирусов и его взаимодействие с белком Е, покрывающем поверхность вириона, важно не только на этапе адгезии вириона к поверхности клетки, но и при последующем выходе РНК вируса из эндосомы в цитоплазму клетки (Bogachek M.V. et al, 2010). Кроме того, исключительно широкий спектр биологических функций ЛСБ {Castronovo V., 1993; Jamieson K.V. et al, 2008; Nelson J. et al., 2008) делает актуальным изучение свойств данного белка и в качестве самостоятельного объекта исследований.

Цели данной работы:

Разработать методику АСС одиночных вирусных частиц и применить ее при экспериментальном изучении адгезии вирионов к поверхности клетки для двух систем: «вирус осповакцины - эритроцит человека», «бактериофаг AP22 -Acinetobacter Ъаитаппп» {Popova A.V. et al, 2008);

Изучить механические свойства системы «ЛСБ - фрагменты поверхностного белка Е вируса Западного Нила (ВЗН)» методом АСС одиночных молекул.

Исходя из поставленных целей, были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить адгезию вирусных частиц к поверхности зондов АСМ при простой инкубации в вирусной суспензии;

2. Разработать методику модификации зондов АСМ для фиксации одиночных вирионов;

3. Изучить диэлектрофорез вирусных частиц в качестве метода для
фиксации одиночных вирионов на острие зонда АСМ;

4. Провести измерения методом АСС для системы «вирус осповакцины –
эритроцит человека», изучить влияние глициррициновой кислоты (Толстикова
Г.А., 1997) на адгезию вириона к поверхности эритроцита;

5. Провести измерения методом АСС для системы «бактериофаг AP22 –
Acinetobacter baumannii», сравнить результаты для двух штаммов –
восприимчивого и резистентного к данному бактериофагу;

6. Изучить механические характеристики межмолекулярного взаимодействия для системы «ЛСБ – фрагменты поверхностного белка E ВЗН» методом АСС одиночных молекул при двух значениях pH среды – нейтральном (pH = 7,4), соответствующем внеклеточной среде, и pH = 5,3, характерном для эндосом;

7. Используя метод механического разворачивания (анфолдинга), изучить механические свойства молекул ЛСБ при pH = 7,4 и pH = 5,3.

Научная новизна работы. Разработана оригинальная методика фиксации одиночных вирусных частиц на острие зонда АСМ с использованием диэлектрофореза. Показано, что при простой инкубации функционализованного зонда в вирусной суспензии даже при высокой концентрации и чистоте препарата вероятность сорбции вириона на острие зонда пренебрежимо мала, что ставит под сомнение результаты ранних работ, посвященных манипуляции одиночными вирусными частицами. Показана необходимость визуализации зондов АСМ для подтверждения наличия вирионов или их фрагментов после экспериментов.

Впервые показана зависимость механических свойств молекул ЛСБ от величины pH среды.

Впервые осуществлена механическая манипуляция одиночными вирионами осповакцины и исследован их контакт с поверхностью эритроцита человека. Показано редуцирующее влияние глицирризиновой кислоты на адгезию вирионов к поверхности клетки.

Впервые осуществлена механическая манипуляция одиночным вирионом бактериофага семейства Myoviridae. Показано, что адгезия к поверхности бактерии отличается для восприимчивого и резистентного штаммов.

Теоретическая и практическая значимость. Разработанная методика АСС одиночных вирусных частиц применима для изучения взаимодействия различных вирусов с поверхностью клетки. На примере глицирризиновой кислоты показана адекватность данного метода для изучения влияния химических агентов на адгезию вирионов.

Обнаруженное изменение механических свойств ЛСБ при изменении pH среды, вероятно, имеет значение для проникновения флавивируса в клетку. Возможно, обнаружен новый элемент молекулярного механизма заражения клетки флавивирусом.

Программный пакет анализа силовых кривых ForceReader размещен в открытом доступе на сервере SourceForge, доступен для скачивания, и может быть использован другими исследователями.

Положения, выносимые на защиту:

1. Экспериментально показано, что при простой инкубации зонда АСМ в вирусной суспензии вероятность сорбции вирионов на его острие пренебрежимо мала;

2. Разработана оригинальная методика фиксации одиночных вирусных частиц на острие зонда АСМ для силовых измерений;

3. Для модельной системы «вирус осповакцины – эритроцит человека» показана применимость разработанной методики для изучения механического контакта одиночной вирусной частицы с поверхностью клетки;

4. С использованием разработанной методики показано, что адгезия бактериофага AP22 к поверхности бактерии A.baumannii отличается для восприимчивого и резистентного штаммов;

5. Методом АСС одиночных молекул показано изменение механических свойств молекул ЛСБ при понижении pH с 7,4 до 5,3;

Апробация работы. Основные результаты и положения диссертации были представлены и обсуждены на конференциях: Второй международный конкурс научных работ молодых ученых в области нанотехнологий (Москва, 2009), XXIII Российская конференция по электронной микроскопии (Черноголовка, 2010), 18^th

International Microscopy Congress (Прага, Чешская Республика, 2014), International Union of Microbiological Society Congress (Монреаль, Канада, 2014), XVII Linz Winter workshop “Advances in Single-Molecule Research for Biology & Nanoscience” (Линц, Австрия, 2015), The Physics of Microorganisms (Лондон, Великобритания, 2015), Конференция OpenBio (Кольцово, 2015), Съезд биофизиков России (Ростов-на-Дону, 2015), 6^th International Conference on Mechanics of Biomaterials and Tissues (Вайколоа, США, 2015), Восьмая международная конференция «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2016).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе, 5 публикаций в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, и 10 тезисов докладов в материалах конференций.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, две главы, посвященные исследованиям и обсуждению результатов, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 162 работы. Диссертация содержит 61 рисунок и 5 таблиц.

Благодарности. Автор благодарит своего научного руководителя к.ф.-м.н. Б.Н. Зайцева, С.К. Секацкого и всех сотрудников лаборатории физики живой материи EPFL за результативное сотрудничество и теплый прием в Лозанне в 2013 году. Кроме того, автор благодарит А.В. Попову за прекрасный препарат бактериофага AP22 и ряд ценных рекомендаций.

Модификация зондов АСМ

Кантилеверы и зонды АСМ обычно изготавливают из кремния или нитрида кремния [9; 10]. Для осуществления силовых измерений целевой наноразмерный объект (макромолекула, вирион и др.) должен быть зафиксирован на острие зонда АСМ при помощи ковалентных связей [9; 60-62]. Это требует химической функционализации поверхности зонда, которая обычно осуществляется в две стадии [61; 63]: обработка поверхности зонда реактивом APTES ((3-аминопропил)-триэтоксисилан) [64] и обработка глутаровым альдегидом (ГА) для ковалентной «пришивки» биомолекул [65-67]. Иногда используют более сложную технологию фиксации целевых молекул с промежуточными молекулами-линкерами [68-71] (Рисунок 1.9). Данный подход применяют для работы с объектами крупнее, чем обычные глобулярные белковые молекулы (антитела [70], фрагменты ДНК [71], вирионы [50]). Считается, что использование молекулы-линкера позволяет получить контакт одиночных молекул, исключив влияние соседних участков поверхности зонда [69]. При этом серьезным недостатком данного подхода является сложность или принципиальная невозможность подтверждения результатов модификации методом электронно-микроскопической визуализации зонда после силовых измерений.

Другим способом фиксации целевых молекул на острие зонда АСМ является использование тиольных связей, образующихся между атомами серы аминокислотных остатков белковых молекул и золотом, нанесенным на поверхность зонда [72-74]. Тонкий ( 10 нм) слой золота наносят на поверхность зондов при помощи стандартной техники напыления, применяемой в сканирующей электронной микроскопии [75], или используют специальные коммерческие зонды с золотым покрытием.

Использование двух различных методов фиксации целевых молекул и сопоставление получаемых результатов позволяет минимизировать артефакты, вносимые на этапе пробоподготовки. Для фиксации целевых молекул на поверхности подложки, в качестве которой обычно используется слюда [10; 76] или высоко ориентированный пиролитический графит (HOPG) [10], применяют методики, используемые для модификации поверхности зондов АСМ. В некоторых случаях в качестве подложки используют кремниевые или стеклянные пластинки [77].

Кроме химической модификации поверхности зонда, в некоторых случаях требуется изменение геометрических параметров его острия – формирование площадки заданного размера (Рисунок 1.10). Особенно актуальна данная задача при работе с относительно крупными (вирионы и бактерии) объектами, размер которых значительно превышает диаметр острия стандартного зонда ( 20 нм). Существует большое количество коммерчески доступных зондов специальной геометрии (“коллоидные зонды” и др.), но они дороги и не всегда соответствуют имеющимся задачам. Описан простой способ формирования площадки заданного размера (диаметром до 1000 нм) на острие зонда АСМ, для использования которого не требуется никаких дополнительных приборов кроме самого микроскопа [78; 79].

При длительном сканировании подложки из достаточно твердого материала в контактном режиме на высокой скорости и c большой прижимной силой (ограничение - прочностью кантилевера) острие зонда постепенно затупляется и в зависимости от продолжительности сканирования можно получить площадку желаемого диаметра. Наиболее информативным методом контроля геометрии зондов является их визуализация при помощи сканирующей [78] или просвечивающей электронной микроскопии [51; 79; 80]. Кроме электронной микроскопии, которая не всегда доступна и в некоторых случаях связана с рядом технических трудностей, геометрические параметры острия зонда могут быть оценены методом сканирования данным зондом специального тестового объекта в виде решетки с острыми выступами (Рисунок 1.11). Т.к. изображение поверхности, получаемое при помощи АСМ, является сверткой двух поверхностей [10] – зонда и исследуемого рельефа, форма острия зонда может быть оценена по размеру объектов на снимке (в том случае, когда фактические их параметры заранее известны). Кроме того, сканирование такой «решетки» может использоваться в качестве метода для механической очистки поверхности зонда, которая бывает контаминирована после длительного сканирования [52].

Для силовых измерений важным фактором является расположение целевого объекта на зонде. Для получения достоверных результатов одиночный объект (макромолекула, вирион, наночастица и т.п.) должен быть закреплен на самом острие зонда АСМ, которое контактирует с поверхностью при получении силовых кривых. Для относительно крупных (несколько микрометров) объектов, таких как живые клетки или сферы, применяемые при изготовлении коллоидных зондов, возможно использование микроманипуляторов, совмещенных со световым микроскопом, для визуального совмещения края кантилевера с объектом [12; 81]. Для наноразмерных объектов реализация такого подхода либо технически невозможна, либо требует крайне сложного и дорогого специального оборудования. Описан простой в реализации метод фиксации одиночной наночастицы на острие зонда АСМ [80]. Зонд покрывают защитным слоем и сканированием твердой поверхности формируют площадку, соответствующую диаметру целевой частицы, свободную от защитного слоя (Рисунок 1.12). Затем зонд обрабатывают реактивом, активирующим поверхность для образования ковалентных связей с целевой наночастицей, благодаря защитному слою, при этом активируется только участок поверхности на самом острие, подготовленный сканированием.

Объекты исследований

В работе были задействованы два атомно-силовых микроскопа: Solver P47Bio (NT-MDT, Россия), установленный в лаборатории ультраструктурных исследований ГНЦ ВБ «Вектор» и Nanoscope IV “Picoforce” (Bruker, USA) в лаборатории физики живой материи Федеральной политехнической школы Лозанный (Швейцария).

Микроскоп Solver P47Bio изначально не был оснащен приспособлениями для защиты от вибрации, что приводило к многочисленным искажениям на снимках и колебательным искажением (участки осцилляции) силовых кривых. Была сконструирована и изготовлена простая механическая система виброизоляции, позволившая уменьшить влияние вибрации до уровня шума, вызванного другими факторами (Рисунок 2.1), что соответствует характеристикам коммерческих виброизоляционных систем.

Система виброизоляции микроскопа и пример снимка субнанометровых объектов, полученного с её использованием. Полная высота рельефа – 1,5 нм, размер области сканирования 2,52,5 мкм.

Система состоит из держателя микроскопа, выполненного из стальных пластин и валов, настенного крепления подвеса и упругих элементов, в качестве которых использован спортивный инвентарь «эспандер лыжника». Масса подвешенной части т 30 кг, коэффициент жесткости подвеса к 300 Н/м, собственная частота механических колебаний системы может быть оценена при помощи простого выражения для одномерного пружинного маятника: а = 1 = М ЪГц, (1.14) V т Использование данной системы в течение пяти лет показало высокую эффективность и простоту эксплуатации, рассматривавшийся ранее вопрос о приобретении коммерческой системы был закрыт.

Для визуализации вирионов и зондов АСМ использовали просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ) JEM 1400 (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Кантилевер с зондом АСМ крепится к кремниевому чипу, латеральные размеры которого 31,5 мм и толщина 0,3 мм [10]. ПЭМ не предназначен для работы с такими объектами, и имеющиеся штатные держатели образца допускают работу только со стандартными сетками (d = 3 мм) для электронной микроскопии. Для удержания чипов был разработан и изготовлен специальный наконечник держателя образца, но он оказался неудобен в эксплуатации и для данной задачи был адаптирован серийный держатель (Рисунок 2.2), предназначенный для электронной томографии и допускающий большой угол наклона образца.

Кантилеверы АСМ являются весьма хрупкими объектами и легко разрушаются при случайном механическом воздействии, что требует большой осторожности при выполнении с ними различных манипуляций. Для предотвращения случайной утраты зондов был изготовлен специальный пинцет с пропиленными углублениями, обеспечивающими надежный захват чипа.

Рисунок 2.3. Измерительная ячейка для наблюдения диэлектрофореза. Общий вид, схематическое изображение и скан АСМ (100100 мкм).

Диэлектрофорез вирионов наблюдали на двух типах измерительных ячеек. Ячейки первого типа (Рисунок 2.3) были изготовлены методом нанесения на стеклянную подложку проводящего покрытия с зазором (53 мкм) между электродами [124]. Такие ячейки использовали для наблюдения диэлектрофореза вируса осповакцины. Для получения высоких значений градиента напряженности электрического поля, что важно при работе с малыми частицами [126], была изготовлена ячейка на основе двух зондов АСМ, имеющих золотое покрытие (Рисунок 2.4). На данной ячейке наблюдали диэлектрофорез бактериофага AP22.

Рабочая область измерительной ячейки для наблюдения диэлектрофореза вирусных частиц, выполненной на основе двух проводящих зондов АСМ. Сканирующая электронная микроскопия. При наблюдении диэлектрофореза вирионов в качестве источника переменного электрического тока с частотой от 10 кГц до 10 МГц использовали генератор Г3-112 (Россия). Частоту и амплитуду сигнала контролировали при помощи осциллографа HPS-40 (Vellman, Бельгия).

Диэлектрофорез флуорохромированных вирионов на измерительных ячейках наблюдали при помощи люминесцентного микроскопа ImagerA1 (Carl Zeiss, Германия).

Для экспериментов с белком ЛСБ и поверхностным белком E флавивирусов использовали V-образные зонды АСМ фирмы Bruker (США), изготовленные из нитрида кремния (Si3N4), имеющие номинальное значение силовой постоянной от 0,06 до 1,2 Н/м (на одном чипе смонтировано пять кантилеверов разной жесткости). Значения силовой постоянной для каждого кантилевера определяли методом анализа спектра тепловых колебаний [56], используя встроенную функцию микроскопа.

Для экспериментов с фиксацией одиночных вирусных частиц на острие зонда АСМ использовали кремниевые зонды CSG01 (НТ-МДТ, Россия). Зонды этой же фирмы CSG01/Au, имеющие золотое покрытие, использовали для дополнительных экспериментов с белком ЛСБ, целью которых было исключение возможных артефактов химической природы.

Для модификации поверхности зондов использовали (3-аминопропил)-триэтоксисилан (Sigma, США). и глутаровый альдегид (Sigma, США). Для очистки поверхности зондов [151] использовали свежеприготовленную смесь в соотношении 3:1 концентрированной серной кислоты (ООО «Компонент Реактив», Россия) и перекиси водорода (ОАО «Химреактив», Россия). Защитный слой хрома на поверхность зондов наносили при помощи установки для напыления проводящих покрытий Q150T (Quorum Technologies, Великобритания). Диэлектрофорез проводили в 0,3 М растворе сахарозы (Sigma, США) в деионизованной воде. Для флуорохромирования вирусных частиц использовали флуоресцеин изотиоцианат (FITS, Sigma, США). Эритроциты и бактериальные пленки сорбировали на предметные стекла, покрытые полилизином (Thermo Scientific, США). Силовые измерения проводили в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ) при pH = 7,4 и в цитратно-фосфатном буферном растворе при pH = 5,3.

Изучение сорбции вирионов на поверхности зонда

Применение диэлектрофореза для получения селективного движения частиц основано на зависимости диэлектрофоретической силы, действующей на частицу, от её объема и диэлектрических параметров [115]. Обычно явление диэлектрофореза наблюдают, варьируя частоту приложенного к электродам измерительной ячейки электрического поля [119-125].

Выделяют положительный диэлектрофорез – движение частиц к электродам, отрицательный – движение от электродов, и электроротацию – вращение частицы без поступательного движения [114].

Определив полосу частот, соответствующую желаемому направлению диэлектрофореза для целевых частиц, выбирают рабочую частоту на её нижней или верхней границе в зависимости от диэлектрофоретических свойств частиц других сортов, присутствующих в растворе, от которых хотят отделить целевые частицы [121; 130]. Используя данное значение частоты, получают селективное движение целевых частиц относительно электродов.

Движение клеток и других частиц с диаметром более 1 мкм при диэлектрофорезе на измерительной ячейке обычно наблюдают с помощью классического светового микроскопа [120; 123]. Для субмикронных частиц, к которым относятся вирионы, такое наблюдение затруднительно, а во многих случаях и невозможно по причине ограничения разрешающей способности микроскопа. Одним из способов наблюдения диэлектрофореза для таких объектов является их флуорохромирование и использование техники люминесцентной микроскопии [124-127].

Для флуорохромирования вирионов использовали флуоресцеин изотиоцианат (FITC) [155; 156]. Флуорохромирование проводили в карбонат-бикарбонатном буферном растворе (pH = 9,5): к вирусной суспензии добавляли FITC из расчета 0,1 мг на 200 мкл суспензии и инкубировали 12 часов при температуре 4 C в защищенном от света месте. После этого остаточный флуорохром удаляли из раствора методом диализа против фосфатно-солевого буфера (pH = 7,4).

После диализа вирус переводили в 0,3 М раствор сахарозы в деионизованной воде, используя центрифужные пробирки-концентраторы (Sartorius Vivaspin, Германия) с порогом отсечки по молекулярной массе (MWCO) 300 кДа.

Результат флуорохромирования контролировали методом люминесцентной микроскопии (Рисунок 3.8). В случае отсутствия на снимках одиночных светящихся объектов, подготовку препарата повторяли заново с промежуточным контролем состояния вирионов методом ПЭМ.

Раствор сахарозы является классической средой для диэлектрофореза биологических объектов [119-124]. Вирус осповакцины и бактериофаг AP22 не разрушаются в 0,3 М растворе сахарозы в деионизованной воде, что было подтверждено методом электронной микроскопии.

Флуорохромирование вирионов осуществляли только для определения рабочих значений частот. Для фиксации на зондах и силовых измерений использовали вирус без обработки FITC. Методом наблюдения диэлектрофоретического движения вирионов в измерительной ячейке при помощи люминисцентного микроскопа были определены следующие полосы частот положительного диэлектрофореза при амплитуде напряжения 5 В:

Диэлектрофорез вируса осповакцины проводили на измерительной ячейке (Рисунок 2.3), выполненной методом литографии плоских электродов на стекле с рабочим зазором 53 мкм. Эксперименты с бактериофагом AP22 проводили на ячейке с электродами из двух проводящих зондов АСМ (Рисунок 2.4).

При частоте выше 1000 кГц наблюдалось диффузное свечение флуорохрома в окрестности электродов, которое, вероятно, объясняется положительным диэлектрофорезом для малых клеточных фрагментов и свободных молекул белка, присутствующих в суспензии. Данное предположение соответствует литературным данным [157] о диэлектрофоретических свойствах белков.

Были выбраны следующие рабочие частоты для фиксации вирионов на зондах: 100 кГц для вируса осповакцины и 550 кГц для бактериофага AP22.

Фиксацию вирионов на зондах АСМ проводили следующим образом: на лабораторной пленке Parafilm (США) размещали два чипа с проводящими зондами на расстоянии около 1 мм друг от друга, подключенные к генератору сигналов низкой частоты Г3-112. После включения генератора в область между зондом и электродом помещали каплю (20 мкл) вирусной суспензии и через 1 минуту смывали её струей 0.3 М раствора сахарозы в деионизованной воде, после этого зонд, не допуская высушивания, устанавливали в АСМ с погружением в буферный раствор. Такой алгоритм позволяет избежать влияния переходных процессов в момент включения и выключения источника напряжения. Частоту и амплитуду сигнала контролировали при помощи осциллографа Vellman HPS-40 (Бельгия).

Изучение системы «вирус осповакцины – эритроцит человека»

Методом АСС одиночных вирусных частиц была исследована система «вирион осповакцины – эритроцит человека». Измерения проводились при комнатной температуре в фосфатно-солевом буферном растворе (pH = 7,4).

Осповакцина является гемагглютинирующим вирусом, то есть вирионы способны «склеивать» эритроциты за счет связывания поверхностных белков вируса с рецепторами на поверхности клеток [44].

Данная система может рассматриваться в качестве простой модели для значительно более сложного процесса – начального этапа взаимодействия вируса с клеткой-хозяином – специфической адгезии вириона к поверхности клетки [45].

Фиксация вириона на острие зонда подробно описана в предыдущей главе. Там же приведены примеры электронно-микроскопических снимков зондов АСМ с зафиксированной на острие вирусной частицей. После силовых измерений зонды визуализировали методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) для подтверждения наличия вириона (Рисунок 3.9).

Эритроциты сорбировали на стекле, покрытом полилизином (Thermo, Германия), после чего поверхность обильно промывали буферным раствором, благодаря этому, в рабочей области оставался лишь монослой клеток, надежно удерживаемых адгезией к полилизину. Измерения проводили сразу же после подготовки зонда и монослоя эритроцитов.

Монослой эритроцитов наблюдали при помощи инвертированного светового микроскопа, совмещенного с АСМ (Solver P47Bio, NT-MDT, Россия), и визуально наводили кантилевер на клетки. Подведя зонд к поверхности на рабочее расстояние (около 500 нм), запускали получение силовых кривых в автоматическом режиме (100 точек на квадрат 1010 мкм). Выбор размера рабочей области и шага сетки продиктован размерами вириона (около 350 нм) и значительной неоднородностью рельефа поверхности монослоя клеток.

Около 60% полученных кривых содержали участки, соответствующие специфическому взаимодействию. Получение кривых вели в режиме постоянной скорости перемещения вертикального сканера микроскопа с амплитудой 1000 нм и периодом 1 секунда.

При резком изменении амплитуды участка изучаемого взаимодействия на силовых кривых измерения прекращали, считая, что поверхность вириона деградировала или контаминирована. В среднем до наступления данного события успевали получить до 300 силовых кривых (Рисунок 4.7).

Величина силы, соответствующая отрыву зонда от поверхности монослоя клеток в том случае, когда после электронно-микроскопической визуализации на острие был обнаружен вирион, была соизмерима с той, которая наблюдалась для зондов, на которых вирион отсутствовал. При этом силовые кривые значительно отличались формой участка, соответствующего изучаемому взаимодействию: для кривых с вирионом наблюдалась область деформации длиной 3060 нм, предшествовавшая отрыву. В том случае, когда вирион на зонде отсутствовал, скачок на кривой был резким.

Добавление к раствору глицирризиновой кислоты (ГК) до расчетной концентрации 0,05 и 0,1 ммоль/л не приводило к изменению амплитуды сил отрыва и вида силовых кривых. Раствор ГК в буферном растворе вводили в ячейку, в которой проводили измерения, при помощи шприца, силовые кривые получали после паузы в 10 минут.

При измерениях, выполненных через 10 минут после добавления раствора ГК до расчетной концентрации 0,5 ммоль/л, наблюдалось резкое изменение формы силовых кривых и уменьшение величины силы, соответствующей отрыву (Рисунок 4.8).

Для более высоких значений концентрации силовые измерения провести не удалось, т.к. при концентрации ГК равной 1 ммоль/л эритроциты начинали самопроизвольно отрываться от подложки через минуту после введения ГК.

Силовые кривые были обработаны с извлечением пиковых значений силы, соответствующих событиям отрыва, результаты представлены в виде гистограмм (Рисунок 4.9). Рисунок 4.9. Результаты силовых измерений для системы «вирус осповакцины – эритроцит человека» в формате гистограмм. Подтверждено наличие вириона на зонде (А). Вирион отсутствовал (Б). Измерения с подтвержденным наличием вириона в присутствии ГК (В). Наличие резкого «выброса» в правой части гистограммы для измерений без ГК с подтверждением наличия на зонде вириона, возможно, объясняется попаданием вириона в пространство между несколькими эритроцитами с соответствующим «защемлением» при большой площади контакта поверхностей. Отсутствие таких результатов для измерений в присутствии ГК может объясняться влиянием ГК на механические свойства цитоскелета и мембраны эритроцитов, приводящем к значительному снижению величины модуля Юнга для данных систем [162].

Результаты измерений (Таблица 4.2) показывают редуцирующее действие ГК на адгезию вириона осповакцины к поверхности эритроцита. Кроме того, данные эксперименты показали принципиальную возможность использования разработанной методики для изучения влияния химических агентов на адгезию вирионов к поверхности клетки.

С использованием метода АСС одиночных вирусных частиц была исследована система «бактериофаг AP22 – A.baumannii». Измерения проводились для двух штаммов A.baumannii – восприимчивого к данному бактериофагу A.baumannii 1053 и резистентного A.baumannii B05.

Фиксация фаговых частиц на острие зонда подробно описана в предыдущей главе. Там же приведены примеры электронно-микроскопических снимков зондов АСМ с зафиксированной на острие частицей. После силовых измерений зонды визуализировали методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) для подтверждения наличия вириона (Рисунок 3.9).

Бактерии сорбировали на стекле, покрытом полилизином (Thermo, Германия) в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего поверхность обильно промывали буферным раствором. Измерения проводили сразу же после подготовки зонда и микробной пленки.

Микробную пленку наблюдали при помощи инвертированного светового микроскопа, совмещенного с АСМ (Solver P47Bio, NT-MDT, Россия). Подведя зонд к поверхности на рабочее расстояние (около 500 нм), запускали получение силовых кривых в автоматическом режиме (400 точек на квадрат 2020 мкм).

Целью данного исследования была проверка гипотезы об отличии силы адгезии фаговой частицы к поверхности бактерии для восприимчивого и резистентного штаммов одного вида.

Измерения проводили при комнатной температуре в фосфатно-солевом буферном растворе при pH = 7,4. Силовые кривые получали до момента резкого изменения их формы или уменьшения величины силы, соответствующей отрыву зонда от поверхности.

Участки, соответствующие специфическому взаимодействию, наблюдались на 20% полученных силовых кривых отрыва. Кривые подвода не содержали особенностей. Результаты измерений (Таблица 4.3) свидетельствуют о том, что сила адгезии значительно отличается для восприимчивого и резистентного штаммов A.baumannii (Рисунок 4.10). Полученные силовые кривые имели вид, типичный для специфического взаимодействия, и содержали выраженный участок растяжения, предшествующий событию отрыва (Рисунок 4.11).