Содержание к диссертации
Введение
1. Система транспорта ионов калия в митохондриях 13
1.1. Физиологическое значение транспорта К+ в митохондриях 14
1.2. Молекулярные структуры, ответственные за транспорт К+ в митохондриях 15
1.3. Митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал как компонент системы транспорта К+ 1.3.1. Биофизические свойства и структурная организация митоКлтФ IV
1.3.2. Метаболические и фармакологические модуляторы митоКлтФ
2. Гипоксия и митохондриальные механизмы адаптации, связанные с образованием активных форм кислорода 29
3. Функциональная роль МИТОКАТФ В физиологических и патологических состояниях, связанных с развитием гипоксии
3.1. Участие МИТОКАТФ В физиологических процессах 35
3.2. Участие МИТОКАТФ В адаптации организма к гипоксии
3.2.1. Роль митоКлтФ в механизмах кардиопротекции 38
3.2.2. Возможные механизмы кардиопротекции, опосредованные митоКлтФ 43
3.2.3. Роль митоКлтФ в нейропротекции 45
Материалы и методы 49
1. Реагенты 49
2. Линии животных, использованные в исследовании
2.1. Линия животных Август 49
2.2. Линия крыс Крушинского-Молодкиной 49
3. Типирование животных по чувствительности к гипоксии 50
4. Адаптация животных к гипоксии. 51
5. Выделение митохондрий из ткани печени крыс 51
6. Выделение митохондрий из ткани сердца крысы... 52
7. Выделение митохондрий из ткани мозга крысы 52
8. Определение концентрации белка методом Лоури .53
9. Изучение энергозависимого входа К+ в митохондрии методом спектрофотометрии .53
10. Полярографическое измерение скорости потребления кислорода и определение параметров дыхания митохондрий .54
11. Определение скорости образования перекиси водорода в митохондрия 55
12. Исследование АТФ-зависимого ДНФ-индуцированного выхода К+ из митохондрий при помощи К+-селективного электрода... 55
13. Определение количестваК+ в митохондрия 56
14. Оценка содержания малонового диальдегида в митохондриях крыс 56
15. Изучение морфологических изменений в митохондриях с помощью электронной микроскопи 57
16. Оценка выносливости крыс к физической нагрузке... 57
17. Статистическая обработка данны 57
Результаты и обсуждение 58
ГЛАВА 1. Изучение АТФ-зависимого К+ транспорта и скорости образования перекиси водорода в митохондриях крыс с различной устойчивостью к гипоксии 58
1.1. Изучение митохондриального АТФ-зависимого К+ транспорта у крыс с различной устойчивостью к гипокси 59
1.2. Измерение продукции Н2О2 митохондриями устойчивых и неустойчивых к гипоксии крыс... 61
1.3. Параметры К+ обмена в митохондриях неустойчивых к гипоксии крыс,
адаптированных к условиям с низким содержанием кислород 62
ГЛАВА 2. Окислительное фосфорилирование и транспорт ионов калия в митохондриях крыс линий Август и Вистар с различной устойчивостью к стрессу и гипокси 66
2.1. Измерение параметров дыхания митохондрий исследуемых линий крыс.. 66
2.2. Энергозависимый транспорт ионов калия в митохондриях крыс Август и Вистар 69
2.3. Скорость образования перекиси водорода в митохондриях печени крыс Август и Вистар в условиях активации и ингибирования МИТОКДТФ канала 70
ГЛАВА 3. Изучение АТФ-зависимого транспорта К+ и образования активных форм кислорода в митохондриях мозга и печени крыс при экспериментальной аудиогенной эпилепсии (модель Крушинского-Молодкиной) 73
3.1. Определение параметров дыхания и фосфорилирования митохондрий крыс в модели аудиогенной эпилепсии 74
3.2. Оценка скорости образования перекиси водорода в митохондриях мозга и печени исследуемых групп крыс.. 76
3.3. Определение концентрации малонового диальдегида в митохондриях исследуемых групп крыс .77
3.4. Определение параметров транспорта ионов калия в митохондриях мозга и печени крыс в модели аудиогенной эпилепсии
3.4.1. Энергозависимый вход 1С в митохондриях исследуемых групп животны 80
3.4.2. ДНФ-стимулируемый транспорт 1С в митохондриях исследуемых групп кры 80
3.4.3. Оценка содержания 1С в митохондриях исследуемых групп кры 81
ГЛАВА 4. Изучение роли митохондриального АТФ-зависимого К+ канала в формировании выносливости животных к повышенным физическим нагрузкам 83
4.1. Оценка влияния природного активатора МИТОКАТФ канала in vivo на формирование выносливости крыс к повышенной физической нагрузке 83
4.2. Изучение энергозависимого транспорта К+ и оценка его количества в митохондриях исследуемых групп крыс 85
ГЛАВА 5. Доказательство участия митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала в циклическом транспорте К в митохондриях 88
5.1. Регистрация циклического транспорта К+ в митохондриях печени крыс 88
5.2. Влияние модуляторов калиевых каналов на циклический транспорт К+ в митохондриях печени крыс 90
5.3. Выявление морфологических изменений в митохондриях на разных этапах циклического транспорта К+ 91
Заключение 94
Список литературы
- Метаболические и фармакологические модуляторы митоКлтФ
- Возможные механизмы кардиопротекции, опосредованные митоКлтФ
- Изучение энергозависимого входа К+ в митохондрии методом спектрофотометрии
- Измерение продукции Н2О2 митохондриями устойчивых и неустойчивых к гипоксии крыс...
Введение к работе
Актуальность проблемы. АТФ-зависимые калиевые каналы цитоплазматической и митохондриальной мембран изучаются довольно интенсивно в последние 25 лет. Митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал (митоКАТФ) впервые был обнаружен в митохондриях млекопитающих в начале 90-х годов [Inoue et al., 1991; Paucek et al., 1992]. Позже он был идентифицирован в митохондриях растений [Pastore et al., 2007; Matkovic et al., 2011], насекомых [Slocinska et al., 2013], нематод [Wojtovich et al., 2008], трипаносоматид [Costa & Krieger, 2009] амёбозой [Kicinska et al., 2007] и дрожжей [Sukhanova et al., 2012]. Однако следует отметить, что белок, обладающий свойствами митоKАТФ, выделен из внутренней мембраны митохондрий значительно раньше, чем данный канал был обнаружен в мембране методом пэтч-кламп [Миронова и др., 1981]. В дальнейшем было установлено, что при реконструкции в БЛМ этот белок ингибируется физиологическими концентрациями АТФ [Paucek et al., 1992; Миронова и др., 1996 (I)]. Основную функцию митоКАТФ связывают с регуляцией объёма митохондрий, что оказывает влияние на синтез АТФ, дыхание митохондрий, окисление жирных кислот и несократительный термогенез [Halestrap et al., 1989, Fedotcheva & Mironova, 1985].
Так как было установлено, что митоKАТФ играет ключевую роль в защите миокарда от ишемии, в настоящее время его стали интенсивно изучать во многих лабораториях [McCullough et al., 1991; Gross G. et al., 1992; Grover et al., 1994; Garlid et al., 1997; Vanden Hoek, 2000]. При введении животным фармакологических активаторов митоКАТФ непосредственно перед продолжительной ишемии наблюдается эффект, подобный ишемическому прекондиционированию (сокращение зоны инфаркта и восстановление ритма сердца), при этом введение животному ингибитора канала предотвращает это положительное воздействие [Gross et al., 1992; Liu et al., 1998; Tsai et al., 2002; Krylova et al, 2006]. Существуют данные о том, что митохондриальные калиевые каналы, в том числе митоKАТФ, являются триггерами и конечными эффекторами при нейропротекции [Yang et al., 2006; Robin et al., 2011; Busija et al., 2008, 2016; Gaspar et al., 2008]. Однако механизм кардио- и нейропротекции под влиянием активаторов канала до сих пор не вполне понятен и требует дальнейшего изучения.
В последнее время во многих лабораториях мира ведется поиск эффективных метаболических активаторов митоКАТФ. В нашей лаборатории был обнаружен эффективный метаболический активатор митоКАТФ – уридин-5’-дифосфат (УДФ) [Mironova et al., 2004]. На модели острого инфаркта миокарда у крыс показано антиишемическое действие его предшественников – уридина и уридин-5’-монофосфата (УМФ) [Krylova et al., 2006, 2012].
На основании работ с введением активаторов митоКАТФ было сделано предположение, что открытие канала приводит к ускорению транспорта K+ и снижению потенциала внутренней мембраны митохондрий (m). В
экспериментах in vitro показано, что снижение m способствует уменьшению образования активных форм кислорода (АФК), которые являются патогенным началом при многих заболеваниях [Korshunov et al., 1997].
В связи с вышесказанным, выяснение механизма антигипоксического действия митоКАТФ требует проведения исследований, касающихся сравнения активности канала и скорости образования АФК у животных в норме и при развитии гипоксии как в физиологических условиях, так и при патологии.
Цель исследования: провести сравнительные исследования АТФ-зависимого транспорта К+ и скорости образования Н2О2 в митохондриях крыс на различных моделях устойчивости к гипоксии и изучить возможность коррекции гипоксии метаболическим активатором митоКАТФ.
Основные задачи исследования:
-
Изучить АТФ-зависимый транспорт К+, скорость образования Н2О2 и сопряжённое с фосфорилированием дыхание в митохондриях сердца и печени неинбредных крыс с различной устойчивостью к острой гипобарической гипоксии, а также крыс линий Август и Вистар, генетически отличающихся по резистентности к гипоксии.
-
Исследовать АТФ-зависимый транспорт К+ и скорость образования Н2О2 в митохондриях мозга и печени крыс в экспериментальной модели аудиогенной эпилепсии, характеризующейся развитием окислительного стресса.
-
Изучить влияние уридина, предшественника метаболического активатора митоKАТФ, на активность канала и устойчивость животных к физической нагрузке в экспериментах in vivo.
4) Изучить роль митоKАТФ в циклическом транспорте К+ в митохондриях.
Новизна исследования. Обнаружено, что устойчивость животных к
гипоксии связана с активностью митоКАТФ. Впервые установлено, что при аудиогенной эпилепсии активность митоКАТФ снижена и стремится к восстановлению через двое суток после создания у животных судорог. На четырёх экспериментальных моделях животных с разной устойчивостью к гипоксии впервые установлена противоположная направленность изменения активности митоКАТФ и скорости образования Н2О2 в митохондриях сердца, мозга и печени. Впервые установлено антигипоксическое действие активации канала в модели плавания животного до изнеможения. В экспериментах in vivo впервые обнаружено, что введение животным уридина (предшественника активатора митоКАТФ – УДФ), увеличивает как активность канала в митохондриях, так и время плавания животного с нагрузкой. Получены экспериментальные доказательства участия митоКАТФ в циклическом транспорте ионов калия в митохондриях.
Научно-практическое значение работы. На основании полученных данных предположено, что предшественник метаболического активатора митоКАТФ, – уридин, может быть использован для профилактики и лечения заболеваний, связанных с развитием гипоксии. Предложенный в работе механизм защитного действия митоКАТФ может быть использован для разработки методов профилактики судорожных состояний при эпилепсии.
Показанный в работе адаптогенный эффект уридина открывает перспективу его использования для формирования долгосрочной толерантности организма к гипоксическим условиям. Выявленная в работе противоположная направленность изменения активности митоКАТФ и скорости образования Н2О2 в митохондриях мозга, сердца и печени, будет способствовать пониманию механизма антигипоксического действия активаторов митоКАТФ.
Положения диссертации, выносимые на защиту. Исследования механизмов различной устойчивости организма к гипоксии выявили существование противоположной направленности изменения активности митоKАТФ канала и скорости образования АФК в изолированных митохондриях. Активация митоKАТФ канала, и, вслед за этим, циклического транспорта K+, способствуют снижению потенциала на внутренней мембране митохондрий и приводят к уменьшению образования в них АФК, что, в свою очередь, играет положительную роль в защите тканей от гипоксии. Данный механизм может определять адаптивные эффекты активаторов канала.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих научных конференциях: «RAD 2015 - Third International Conference on Radiation & Applications in Various Fields of Research», 8 – 12 June, 2015, Budva, Montenegro; International conference «MipTec 2014: The Leading European Event for Drug Discovery «Translating Science into Drugs», 23 – 25 September 2014, Basel, Sweatzeland; International conference of young scientists «Mitochondrial pores and channels as pharmacological targets», 29 – 30 октября 2014, Пущино; Х Международный Симпозиум «Биологическая подвижность: новые факты и гипотезы», 11 – 15 мая 2014, Пущино; International conference «Science of the Future», 17 – 20 сентября 2014, Санкт-Петербург; Международная конференция молодых учёных «Экспериментальная и теоретическая биофизика», 21 – 23 октября 2013, Пущино; MiP 2013 – 9th Conference Mitochondrial Physiology, 23 – 27 September 2013, Obergurgl, Tyrol, Austria; Международная конференция «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», 27 – 30 мая 2013, Пущино; 17-я Международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука ХХI века», 22 – 26 апреля 2013, Пущино; IV Cъезд биофизиков России, 20 –26 августа, 2012, Нижний Новгород; 15-я Международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука ХХI века», 18 – 22 апреля 2011, Пущино; MiP 2011 – 8-th Conference Mitochondrial Physiology, 5 – 8September 2011, Bordeaux, France; 6-ая Российская конференция с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» 11 – 13 октября 2011, Москва; Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Дни биохимии в Санкт-Петербургском государственном медицинском университете», 13 – 15 марта 2011, Санкт-Петербург.
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 статей в зарубежных и отечественных журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК РФ, и 15 тезисов в материалах конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 123 страницах, иллюстрирована 14 таблицами и 21 рисунком.
Метаболические и фармакологические модуляторы митоКлтФ
Основное физиологическое значение транспорта К+ в митохондриях связывают с регуляцией объема митохондриального матрикса. Объем митохондрий определяется калиевыми токами через внутреннюю мембрану. Когда вход и выход К+ находятся в равновесии, калиевые потоки определяются электронейтральным током анионов и осмотически облигатной воды [Garlid, 1988]. Так как концентрация ионов калия в матриксе и в цитоплазме практически одинаковая и находится пределах 100-140 мМ, транспорт калия мало влияет на матриксную концентрацию калия, но может иметь большое влияние на объем митохондрий. Небольшое нескомпенсированное увеличение входа К+ в митохондрию может удваивать их объем в течение 1-2 минут [Garlid, 1979], что в итоге стимулирует активность дыхательной цепи [Nicholls et al., 1972; Halestrap, 1989]. К изменению объема матрикса также чувствительны некоторые физиологические процессы, например, окисление жирных кислот [Halestrap, 1987]. Также изменение объема митохондрий имеет значение в регуляции митохондриальных процессов у гибернирующих животных [Fedotcheva et al., 1985; Бакеева и Брустовецкий, 1993] и при адаптации животных к холоду [Nedergraard & Cannon, 1987]. Ранее в нашей лаборатории было показано, что активация транспорта К+ в митохондриях бурой жировой ткани и печени прямо коррелирует с активацией термогенеза и увеличением теплопродукции до начала синтеза АТФ в этих тканях при выходе животного из спячки [Федотчева и др., 1984; Миронова и др., 1986, Скарга, 1994].
Показано, что активация транспорта К+ может оказывать влияние на продукцию активных форм кислорода (АФК) в митохондриях [Garlid et al., 2003а; Ferranti et al., 2003], увеличение концентрации которых связывают с возникновением различных патологических процессов (сердечно-сосудистые заболевания, катаракта, возрастные иммунодепрессия и дисфункция мозга и некоторые другие).
Основной системой, осуществляющей вход К+ в митохондрии, является митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал, который был обнаружен во внутренней мембране митохондрий в 1991 г. методом пэтч-кламп [Inoue et al., 1991]. Следует отметить, что в лаборатории Мироновой в 1981 г. из митохондрий сердца быка методом водно-этанольной экстракции был выделен и очищен белок с м.м. 55 к Да, который при реконструкции в бислойные липидные мембраны (БЛМ) образовывал К+-селективные каналы проводимости [Миронова и др., 1981]. Позднее, в совместных исследованиях с лабораторией проф. Гарлида (США), было показано, что они ингибируются физиологической концентрацией АТФ и глибенкламидом, и относятся к семейству АТФ-чувствительных калиевых каналов [Миронова и др., 1996 (I); Mironova et al., 1999].
Существуют данные о том, что транспорт К+ в митохондриях может осуществляться посредством АТФ/АДФ-антипортера или аденинуклеотидтранслоказы (АНТ) [Panov et al., 1980; Le Quoc et al., 1988]. В этом случае предполагается, что АНТ, помимо основных функций, может работать как система электрофоретического транспорта ионов калия в митохондриях при действии на него субмикромолярных концентраций ионов кальция, а также как неспецифическая пора для низкомолекулярных соединений при повреждении митохондрий высокими концентрациями Са2+ [Jung & Brierley, 1981; 1982; Halestrap et al., 1986].
Также было показано, что во внутренней мембране митохондрий присутствуют Са2+-активируемые калиевые каналы (митоКса) с проводимостью 295 ±18 пСм в присутствии 150 мМ КС1, которые активируются при повышении концентрации Са2+ в среде [Siemen et al., 1999, Xu et al., 2002]. В настоящее время известно несколько видов Са2+-активируемых калиевых каналов. Са2+-активируемые калиевые каналы большой проводимости (ВКса или Кса11) [Xu et al., 2002] могут вносить существенный вклад в общий транспорт К+ в митохондриях, а также, возможно, играют роль в защите миокарда от ишемических повреждений. Однако недавно с использованием коммерчески доступных антител получены данные о том, что порообразующая ВКса а-субъединица присутствует в гомогенате мозга, но не обнаружена в изолированных митохондриях или в митохондриально обогащенных образцах [Gaspar et al., 2008]. Помимо ВКса относительно недавно в клетках Hela и эмбриональных фибробластах были обнаружены кальций чувствительные калиевые каналы промежуточной проводимости 1Кса или Кса3.1 [Sassi et al., 2010]. Их молекулярный вес такой же как у 1Кса каналов, локализованных на плазматической мембране, предполагая эквивалентные биофизические и фармакологические свойства. Однако физиологическая роль митоІКса пока не ясна. Известно, что в митохондриях сердца эти каналы пока не обнаружены. Также, совсем недавно, с помощью иммуноэлектронной микроскопии на внутренней мембране сердечных митохондрий морской свинки и в митохондриях нервных клеток были обнаружены кальций чувствительные калиевые каналы малой проводимости (SKca). Авторы данного исследования приводят доказательства того, активация SKca может иметь значение в кардиопротекции [Dolga et al., 2013].
Другим компонентом системы циклического транспорта ионов калия является К+/Н+- антипортер. Функцию К7Н+- обменника, как предполагают в лаборатории проф. Гарлида, выполняет белок с м.м. 82 кДа, осуществляющий выброс К+ из митохондрий [Li X. et al, 1990; Garlid & Paucek, 2001, 2003]. Предполагается, что K+/H+- антипортер активируется при набухании матрикса в результате входа К+ в митохондрии, регулируя, таким образом, объем митохондрий. При этом внешняя митохондриальная мембрана не препятствует дальнейшему обмену небольшими ионами с цитоплазмой.
Митохондриальный АТФ-зависимый калиевый канал как компонент системы транспорта К Электрогенный выброс протонов электрон-транспортной системой генерирует мембранный потенциал, который, в свою очередь, стимулирует диффузию К+ в матрикс митохондрии («утечка калия» или К+ leak) и вход иона, опосредованный специфическим калиевым каналом. Такой обмен Н+ на К+ подщелачивает матрикс, вызывая вход фосфата по электронейтральному Фн-Н+ симпортеру (Фн - неорганический фосфат). Вход К+ сопровождается накоплением осмотически облигатной воды, что проявляется в набухании митохондрий. Излишнее их набухание может угрожать целостности этих органелл, следовательно, избыток К+ необходимо удалять. Эту функцию выполняет белок с м.м. 82 кДа - К7Н+-антипортер [Brierley, 1976; Garlid et al, 1980; 1988]. Важно, что вход К+ путем диффузии слишком мал, чтобы существенно влиять на изменение объема матрикса митохондрий. Интенсивный вход ионов калия в митохондрию обеспечивается специфическими белками [Mironova et al., 1981; Diwan et al., 1988; Paucek et al., 1992]. Основным белковым каналом, осуществляющим транспорт К+ в матрикс, по нашему мнению, является митоК АТФ
При активации МИТОКДТФ кратковременно сдвигается баланс между входом и выходом К+, что приводит к набуханию митохондрий. Это набухание индуцирует активацию К+/Н+- антипортера и дальнейшую стабилизацию скоростей входа и выхода К+ в митохондриях [Schdnfeld et al., 2003].
Возможные механизмы кардиопротекции, опосредованные митоКлтФ
Основной участок связывания АТФ в ЦИТОКАТФ канале локализован на канальной субъединице, а регуляторная субъединица повышает сродство канальной субъединицы к АТФ и обеспечивает чувствительность целого канала к активаторам и ингибиторам [Tucker et al., 1997]. Результаты исследований МИТОКДТФ подтверждают предположение о том, что белок с м.м. 55 кДа является канальной субъединицей целого МИТОКДТФ. Функцию регуляторной субъединицы выполняет, вероятно, белок с м.м. 63 к Да, связывающийся с меченым глибенкламидом [Bajgar et al, 2001]. Белок с молекулярной массой 63 кДа, последовательность которого не определена, может соответствовать "короткой" SUR изо форме. Идея, что альтернативные формы могут быть вовлечены в формирование МИТОКДТФ, имеет экспериментальное подтверждение. KIR6.2 и SUR2A или короткие формы последней были идентифицированы в митохондриях желудочковых миоцитов [Singh et al., 2003] и мозга [Lacza et al., 2003] с помощью иммунофлюоресценции и Вестерн-блоттинга. Были выявлены сплайсинговые короткие формы SUR2A 28-, 55- и 68 кДа (в дополнение к длинной форме) и форму 55-кДа SUR2B в очищенных митохондриях сердца мыши [Ye et al., 2009]. Интересно отметить, что белок с м. м. 28 кДа, связывающий глибенкламид с низким сродством, обнаружен в митохондриях сердца быка [Szewczyk et al., 1997; Szewczyk et al., 1999]. Короткие формы SUR были найдены в митохондриях и в других исследованиях [Lacza et al., 2003; Pu et al., 2008; Singh et al., 2003; Szewczyk et al., 1997]. Недавние исследования доказывают вовлеченность SUR1 в механизмы кардиопротекции, опосредованные МИТОКДТФ каналом, что подтверждает её присутствие в структуре канала [Sellitto et al., 2010; Anastacio et al., 2013].
Однако существуют исследования, которые противоречат точке зрения о том, что МИТОКДТФ образован KIR-SUR комплексом. У С. Elegans, подвергаемых «ишемическому прекондиционированию», оценка набухания очищенных митохондрий показывает поведение, совместимое с наличием МИТОКАТФ каналов с фармакологическим профилем, аналогичным описанному у млекопитающих [Wojtovich et al., 2008]. Удаление любого или всех трех KIR-кодирующих генов у С. Elegans незначительно влияло на обусловленный прекондиционированием защитный фенотип. Кроме того, мутантные митохондрии (в том числе, лишенные всех трех генов) показали почти нормальную активность МИТОКАТФ канала [Wojtovich et al., 2010].
Также была предложена другая модель субъединичной организации МИТОКАТФ [Ardehali & O Rourke, 2005]. Были получены доказательства в поддержку идеи, что KIR1.1 (ROMK) представляет собой пороформирующую субъединицу МИТОКАТФ [Foster et al., 2012]. ROMK - это АТФ-чувствительные каналы, и, следовательно, разделяют другие характеристики с КАТФ каналами, в том числе, блокирование Mg2+ и способность связываться с такими белками ABC, как CFTR и SUR2B. Показано, что ROMK канал, который, как правило, экспрессируется на поверхности мембраны в клетках почек, локализован на внутренней мембране митохондрий сердца и опосредует АТФ-чувствительный К+ поток, что дает защиту от стимулов клеточной гибели. Это наблюдение привело к предположению, что MHTOROMK может представлять собой пороформирующую субъединицу МИТОКАТФ [Foster et al., 2012]. В недавних экспериментах на изолированных митохондриях сердца и кардиомиоцитах мышей с TPN-Q (производным токсина медоносной пчелы), который является ингибитором ROMK, было показано, что KIR1.1, вероятно, входит в структуру МИТОКАТФ, НО, при этом активация канала диазоксидом связана с SUR1 [Henn et al., 2015]. Таким образом, вопрос о структуре МИТОКАТФ канала, по-прежнему, остро стоит перед учеными и требует дальнейшего изучения.
Известно, что активация МИТОКАТФ посредством различных модуляторов способна приводить к кардиопротекторным эффектам. В настоящее время во многих лабораториях ведется поиск новых природных и синтетических активаторов канала, которые могут быть потенциальными кардиопротекторами [Kopustinskiene et al., 2001; Ockaili et al., 2002; Krylova et al., 2006; Миронова и др., 2007].
МИТОКДТФ канал, как и все КАГФ каналы, ингибируется физиологическими концентрациями АТФ. Было показано, что при реконструкции в липосомы МИТОКДТФ канала, выделенного методом тритоновой экстракции, он ингибируется АТФ с Ki = 39 дМ, причем ингибирование наблюдалось только в присутствии двухвалентных катионов Mg2+ или Са2+ [Paucek et al, 1992]. При выделении канальной субъединицы методом этанольной экстракции и встраивании ее в БЛМ наблюдалось ингибирование АТФ в концентрации 1-3 мМ, которое не требовало присутствия Mg2+ [Миронова и др., 1996 а].
Было установлено, что ионы Mg2+, необходимые для гидролиза АТФ, не обязательно должны присутствовать при ингибировании канальной субъединицы [Mironova et al., 2004]. Это означает, что ингибирование МИТОКДТФ осуществляется за счет связывания АТФ с самим каналом, а не за счет фосфорилирования белка.
Существуют противоречивые данные, касающиеся локализации сайта связывания АТФ с МИТОКДТФ каналом. Некоторые исследователи считают, что он находится на обращенной в сторону матрикса части белка-канала [Inoue et al., 1991; Baranova et al., 2000]. Следовательно, для ингибирования МИТОКДТФ АТФ должен транспортироваться внутрь митохондрий, где и происходит его связывание с каналом. В связи с тем, что в клетке и митохондриях концентрация АТФ высока, предполагается наличие метаболического активатора, необходимого для открытия МИТОКДТФ . Было установлено, что таким физиологическим активатором может быть ГДФ [Grigoriev et al., 1999; Mironova et al., 1999]. Данные по его активирующему действию в дальнейшем были подтверждены и другими исследователями [Bednarczyk et al., 2005].
Недавно в нашей лаборатории было показано, что в ряду дифосфонуклеотидов наиболее эффективным является уридиндифосфат (УДФ) [Mironova et al., 2004], который в микромолярных концентрациях активирует МИТОКАІФ, тогда как для активации ЦИТОКАТФ нужны значительно более высокие концентрации УДФ [Alekseev et al., 1998]. Реконструированный в БЛМ К+-транспортирующий белок с м.м. -55 кДа после ингибирования АТФ полностью реактивируется 20 дМ УДФ (Рис. ЗА). В интактных митохондриях, где присутствуют обе субъединицы МИТОКДТФ, канал активируется теми же концентрациями УДФ, и эта активация снимается глибенкламидом и 5-ГД (Рис. ЗБ) [Mironova et al., 2004]. Следовательно, участок связывания УДФ локализуется на канальной субъединице.
Изучение энергозависимого входа К+ в митохондрии методом спектрофотометрии
Результаты, полученные в настоящей работе, позволяют предположить, что активность МИТОКАГФ генетически детерминирована. У крыс, генетически устойчивых к гипоксии, скорость АТФ-зависимого К+ притока в митохондрии примерно в 1,5-2 раза выше, чем у чувствительных к гипоксии животных (Рис. 4). Кроме ТОГО, уСТОЙЧИВЫе КрЫСЫ ИМеЮТ более НИЗКОе Значение Ki/2 для АТФ (Таблица 3). Это может означать, что имеются различия в структуре МИТОКДТФ у устойчивых и неустойчивых животных. Эти два типа животных также различаются по количеству К+ в митохондриях (Рис.6). Более высокий уровень активности МИТОКДТФ у устойчивых крыс подтверждается также различной степенью МИТОКАТФ -зависимой генерацией Н2О2 в митохондриях этих двух групп животных. Согласно литературным данным, добавление АТФ к митохондриям сопровождается увеличением производства Н2О2 [Ferranti et al., 2003]. Авторы данной публикации, которые экспериментировали со специфическими модуляторами МИТОКДТФ, пришли к выводу, что эффект АТФ реализуется через закрытие МИТОКДТФ, И канал, таким образом, контролирует скорость продукции Н2О2 в митохондриях. Скорость АТФ-зависимого Н2О2 накопления в митохондриях сердца устойчивых животных в два раза превышает скорость этого процесса у неустойчивых (Рис.7). Эти результаты хорошо согласуются с приведенными выше данными об активации митохондриального АТФ-зависимого К+ транспорта у устойчивых к гипоксии животных.
Следует отметить, что различия скоростей митохондриального энергозависимого К+ транспорта у устойчивых и неустойчивых крыс более очевидны при использовании НАД-зависимых субстратов, по сравнению с отличиями, полученными при использовании сукцината (Рис. 4). Это указывает на прямую связь активностей МИТОКДТФ И комплекса I (но не комплекса II), что согласуется с литературными данными [Portenhauser et al., 1971].
Еще одним важным выводом этой части работы являются результаты, указывающие на тканевую специфичность МИТОКДТФ. Независимо от используемого метода и степени толерантности животных к гипоксии, АТФ-зависимый транспорт К+ и скорость АТФ- зависимой продукции Н2О2 в митохондриях сердца выше, чем в печени (Рис. 4, 5, 7), что согласуется с литературными данными [Ferranti et al., 2003]. Значения Кш для АТФ в митохондриях сердца и печени также различны: в сердце они существенно ниже, чем в печени (Таблица 3). Эти различия показывают, что активность МИТОКДТФ В митохондриях сердца выше, чем в органеллах печени и, возможно, также означают тканеспецифичные различия в регулировании канала. Тканевая специфичность МИТОКАТФ была также обнаружена ранее в нашей лаборатории иммунохимически [Скарга и др., 1987].
Установлено, что длительная адаптация неустойчивых крыс методом прерывистой нормобарической гипоксии изменяет активность МИТОКАГФ у этих животных, что проявляется в увеличении скорости митохондриального АТФ-зависимого транспорта К+ почти до уровня, наблюдающегося у устойчивых животных (Рис. 4 и 5). В то же время, количество К+ в митохондриях сердца и печени адаптированных животных не возрастает, а напротив, даже снижается по сравнению с исходным уровнем этого показателя у устойчивых крыс (Рис. 6). Полученные данные позволяют предположить, что активация притока К+ в процессе адаптации животных к гипоксии компенсируется ускорением их выхода, вероятно, из-за активации К+/Н+ обмена, что согласуется с полученными ранее данными [Garlid & Paucek 2003]. Это соответствует предыдущим работам, в которых показано, что энергозависимый приток К+ в митохондрии сопровождается быстрой активацией электронейтрального оттока иона в обмен на протон [Schonfeld et al., 2003; Shalbuyeva et al., 2006].
Исходя из результатов, можно предположить, что не только МИТОКАГФ, НО И К+/Н+ система обмена участвует в механизмах, лежащих в основе постепенной адаптации организма к гипоксии. Адаптация, вероятно, сопровождается повышенным оттоком К+ из митохондрий и приводит к так называемому «мягкому» разобщению, которое, как известно, в экспериментах in vitro способствует снижению скорости продукции АФК в митохондриях [Korshunov et al., 1997; Ferranti et al., 2003]. Известно, что длительная ишемия миокарда и, в частности, последующая реперфузия сопровождаются аномально высокой продукцией АФК [Vanden Hoek et al., 1998], которая является основным фактором повреждения клеток [Akao et al., 2003]. Активация МИТОКАТФ С ПОМОЩЬЮ фармакологических модуляторов, вводимых в организм, уменьшает производство АФК [Neckar et al., 2005].
На основании полученных результатов и данных литературы, мы предлагаем следующий механизм участия МИТОКАТФ В адаптации организма при применении прерывистой нормобарической гипоксии, которая применялась в описанных выше экспериментах. Уменьшение концентрации кислорода во время кратковременной гипоксии ингибирует дыхательную цепь, что сопровождается временным повышением образования АФК в митохондриях. Известно, что низкие концентрации перекисных радикалов активируют МИТОКДТФ [Costa et al., 2006], а также протеинкиназу [Vanden Hoek et al., 1998]. Есть наблюдения о том, что МИТОКАТФ может быть активирован с помощью протеинкиназы [Sato et al., 2005]. Длительная гипоксическая тренировка приводит не только к активации МИТОКДТФ, но и к стимуляции его экспрессии. Ранее было показано, что введение фармакологического активатора МИТОКАТФ В организм увеличивала экспрессию белка канала [Lu & Halvorsen, 1997].
Хорошо известно, что увеличение продукции АФК является одним из основных повреждающих факторов в клетке. Их накопление приводит к окислению липидов мембран и открытию митохондриальной CsA-чувствительной поры, за которой следует лизис митохондрий, и некрозу тканей [Li & Jackson, 2002]. Снижение производства АФК при активации К+ и, возможно, Са2+ циклов, может лежать в основе механизма адаптации организма к гипоксии, а также кардиопротекторных свойств активаторов МИТОКДТФ- РОЛЬ МИТОКДТФ В предотвращении накопления АФК в митохондриальной мембране делает канал физиологически важным не только в отношении ишемии, но и других патологических состояний.
Измерение продукции Н2О2 митохондриями устойчивых и неустойчивых к гипоксии крыс...
В настоящей работе была изучена роль МИТОКДТФ у животных, отличающихся различной устойчивостью к острой гипобарической гипоксии, у крыс линии Август, а также при развитии у крыс гипоксического состояния (повышенная нагрузка и аудиогенная эпилепсия). Было проведено исследование роли уридина (предшественника УДФ - активатора МИТОКДТФ) В предупреждении состояний, связанных с развитием гипоксии, а также предпринята попытка к выяснению механизма его антигипоксического действия.
Проведенное в работе исследование митохондрий сердца и печени крыс с различной толерантностью к острой гипобарической гипоксии показало, что скорость АТФ-зависимого транспорта ионов калия выше в митохондриях устойчивых к гипоксии крыс по сравнению с неустойчивыми животными. Скорость входа К+ у неустойчивых крыс увеличивалась после адаптации. Следует отметить, что скорость транспорта ионов калия в митохондриях печени обеих групп животных была ниже в 1.5 раза, чем в митохондриях сердца. Вход К+ в митохондрии сердцаустойчивых крыс был ингибирован значительно меньшими концентрациями АТФ по сравнению с печенью.
Показано, что скорость образования Н2О2 в митохондриях сердца устойчивых крыс достоверно ниже, чем у неустойчивых животных. Известно, что уровень продукции АФК в митохондриях усиливается в ответ на добавление ингибитора канала - АТФ [Ferranti et al., 2003]. Авторы пришли к выводу, что эффект АТФ реализуется через закрытие МИТОКДТФ, И канал, таким образом, контролирует скорость продукции Н2О2 в митохондриях. В условиях наших экспериментов, скорость образования АФК в митохондриях устойчивых крыс в присутствии АТФ, была значительно выше по сравнению с неустойчивыми животными, что подтверждает большую активность МИТОКДТФ у этих крыс. Полученные в этой серии экспериментов результаты указывают на существование противоположной направленности между активностью МИТОКДТФ И скоростью образования перекиси водорода. У более адаптированных к гипоксии животных, у которых активность канала выше, что должно обеспечивать большую скорость циклического транспорта ионов калия, скорость образования Н2О2 в митохондриях ниже. Ускорение входа и выхода К+ в митохондрии, возможно, приводит к так называемому «мягкому» разобщению, которое в экспериментах in vitro снижает скорость производства АФК в митохондриях [Korshunov et al., 1997].
Подобный вывод был сделан и при анализе результатов следующей серии экспериментов, в которых проведено сравнение параметров АТФ-зависимого транспорта К+ и скорости образования перекиси водорода в митохондриях печени и исследовано функциональное состояние сопряженной дыхательной цепи у более устойчивых к гипоксии и повреждению миокарда при ишемии крыс линии Август и менее устойчивых крысы линии Вистар.
При использовании субстратов дыхания, как первого, так и второго участка дыхательной цепи было обнаружено, что дыхание митохондрий печени крыс линии Август значительно больше сопряжено с фосфорилированием, чем в митохондриях линии Вистар. Эффективность фосфорилирования в митохондриях крыс Август, измеренная как отношение АДФ/О, была выше, а время фосфорилирования АДФ - ниже у крыс Август по сравнению с крысами Вистар. Следует отметить, что при использовании НАД-зависимых субстратов эти изменения были аналогичны и даже более выражены. Так как в этом случае при увеличении всех скоростей дыхания наблюдается и лучшее сопряжение митохондрий, это можно объяснить либо более высокой активностью, либо большим количеством белка ферментов дыхательной цепи на единицу белка митохондрий у крыс линии Август, чем у крыс линии Вистар.
Показано, что скорость АТФ-зависимого транспорта ионов калия в митохондриях печени крыс Август значительно выше, чем у крыс Вистар, а концентрация К+ в них в 1.6 раза выше. Было обнаружено, что у крыс линии Август, у которых активность МИТОКДТФ выше, скорость образования Н2О2 на эндогенных субстратах, а также в присутствии субстратов как первого, так и второго участка дыхательной цепи, была ниже, чем в митохондриях крыс линии Вистар. Следовательно, у крыс линии Август, так же, как и у толерантных к гипоксии крыс высокий уровень активности МИТОКДГФ сопровождается сниженной скоростью генерации Н2О2 в митохондриях.
Противоположная направленность изменений активности МИТОКДТФ И скорости образования Н2О2 в митохондриях была обнаружена в настоящей работе и при экспериментальной патологии, а именно, в модели аудиогенной эпилепсии крыс (линия крыс Крушинского-Молодкиной). Известно, что при развитии судорог у крыс этой линии наблюдается снижение мембранного потенциала клетки и изменение внеклеточной и внутриклеточной концентрации ионов калия [Mller et al., 2000]. В настоящей работе установлено, что АТФ-зависимый транспорт калия в митохондриях мозга и печени крыс КМ был ниже по сравнению с тем же показателем у животных контрольной группы. Установлено также, что после развития у животных эпилептогенных судорог (группа КМзв), активность канала восстанавливается, что особенно проявляется при ДНФ-индуцированном выходе ионов калия из митохондрий. Скорость образования перекиси водорода в митохондриях мозга и печени крыс КМ и КМзв была выше, по сравнению с этими показателями у контрольных животных. В митохондриях мозга, но не печени, крыс КМ содержание продуктов перекисного окисления липидов, измеряемое по накоплению МДА, достоверно выше по сравнению с контролем. Обнаружено, что концентрация МДА в митохондриях мозга контрольных животных в 3 раза выше, чем в митохондриях печени. Также показано, что в митохондриях мозга крыс после развития судорог концентрация МДА в 2 раза выше контрольных значений. В митохондриях печени значения концентрации МДА не отличались у крыс контрольной и опытных групп. Таким образом, можно заключить, что мозг при данной патологии более чувствителен к нарушениям в окислительном обмене, чем печень.