Анализ данных атомно-силовой микроскопии с помощью компьютерного моделирования Толстова Анна Павловна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Анализ состояния методов молекулярной динамики и атомно силовой микроскопии в приложении к исследованию класса белков с неструктурированными участками 14

1.1 Компьютерное моделирование биомакромолекул методом молекулярной динамики 14

1.2 Стадии компьютерного моделирования биополимеров методом молекулярной динамики. 17

1.3 Некоторые ограничения и проблемы метода молекулярной динамики 25

1.4 Сканирующая зондовая микроскопия и ее возможности

1.4.1 Принципы работы сканирующих зондовых микроскопов 29

1.4.2 Атомно-силовая микроскопия 32

1.4.3 Особенности зондовой микроскопии белков 34

1.5 Существующие методы коррекции и уточнения изображений атомно силовой микроскопии биополимеров 37

Глава 2. Разработка метода молекулярной динамики в приложении к сравнению данных с данными атомно-силовой микроскопии 42

2.1 Исследование качества локальной энергетической минимизации для уточнения структур, полученных методом РСА 42

2.1.1 Методы 43

2.1.2 Результаты и обсуждение 49

2.1.3 Выводы 54

2.2 Исследование проблемы предсказания структуры нерасшифрованных частей белка 55

2.2.1 Методы 56

2.2.2 Результаты и обсуждение 61

2.2.3 Выводы 66

2.3 Создание силовых полей для подложек 66

2.3.1 Строение и параметризация силовых полей в среде Gromacs 67

2.3.2 Параметризация для графита. 70

2.3.3 Параметризация для молекулы GM. 71

2.3.4 Параметризация для подложек из оксида кремния 74

2.3.5 Результаты и обсуждение 77

Глава 3. Исследование биологически важных конформаций класса белков, имеющих неструктурированные участки, методами МД и АСМ 79

3.1 Фибриллообразование 70-субъединицы РНК полимеразы E.coli 79

3.1.1 Результаты и обсуждение 82

3.1.2 Выводы 89

3.2 Исследование адсорбции фибриногена на модифицированные поверхности слюды и графита . 89

3.2.1 Материалы и методы 92

3.2.2 Результаты и обсуждение 93

3.2.3 Выводы 95

3.3 Исследование адсорбции лизоцима на поверхность слюды методами АСМ и МД 96

3.3.1 Материалы и методы 97

3.3.2 Результаты и обсуждение. 106

3.3.3 Выводы 108

Заключение 109

Благодарность 112

Список литературы

• Некоторые ограничения и проблемы метода молекулярной динамики
• Принципы работы сканирующих зондовых микроскопов
• Исследование проблемы предсказания структуры нерасшифрованных частей белка
• Исследование адсорбции фибриногена на модифицированные поверхности слюды и графита

Введение к работе

Актуальность работы. В настоящее время трехмерная структура белков и белковых комплексов является объектом изучения сразу нескольких областей науки, от структурной биологии до биоинженерии и биоинформатики. В связи с ростом производительности компьютеров стало возможным производить весьма сложные и ресурсоемкие компьютерные эксперименты по изучению трехмерной структуры белков с атомистическим разрешением. Компьютерное моделирование, а именно молекулярная динамика, метод Монте-Карло и докинг, сдвинули фокус в изучении белковых структур и их конформационных изменений от экспериментов к теории.

Однако, далеко не все известные науке белки могут участвовать в моделях. Исходными данными для компьютерных экспериментов служат данные высокого разрешения реальных экспериментов, а именно рентгеноструктурного анализа (РСА) и ядерно-магнитного резонанса (ЯМР). Появление каждой структуры в компьютерных банках данных структур белков - трудоемкий и долгий процесс. При этом, большие белки не исследуются методом ЯМР, а РСА позволяет получить структуру только малоподвижных частей белков, оставляя на месте подвижных частей пробелы. Следует также отметить, что методы секвенирования последних лет позволяют накапливать данные об аминокислотной последовательности белков c экспоненциально растущей скоростью. Наблюдается все возрастающий разрыв между количеством известных последовательностей и количеством известных структур. Для устранения этой проблемы возникла целая наука по предсказанию структур белков по их аминокислотной последовательности. На данный момент стало возможным предсказать структуру отдельных небольших пропусков в аминокислотной последовательности трехмерных структур белков, полученных методом РСА. Тем не менее, существуют работы, доказывающие, что предсказанные

структуры близки скорее к своим прототипам, т.е. как правило к
гомологичным белкам, чем к белку-цели, а поэтому требуют

экспериментальной верификации. Все вместе это характеризует некоторую проблему в области структурной биологии: появились новые многообещающие и быстрые методы компьютерного моделирования, которые, тем не менее, оказываются напрямую зависимы от экспериментальных данных.

Наиболее адекватным экспериментальным методом, позволяющим изучать конформационные особенности отдельных крупных белков и белковых комплексов in vitro и в режиме реального времени является атомно-силовая микроскопия (АСМ). В качестве достоинств следует упомянуть относительную простоту и дешевизну метода, а в качестве недостатка -низкое разрешение и необходимость адсорбции на поверхность объектов изучения. В последние годы ряд работ по модификации поверхностей для АСМ позволил существенно увеличить возможности метода. Становится возможным различать отдельные домены в структуре единичной белковой молекулы, узнавать их характерные размеры. Исследовать структуру, свойства особенности и процесс формирования белковых комплексов.

Цель данной работы - выяснить физические особенности взаимодействия класса белков, имеющих неструктурированные участки, in vitro и в условиях пространственных ограничений (на подложке) с помощью атомно-силовой микроскопии и полноатомной молекулярной динамики для развития методологии анализа данных (преодоление молекулярного разрешения, учёта роли подложки) атомно-силовой микроскопии.

Для этого были выбраны два белка, ⁷⁰-субъединица РНК-полимеразы Escherichia coli и фибриноген человека. Оба белка обнаруживают склонность к амилоидному фибриллообразованию в нативных условиях, которое было хорошо изучено в АСМ-исследованиях. Оба белка имеют пропуски в

трехмерной структуре: у фибриногена отсутствует информация об С-цепях, предполагаемых участках связывания между белками внутри фибриллы. В связи с этим, в данной диссертации исследовался процесс адсорбции одной молекулы фибриногена на различные по своим физическим свойствам поверхности методами АСМ и молекулярной динамики с последующим сравнением полученных результатов.

У ⁷⁰-субъединицы РНК-полимеразы E.coli не расшифрованы два небольших участка внутри белковой глобулы. В данной работе исследовалось фибриллообразование ⁷⁰-субъединицы методами АСМ и компьютерного моделирования с последующим сравнением результатов.

Для выяснения возможной применимости результатов компьютерного моделирования к трактовке и повышения информативности данных АСМ было проведено моделирование адсорбции молекулы белка лизоцима из куриного белка, и сравнение полученных результатов с данными АСМ. Лизоцим хорошо изучен и не имеет пропусков в структуре. В соответствии с вышеизложенной целью были сформулированы следующие задачи:

Были поставлены следующие научные задачи:

1. Анализ состояния методов молекулярной динамики и атомно-силовой микроскопии в приложении к исследованию класса белков с неструктурированными участками.

2. Разработка метода молекулярной динамики в приложении к сравнению данных с данными атомно-силовой микроскопии

3. Исследование биологически важных конформаций класса белков, имеющих неструктурированные участки, методами молекулярной динамики и атомно-силовой микроскопии

Научная новизна

1. Впервые построена молекулярная модель фибриллы ⁷⁰-субъединицы РНК полимеразы E.coli.

2. Впервые построены модели ⁷⁰-субъединицы РНК полимеразы E.coli с восстановленными участками структуры при разной ионной силе.

3. Построена модель синтетической молекулы Graphite Modifier(GM).

4. Впервые промоделирована адсорбция GM на поверхность графита.

5. Впервые построена модель слюды, покрытой гексаметилдисилозаном.

6. Получена модель адсорбции лизоцима на поверхность слюды.

7. Предложен метод получения топологии поверхности адсорбированного белка.

Научная и практическая значимость работы

Результаты работы имеют как практическую, так и научную значимость.

Результаты экспериментов, а именно выяснение характерных мест
связывания молекул ⁷⁰-субъединицы РНК полимеразы E.сoli ,

формирующих структуры типа «бусина на нити», которые затем предположительно сворачиваются в спираль, формирующую фибриллу, представляют ценность как для ученых, занимающихся исследованием комплекса бактериальной РНК полимеразы и выяснением свойств и функций отдельных белков в этом комплексе, так и для ученых, решающих общую для многих белков проблему возникновения амилоидных фибрилл.

Данные об адсорбции фибриногена на различные поверхности хорошо коррелируют с данными АСМ-исследований и дополняют их, позволяя сделать вывод о характере взаимодействия с подложками С-цепей, подтверждая таким образом одну из двух теорий, разрабатываемых на данный момент ведущими учеными в этой области. Поскольку сами С-цепи не фигурировали в компьютерном исследовании, выполненная работа

открывает перспективы для повышения точности и адекватности метода молекулярной динамики.

Данные об адсорбции лизоцима на поверхность слюды позволяют в перспективе перейти к автоматическому объединению данных АСМ и молекулярной динамики и повышению информативности АСМ.

Все вместе проведенные компьютерные и АСМ эксперименты представляют научную и методологическую ценность, внося вклад в развитие обоих методов и показывая перспективность объединения их результатов.

Положения, выносимые на защиту

1) Молекулярные модели фибрилл ⁷⁰-субъединицы РНК

полимеразы E.coli, позволяющие исследовать ранние стадии амилоидоза.

2. Уточненные молекулярные модели ⁷⁰-субъединицы РНК полимеразы E.coli с восстановленными участками в водной среде при разных уровнях ионной силы, позволяющие исследовать процесс самоингибирования белка при высоких концентрациях солей.

3. Молекулярные модели адсорбированных белков фибриногена и лизоцима на поверхности слюды и других исследуемых в АСМ подложек.

4. Молекулярные модели подложек свежесколотого графита, графита, покрытого слоем молекул GM, свежесколотой слюды и слюды, покрытой гексаметилдисилозаном, позволяющие проводить моделирование адсорбции белков.

5. Метод получения топологии поверхности молекулярных моделей адсорбированных белков.

Личный вклад диссертанта

АСМ-изображения лизоцима получены и обработаны автором лично. Все модели в среде Gromacs построены автором лично.

Параметризация подложек и подбор парциальных зарядов, а также конструирование новых молекул и подложек проведены автором лично.

Построение топологий поверхности адсорбированных белков и сравнение с данными АСМ проведено автором лично.

Данные АСМ по адсорбции фибриногена на исследуемые поверхности получены совместно с Протопоповой Анной Дмитриевной.

Данные АСМ по фибриллообразованию сигма-фактора получены совместно с Кузьминой Натальей Викторовной.

Модели в среде NAMD построены совместно с Оферкиным Игорем Владимировичем.

Все результаты, составляющие основное содержание диссертации, получены автором самостоятельно.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались на следующих научных конференциях и школах:

1. VIII Международная конференция "Проблемы биологической физики" 27-28 ноября 2009 Москва, Россия

2. Международная конференция Ломоносов 2010, Выставка инновационных проектов и достижений молодых ученых СНГ, 12 апреля 2010, Москва, Россия

3. Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии 26 - 30 апреля 2010 , Севастополь, Украина

4. Четвертая международная конференция "Современные достижения бионаноскопии", 15 - 18 июня 2010, Москва, Россия

5. Международная конференция Ломоносов 2011, 11 — 15 апреля 2011, Москва, Россия

6. Пятая международная конференция «Современные достижения бионаноскопии», 15–17 июня 2011 Москва, Россия

7. 17th International Biophysics Congress, 31 октября – 3 ноября 2011 Пекин, Китай

8. 2-я Международная школа по физике поверхности «Технологии и измерения атомного масштаба», 1-7 октября 2012 Сочи, Россия

9. Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии "X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова", 14-17 ноября 2011, Москва, Россия

10. Международная конференция Ломоносов 2015, 13-17
апреля 2015, Москва, Россия

11. Международная конференция Super resolution in different
dimensions, 2-3 июня 2015, Москва, Россия

12. Международная конференция 18th International Conference of non contact Atomic Force Microscopy, 7-11 сентября 2015, Кассис, Франция Публикации. По теме диссертационой работы опубликовано 15 работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень ВАК, 1 статья в нерецензируемом журнале, 1 публикация в сборнике трудов и 11 публикаций в сборниках тезисов докладов конференций.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения и списка цитируемой литературы из 151 наименования. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста и включает 32 рисунка и 10 таблиц.

Некоторые ограничения и проблемы метода молекулярной динамики

Большинство биополимеров имеют трехмерные структуры, полученные либо из экспериментов, либо c помощью вычислений in silico. Существует внушительное разнообразие программ, позволяющих конструировать новые молекулы, основываясь на квантово-механических расчетах. а также справочная литература по длинам связей, зарядам и углам практически всех возможных комбинаций атомов в органической химии. Для начала, исследователю требуется тем или иным способом получить трехмерную структуру объекта изучения с атомистической точностью, и представить ее в виде координатного файла, в котором каждому атому полагается идентификационный номер, номер основания, т.е. группы атомов, к которому он относится, три координаты в нанометрах либо ангстремах, а также название, соответствующее данному атому в списке атомов выбранного силового поля. Далее из такого координатного файла с помощью параметров, взятых из силового поля, будет создана топология объекта: файл, содержащий данные о зарядах, длинах связей, углах и двугранных углах всех атомов системы. Эта информация не будет меняться в процессе моделирования. Силовое поле в программных пакетах молекулярной динамики представляет собой не только набор общих уравнений для потенциальной энергии, но также набор коэффициентов для каждого атома, каждой связи, каждого угла, доступного для моделирования в данном силовом поле. Возможности каждого силового поля напрямую зависят от этих коэффициентов и количества рассмотренных атомов и их комбинаций. Наиболее распространенная проблема, которая может возникнуть на данном этапе - это невозможность охватить все химические соединения в одном силовом поле. Так, например, силовые поля, наилучшим образом моделирующие белки, не приспособлены для моделирования твердых тел, и наоборот, поля для неорганической химии не подходят для моделирования полипептидной цепи. Таким образом, при решении гибридных задач требуется создавать дополнительную параметризацию, добавляя необходимые данные в выбранное силовое поле.

После выбора силового поля, требуется создать топологию системы. Для этого можно воспользоваться специальными программами, которые соотнесут каждый атом с его параметризацией в силовом поле и вычислят его соседей, организовав правильным образом связи между ними. Однако, такие программы работают с типовыми макромолекулами, как то белки и нуклеиновые кислоты. В случае других соединений возможны ошибки из-за неправильной расстановки связей между атомами.

В таком случае можно использовать более примитивные программы, которые используют предварительно созданный пользователем файл, в котором указаны все типы и длины связей в молекуле. Такой метод требует аккуратности, так как никаких проверок на адекватность системы не проводится.

Отдельно следует упомянуть добавление растворителя. Как правило, моделирование проводится в жидкой среде. Растворитель может быть дискретным, представляющим собой отдельные молекулы, либо непрерывным, который моделируется добавкой к потенциальной энергии системы нового члена, отвечающего за энергию сольватации. Как правило, в таком случае используется математическое представление Борна[9], свободная энергия сольватации в таком случае имеет три слагаемых: член, отвечающий за взаимодействие внутри растворителя в заполняемой полости, член, отвечающий за Ван-дер-Ваальсово взаимодействие между раствором и растворителем, а также член, отвечающий за электростатическую поляризацию раствора растворителем.

Минимизация энергии. Функция потенциальной энергии макромолекулярной системы представляет собой довольно сложную многомерную гиперповерхность. Она имеет одну низшую точку, глобальный минимум, и великое множество локальных минимумов, в которых все производные потенциальной энергии равны нулю, а все вторые производные не отрицательны[10].

Знание всех локальных и глобального минимумов позволило бы описать все возможные конформации макромолекулы, а также ее динамику и структурные превращения. Однако огромное количество координат делает невозможным описание этой гиперповерхности в сколько-нибудь значимой области точек. На данный момент не существует методов энергетической минимизации, которые бы гарантировали нахождение глобального минимума. При известной начальной конфигурации системы можно найти только ближайший локальный минимум. "Ближайший" не в геометрическом смысле, а такой, который можно достичь систематическим снижением локального градиента.

На данный момент существуют три класса методов энергетической минимизации. 1. Методы, требующие анализа только самой энергетической функции. Например, симплексный метод. Каждый последующий шаг делается на основе анализа предыдущих. Если требуется информация о производных энергетической функции, эти методы уступают тем, что используют эту информацию.

2. Методы, требующие данные о производных энергетической функции. Частные производные потенциальной энергии, по сути являющиеся силами, взятыми с обратным знаком, известны в молекулярной динамике, поэтому к классу таких методов относятся модификации алгоритмов молекулярной динамики.

3. Методы, использующие также информацию о вторых производных энергетической функции. Они лучшие по своим свойствам сходимости близ энергетического минимума: квадратичная потенциальная функция минимизируется в один шаг. Однако проблема заключается в том, что для молекулы из N частиц требуется посчитать, запомнить и инвертировать матрицу из 3N3N единиц. Даже не беря в расчет дополнительные программыные ресурсы для высчитывания вторых производных, такие вычисления доступны для немногих систем.

Ко второй категории относятся наиболее популярные методы энергетической минимизации, использующиеся, например, в программном пакете Gromacs. К ним относится, например, метод наискорейшего спуска[11]. В этом случае следующий шаг минимизации предпринимается в направлении отрицательного градиента производной (т.е. в направлении силы), без учета того, что было на предыдущих шагах. Размер шага подбирается таким образом, чтобы обеспечивать при всей быстроте постоянное уменьшение энергии. Это простой и быстрый, но несколько примитивный метод, его сходимость довольно низка, особенно вблизи локального минимума. Метод сопряженных градиентов демонстрирует более быструю сходимость, он использует информацию о прошлых шагах[12]. Этот метод более медленный на ранних стадиях минимизации, чем метод наискорейшего спуска, однако он становится более эффективным по мере приближения к энергетическому минимуму.

Алгоритм L-BFGS, или Бройдена — Флетчера — Гольдфарба — Шанно - один из наиболее применимых квазиньютоновских методов[13]. Он основан на вычислении наилучшего приближения гессиана функции, исходя из всех предыдущих шагов. Данный метод находит минимум любой дважды непрерывно дифференциируемой выпуклой функции. Этот метод демонстрирует наилучшую сходимость, однако из-за необходимости проводить коррекцию после каждого шага, не может быть распараллелен и не подходит для больших систем. Уравновешивание системы. Основная задача уравновешивания - привести в равновесие растворитель вокруг объекта, то есть создать нужную температуру и плотность для молекул растворителя. Приведение системы в состояние равновесия производится в два шага: на первом, называемом NVT уравновешивание, приводится в равновесие температура системы, затем, с помощью приложения давления в процессе NPT уравновешивания достигается необходимая плотность.

Принципы работы сканирующих зондовых микроскопов

Приведенные соображения позволяют рассматривать значения RMSD для всех пар как распределение случайной величины (рис. 2.2a). В этом случае статистический анализ эффективности уточнения сведется к исследованию смещения распределения по RMSD. Исходное предположение о значительном уменьшении геометрической разницы структур в парах статистически подтвердится, если аналогичное распределение, полученное после минимизации каждой структуры, позволит выявить существенное уменьшение среднего значения, принципиально не изменив характера распределения.

Минимизация структур, а именно поиск конформации локального энергетического минимума, производимый из начальной точки в конфигурационном пространстве координат белка, соответствующей исходной PDB структуре, может быть осуществлена квази-Ньютоновым методом численной оптимизизации. При этом в качестве оптимизируемой функции выступает полная энергия белка, которая, в свою очередь, вычисляется методами молекулярной механики.

Уточнение структур определяется в первую очередь точностью поиска конформации локального энергетического минимума каждой из структур. Положение локального минимума на энергетическом ландшафте белка в кристалле определяется в первую очередь Ван-дер-Ваальсовыми взаимодействиями. В связи с этим выбор силового поля для расчета полной энергии белка в рамках минимизации должен производиться таким образом, чтобы наиболее точным образом учесть межатомные взаимодействия внутри белка. Многие белки исследуемой выборки содержат коферменты, а также ионы металлов, связанные координационными связями с атомами аминокислотных остатков или гетероатомами небелковой части. Распространенные программы, предназначенные для уточнения белковых структур при помощи локальной энергетической минимизации с использованием методов силового поля, обеспечивают учет растворителя, но исключают из структуры белка как ионы металлов, так и некоторые небелковые части в процессе обработки исходной PDB структуры [58]. Этим была продиктована необходимость использования в настоящей работе собственной программы локальной энергетической минимизации в вакуумном окружении по методу силового поля MMFF94 [59], проверенной и откалиброванной с использованием библиотеки химических соединений MMFF Validation Suite и позволяющей осуществить вычисление полной энергии с учетом координационных связей ионов металлов.

Мы использовали квазиньютоновский (Алгоритм Бройдена — Флетчера — Гольдфарба — Шанно (BFGS)) метод[60] численной локальной оптимизации для нахождения локального энергетического минимума белка как функции координат всех его атомов в PDBструктуре. Последняя была использована в качестве исходной структуры для минимизации. Для вычисления градиента использовалась двухточечная разностная схема с шагом 10-7. Для нахождения конформаций с минимальной энергией мы использовали следующие параметры: максимальное число итераций было 10000, последние 256 шагов минимизации сохранялись в памяти, алгоритм перезапускался, если не было уменьшения энергии в выбранном направлении. Затем, если было более чем 32 перезагрузки в течение последних 256 шагов, алгоритм минимизации, наконец, переходил в простой градиентный спуск с максимальным количеством шагов 1000.

Таким образом мы получали минимизированные структуры. Эти структуры были сгруппированы в те же пары, и мы получали новое распределение RMSD минимизированных структур в парах.

Конформации, соответствующие локальному энергетическому минимуму, полученные для каждой структуры, использовались для построения нового распределения RMSD (рис. 2.2б). Как видно из гистограммы, характер распределения сохранился, однако среднее значение увеличилось, что доказывает, что использование только локальной энергетической минимизации не может быть универсальным методом уточнения структур разного разрешения.

Исходные различия в структурах разного разрешения одного белка могут быть обусловлены тем, что программы предварительного уточнения, используемые при подготовке структур из PDB-банка, неверно выбирают окончательные координаты атома в области, распознанной из анализа дифракционной картины и значительно превышающей его размеры. В таком случае заметно увеличившиеся различия между минимизированными конформациями структур разного разрешения вызваны тем, что локальная энергетическая минимизация сводит структуры разного разрешения в разные минимумы энергетического ландшафта [61].

Итак, ширина пика дифракционной картины задаёт лишь область расположения каждого из атомов белка, что соответствует области в конфигурационном пространстве координат всех атомов белка. Программы предварительного уточнения лишь выбирают точку с наименьшей полной энергией белка в пределах этой области конфигурационного пространства. Различия в структурах PDB-банка большего и меньшего разрешения одного белка показывают, что выбранная точка с наименьшей полной энергией не попадает в уменьшенную область конфигурационного пространства, определяемую экспериментом с меньшей шириной пика дифракционной картины. Это возможно лишь в случае наличия многих точек локальных энергетических минимумов со сходной энергией, существующих по крайней мере в большей из областей конфигурационного пространства.

Исследование проблемы предсказания структуры нерасшифрованных частей белка

Вообще, результаты моделирования хорошо согласуются с нашими данными AСM и с результатами других исследователей. Интерпретируя результаты МД-моделирования, можно прийти к заключению, что различие в высотах D домена фибриногена на гидрофобной и гидрофильной поверхностях главным образом зависит от их гидрофобности, но не от местоположения -C доменов. Следует отметить, что в случае больших молекул промежуточная стадия моделирования в вакууме существенно сокращает время моделирования, что было продемонстрировано на примере фибриногена: через 4 нс после добавления воды к высушенной в вакууме системе наблюдалась устойчивая адсорбция и существенные конформационные изменения (фибриноген на слюде и модифицированной слюде), тогда как в водной среде процесс приближения молекулы к подложке идет крайне медленно (фибриноген на графите). Использовать более огрубленные методы моделирования, не учитывающие подвижность белка, в данном случае не представляется возможным, так как после начала адсорбции на графит молекула фибриногена начала изгибаться, а из-за большого размера процесс этот может сильно затянуться, пока не произойдет прилипание молекулы к поверхности подложки по всей длине. Использование огрубленного моделирования на данной стадии приведет к ошибкам в итоговой конформации.

В качестве объекта для апробации предложенного ранее метода совместной трактовки данных был выбран белок лизоцим из белка куриного яйца. Он имеет массу 14,3 кДа, состоит из единственной полипептидной цепи, содержащей 129 аминокислотных остатков, pI=11. Это глобулярный белок, имеет эллипсоидную форму с размерами 2,8 3,2 3,0 нм, при нейтральном рН положительно заряжен. В работе использовался шестикратно кристаллизованный лизоцим японской фирмы Seikagaku Corporation.

Лизоцим положительно заряжен в чистой воде, поэтому он охотно адсорбируется на поверхности отрицательно заряженных слюды и графита. Это делает возможным построение модели адсорбции на временах, характерных для современной молекулярной динамки. Симуляция адсорбции лизоцима уже была построена ранее Кубиак и другими [135-137], эти данные использовались в настоящей работе в качестве эталона.

Своей популярностью среди исследователей лизоцим обязан двум фактам: во-первых, это амилоидный белок, образующий фибриллы на поверхностях при определенных легко достижимых условиях[138-140]; во-вторых, при иммобилизации на поверхностях он способен к дальнейшей агрегации, образуя конгломераты, причем этот процесс может идти и при нейтральном рН, и в отсутствии ионной силы [141]. При определенных условиях возможен рост кристаллов, который наблюдался многими исследователями с помощью АСМ[142].

Для визуализации мономеров лизоцима использовались микроскопы Nanoscope III фирмы Digital Instruments и FemtoScan, разработанный в Лаборатории сканирующей зондовой микроскопии Физического факультета. Сканирование проводилось в резонансной моде в режиме прерывистого контакта.

Использование резонансной моды обусловлено тем, что это режим прерывистого контакта, в котором воздействие зонда на поверхность невелико. Этот режим был выбран, так как изучались легко деформируемые объекты – белки. Белок наносился на подложку путем физической сорбции, что означает его высокую латеральную подвижность; этот факт также требовал использования «полуконтактного» режима. В работе использовались стандартные кантилеверы фирм MicroMash и НИИФП, а также ультраострые кантилеверы Клинова с радиусом закругления 1нм.

В основе идеи уточнения данных атомно-силовой микроскопии по объектам заданного размера и формы, находящимся под поверхностью образца, лежит использование двухпроходного режима АСМ.

В каждой строке совершается следующая процедура. На первом проходе снимается АСМ изображение рельефа в контактном или «полуконтактном» режиме. Затем кантилевер отводится от поверхности на расстояние z0, и осуществляется повторное сканирование. Расстояние z0 выбирается таким образом, чтобы сила Ван-дер-Ваальса была меньше силы электрического или магнитного взаимодействия.

На втором проходе датчик перемещается над поверхностью по траектории, повторяющей рельеф образца. Поскольку в этом случае локальное расстояние между зондовым датчиком и поверхностью в каждой точке постоянно, изменения изгиба кантилевера в процессе сканирования связаны с неоднородностью электрических или магнитных сил, действующих на зонд со стороны образца.

Рельеф поверхности, получаемый при первом проходе – это траектория зонда, обусловленная не только реальной топографией, но и искажениями, возникающими в системе. Эти искажения в составе топографии воспроизводятся и при втором проходе, вызывая искажения изображения электрических или магнитных характеристик образца. Если эти характеристики имеют известный паттерн, по нему возможно восстановить невозмущенную топографию.

В работе исследовался процесс адсорбции лизоцима из водного раствора на поверхность слюды. Для сравнения с данными компьютерного моделирования требовался чистый водный раствор мономеров лизоцима без каких-либо примесей.

В ходе работы был проведен анализ чистой воды из ряда лабораторий МГУ и других институтов. Наиболее чистой была признана дистиллированная деионизованная вода промышленной очистки, из которой приготовлялся бидистиллят. Полученная вода при высыхании не оставляла загрязнений, имела нейтральный рН и нулевую ионную силу.

Лизоцим практически нерастворим в чистой воде, он образует раствор полимеров с характерным диаметром 40-60 нм. Растворимость лизоцима можно повысить увеличением ионной силы, однако в присутствии ионов возрастает скорость его димеризации. Был разработан следующий способ получения мономеров лизоцима. Водный раствор кристаллического лизоцима помещался на 10 часов в термостат с температурой 45 С (температура обратимой денатурации лизоцима – 63 С), после чего полученный раствор помещался в центрифугу на 10 минут при скорости 14 500 оборотов в минуту. В результате в верхней части пробирки получался чистый раствор мономеров и димеров лизоцима.

Процесс симуляции адсорбции выбранного полимера на созданную подложку можно разбить на следующие стадии:

1) Объединение подложки, белка pdb-банка [143] и молекул воды в единую систему, путем помещения в кубик 100 200 белка и подложки на достаточном удалении (40-50 ) и заполнении кубика молекулами воды, пересчитанными из концентраций и плотности растворенных веществ и растворителя.

2) Молекулярно-динамическая симуляция кубика, как незамкнутой, но периодичной системы (продолженной в себя): расчет сил в силовом поле и перемещение в направлении сил (Рисунок 3.11). Времена симуляции - 10-20 нс или меньше, до факта адсорбции (стабильном удержании атомов белка на расстоянии менее 5-8 ангстрем от подложки)

3) Оценка адекватности результатов - анализ явных артефактов (белок пронзил подложку, вода испарилась до адсорбции, подложка изогнулась, белок денатурировал (выход гидрофобного ядра белка в растворитель), белок растянулся из-за периодичности кубика и сорбировался на обе стороны). Исправление ошибок в силовом поле, повлекших за собой неадекватное моделирование.

Исследование адсорбции фибриногена на модифицированные поверхности слюды и графита

На данном изображении видно присутствие фонового шума, который сильно затрудняет обработку данных, однако от него невозможно избавиться. Средняя высота объектов на изображении составляет 0,5 нм. Эта высота сильно занижена по сравнению с ожидаемой (1,7 нм по данным АСМ экспериментов[145]) вследствие деформации белка кантилевером.

Также следует отметить, что лизоцим имеет тенденцию собираться в монослои после сорбции на поверхность. Это явление наблюдалось при более высоких концентрациях, чем на приведенном изображении. Замеченный эффект согласуется с экспериментальными данными других исследователей [146-148].

Для дальнейшей обработки полученного изображения, на нем выделялись области с отдельным белком (Рисунок 3.15) размером 10х10 нм, которые потом сравнивались с аналогичными изображениями, полученными компьютерным моделированием.

АСМ-изображение единичного лизоцима Компьютерные модели строились в программе NAMD, выбор которой обусловлен тем, что она является одной из самых популярных и доступных для использования на параллельных вычислительных комплексах. Симуляции проводились на кластерах факультета ВМиК МГУ и НИВЦ МГУ. Поскольку в эксперименте использовался кристаллический лизоцим, была взята кристаллическая PDB-структура лизоцима 1iee, полученная методами рентгеноструктурного анализа.

Подложка, моделирующая слюду, представляла собой кристаллический оксид кремния с расстоянием между атомами кремния и кислорода 1,6 в квадратной элементарной ячейке, заряды атомов составляли +1,11е и -0,66е соответственно. Подложка имела размеры 100х100х10 . Поверхность подложки состояла из гидроксидов, расположенных под углом 45 к поверхности. Белок помещался в водяной кубик размерами 100х100х200, располагающийся на подложке и состоящий из отдельных молекул воды. В симуляции были выбраны периодические границы, то есть система продолжалась сама в себя. Поэтому лизоцим, изначально помещенный в середину водяного куба, перед началом симуляции смещался в сторону подложки до расстояния в 40-50 , чтобы избежать попадания в состояние устойчивого равновесия между подложкой и ее периодическим повтором. Проводились также симуляции с другими параметрами границ, однако описанная выше модель оказалась наиболее адекватной. Если по одному из направлений убрать периодические границы, система находилась в условиях, аналогичных нахождению в вакууме и вода начинала испаряться. Если не смещать белок по вертикали, адсорбции не происходило. Если же высоту водяного куба сделать небольшой (порядка 100), наблюдалась адсорбция белка сразу на 2 поверхности, конформация сильно изменялась.

Симуляция проводилась при рН 7.0, нулевой ионной силе, до тех пор, пока не была зарегистрирована устойчивая адсорбция (рисунок 3.16), после

Полученные реальное и модельное изображения сравнивались. Изначально предполагалось считать корреляцию между двумя двумерными функциями, представляющими собой поверхности. Предполагалось находить такое взаимное расположение поверхностей, при котором коэффициент корреляции был бы максимален, после чего считать среднеквадратичное расстояние между узлами функций. Экспериментальные данные показали, что высоты сравниваемых объектов отличаются довольно сильно, поэтому неправомерно использовать корреляционный анализ. Взамен был предложен способ сравнения по форме и объему исследуемых объектов, описанный выше.

После применения алгоритма становилось возможным сравнить модельное изображение белка с его предполагаемым изображением на экспериментальном снимке по полученным параметрам и принять решение, присутствует ли на изображении белок и насколько качественно полученное изображение. Данные для сравнения представлены в таблице 3.5.

Как видно из таблицы 3.5, данные реального и компьютерного эксперимента существенно различаются. Это различие вызвано зашумленностью АСМ изображения и сильной деформацией белка в процессе сканирования. Существуют работы, в которых показано, что белки массой меньше 30 кДа не могут быть адекватно визуализированы в зондовой микроскопии[149], поскольку искажается соответствие между вертикальными и горизонтальными размерами белка, объем изображения не соответствует объему реального объекта. Так же, по данным атомно-силовой микроскопии[148-150], лизоцим при агрегации на отрицательно заряженную поверхность не сохраняет свою изначальную форму, а как бы расползается по поверхности, чтобы увеличить площадь контакта. В симуляции же видно, что конечная конформация (рисунок 3.16) имеет большие размеры, чем начальная (рисунок 3.11). Возможное объяснение этому состоит в том, что начальная структура белка получена методами рентгеноструктурного анализа, то есть в кристаллической форме, поэтому белок плотно упакован. Можно предположить, что в растворе сначала идет процесс разворачивания белка, а затем уже агрегации. Полученные в настоящем исследовании результаты позволяют предположить, что процесс агрегации длительный, и занимает времена большие, чем характерные времена симуляции, поэтому на данном этапе эксперимента учесть этот процесс не представляется возможным.

Для решения возникшей проблемы планируется улучшить модель зондового сканирования, в которой предполагается учесть инерционность кантилевера в процессе колебаний[151]. В такой модели в каждом узле решетки пробный зонд будет совершать колебания с частотой резонанса и амплитудой, полученными из эксперимента, регистрация сигнала будет проводиться при изменении амплитуды колебаний на порядок, указанный в эксперименте.

Разработана методика коррекции изображений атомно-силовой микроскопии на базе алгоритма сопоставления с данными компьютерного моделирования. Показано, что использование коррекции изображений атомно-силовой микроскопии по объектам известного размера и формы само по себе не дает существенного улучшения данных, но в составе разработанного автором метода может дать более точные данные. Показана работоспособность предложенной методики коррекции на лизоциме.

Полученные результаты могут использоваться в атомно-силовой микроскопии при решении задачи визуализации единичных белков и интерпретации полученных данных, а также в компьютерном моделировании процессов адсорбции в рамках молекулярной динамики для определения области применимости модели.