Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Фитогеографические исследования: методы, подходы и состояние изученности Восточной Европы 10
1.1. Климатические флуктуации в четвертичном периоде 10
1.2. Методы исследования динамики ареалов 11
1.3. Выбор оптимальных генетических маркеров для филогеографических реконструкций у растений 16
1.4. Влияние изменений климата на ареалы видов и их генетическое разнообразие 18
1.5. Филогеографические реконструкции миграционных путей сосудистых растений в Европе 20
Глава 2. Использованные модельные объекты 32
2.1. Кандыки {Erythronium dens-canis и Е. caucasicum) 32
2.2. Первоцвет обыкновенный {Primula vulgaris) 33
2.3. Солнцецвет {Helianthemum nummularium s.l.) 36
2.4. Гибридные зоны на подвергавшихся четвертичным оледенениям территориях (на примере Северной Карелии и юга Мурманской области) 40
2.4.1. Приморские осоки из группы Carex salina 40
2.4.2. Гибридизация между Picea abies и P. obovata 44
Глава 3. Материалы и методы 47
3.1. Материал 47
3.1.1. Primula vulgaris s.l 47
3.1.2. Erythronium dens-canis и E. caucasicum 47
3.1.3. Helianthemum nummularium s.l 48
3.1.4. Приморские осоки из группы Carex salina 49
3.1.5. Picea spp 51
3.2. Методы 52
3.2.1. Классическая морфометрия 52
3.2.2. Геометрическая морфометрия 53
3.2.3. Выделение ДНК 53
3.2.4. Анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (AFLP) 54
3.2.5. Амплификация и секвенирование участков ДНК 55
3.2.6. Анализ данных 59
Глава 4. История формирования ареалов европейско-кавказских видовm Erythronium 65
4.1. Генетическое разнообразие европейских кандыков 66
4.2. Аллопатрическая дивергенция эволюционных линий у европейских представителей рода Erythronium 70
4.3. Выживание во время четвертичных оледенений на востоке Среднедунайской низменности 72
4.4. «He-трансильванская» эволюционная линия 73
4.5. Происхождение генетически дифференцированной адриатической популяции кандыка и предложения по ее охране 74
4.6. Заключение 75
Глава 5. Роль рефугиумов Понто-Каспийского региона в формировании генетического разнообразия других районов Европы: филогеография Primula vulgaris 77
5.1. Вариабельность хлоропластной ДНК 77
5.1.1. Понто-Каспийский регион 77
5.1.2. Весь ареал вида 84
5.2. Вариабельность ядерной ДНК (ITS) 85
5.2.1. Понто-Каспийский регион 85
5.2.2. Весь ареал вида 90
5.3. Таксономические соображения 91
5.4. Природа полиморфизма цвета венчика на северо-восточном побережье Черного моря 93
5.5. Реконструкция фитогеографии Primula vulgaris 94
5.5.1. Весь ареал вида 94
5.5.2. Северо-восточное побережье Черного моря 98
5.6. Заключение 100
Глава 6. Филогеография Helianthemum nummularium и роль рельефа в формировании миграционных путей 101
6.1. Генетическая изменчивость 101
6.2. Таксономические соображения 109
6.3. Филогеография 111
6.4. Заключение 116
Глава 7. Гибридные зоны, образовавшиеся вследствие заселения разными эволюционными линиями подвергавшихся оледенениям территорий (на примере Северной Карелии и юга Мурманской области) 119
7.1. Приморские осоки из группы Carex salina 119
7.1.1. Анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов 120
7.1.2. Морфологическая изменчивость 124
7.1.3. Таксономическая структура группы 125
7.2. Гибридизация между Picea abies и P. obovata в Северной Карелии 129
7.2.1. Морфология 129
7.2.2. Молекулярно-генетический анализ 134
7.2.3. Происхождение карельских елей 135
7.3. Заключение 140
8. Основные закономерности миграций сосудистых растений в Восточной
Европе и на сопредельных территориях в позднеледниковье 141
Выводы 148
Благодарности 150
Литература 151
- Выбор оптимальных генетических маркеров для филогеографических реконструкций у растений
- Гибридные зоны на подвергавшихся четвертичным оледенениям территориях (на примере Северной Карелии и юга Мурманской области)
- Амплификация и секвенирование участков ДНК
- Происхождение генетически дифференцированной адриатической популяции кандыка и предложения по ее охране
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В течение кайнозойской эры климат на планете в целом становился холоднее. Имели место его флуктуации, амплитуда которых возрастала, что завершилось серией ледниковых эпох в четвертичном периоде. Последнее похолодание закончилось около 10 000 лет назад, а его максимум был отмечен около 20 000 лет назад. В это время ледник покрывал всю Фенноскандию, Исландию, а также Альпы и Пиренеи. Эти климатические флуктуации приводили к периодическим изменениям ареалов видов, что влияло на их генетическое разнообразие.
В настоящее время происходит интенсивное потепление климата, вызванное во многом и антропогенными факторами. Изменения ареалов, обусловленные глобальным потеплением, уже наблюдаются в последние 10-15 лет и, по-видимому, закончатся не скоро. Выявление миграционных путей видов в прошлом может использоваться для прогнозирования их ареалов при изменениях климата в будущем. Имеющихся палеонтологических и флорогенетических данных для детальной реконструкции истории отдельных видов не достаточно, поэтому необходимо дополнительно применять молекулярно-генетические методы.
Выявление миграционных путей и в целом истории видов в масштабе Европы позволит предсказать, как происходящие изменения климата повлияют на генетическую изменчивость, а, следовательно, и эволюционный потенциал этих видов. Данные о происхождении таксономически сложных групп видов позволят прояснить их систематику и грамотно спланировать природоохранные мероприятия.
Степень разработанности темы исследования. Современные представления о динамике растительного покрова и миграционных путях отдельных видов растений в Восточной Европе и на сопредельных территориях Урала и Кавказа базируются, в основном, на данных палинологии, сравнительной флористики и географии растений. Однако этих данных недостаточно для детальной реконструкции истории отдельных видов. Молекулярно-генетические работы для данной территории пока крайне немногочисленны и имеющиеся данные все еще носят фрагментарный характер. Для Западной и Центральной Европы, напротив, подобных исследований в последние два десятилетия было проведено очень
много, что позволило разработать подробные филогеографические схемы миграций отдельных видов и динамики растительного покрова в целом в ледниковое и послеледниковое время и согласовать их с палеоботаническими и флорогенетическими реконструкциями.
Однако в последнее время появляются фрагментарные данные, которые позволяют усомниться в универсальности выявленных филогеографических закономерностей. Так, сформулирована гипотеза о существовании не только южных, но относительно северных (вне-средиземноморских) рефугиумов; есть данные о повышении генетического разнообразия на подвергавшихся оледенению территориях за счет формирования зон контакта; неясна ценность изолированных популяций, образовавшихся в результате изменений ареалов, для сохранения генетического разнообразия. Для разрешения этих сомнений необходимы дополнительные исследования.
Кроме того, отсутствие филогеографических данных по Восточной Европе оставляет целый ряд вопросов открытыми до сих пор. Так, не ясно расположение восточноевропейских, кавказских и уральских ледниковых рефугиумов и их роль в послеледниковом восстановлении растительности Центральной Европы, равно как и роль южноевропейских рефугиумов в восстановлении растительного покрова Восточной Европы, Кавказа и Урала. Влияние долготного градиента континентальности на пути миграций мезофильных растений в Европе также остается недостаточно исследованным. Не выяснено влияние неоднородности рельефа континента (в основном гористый в Западной и Центральной Европе и в основном равнинный в Восточной Европе) на миграционные пути растений.
Для прояснения всех этих вопросов необходимы дальнейшие филогеографические исследования европейских видов растений в масштабе всего континента с особым вниманием к восточным популяциям.
Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования -проанализировать эффективность использования молекулярно-генетических данных для изучения миграционных путей сосудистых растений в Восточной Европе в позднеледниковье, а также выявить возможные рефугиумы и пути миграций с детальной оценкой структуры зон вторичного контакта ареалов.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
-
Изучить генетическую структуру растений с разным характером экологии {Primula vulgaris s.l., Helianthemum nummularium s.l., европейско-кавказских видов рода Erythronium) на всем протяжении их ареалов;
-
Охарактеризовать основные миграционные пути сосудистых растений в Восточной Европе в позднеледниковье посредством филогеографического анализа исследованных видов и привлечения имеющихся в литературе данных;
-
Выявить роль долготного градиента континентальности для определения путей миграций мезофильных растений;
-
Оценить роль Среднедунайской низменности и Понто-Каспийского региона в качестве рефугиумов и источников миграций мезофильных растений в позднеледниковье;
-
Оценить значимость периферических популяций для сохранения генетического разнообразия вида в контексте его эволюционной истории (на примере Helianthemum nummularium s.l. и Primula vulgaris s.l.);
-
Исследовать структуру гибридных зон, возникших в результате расселения Picea spp., и осок группы Carex salina на освободившихся от ледникового покрова территориях (на примере Северной Карелии и юга Мурманской области).
Научная новизна работы. Продемонстрирована эффективность использования молекулярно-генетических данных для анализа миграционных путей сосудистых растений в Восточной Европе в позднеледниковье. Показано, что для растений Восточной Европы в позднеледниковье характерны миграции в западном и северном направлениях. Впервые проанализирована внутривидовая генетическая изменчивость Erythronium dens-canis s.l., Е. caucasicum, Primula vulgaris s.l. и Helianthemum nummularium s.l. на всем ареале и реконструированы миграционные пути этих видов в позднеледниковье. Продемонстрировано, что особенности расселения видов в позднеледниковье (фрагментация ареалов, ограниченные межпопуляционные контакты, эффект основателя) обуславливают низкое генетическое разнообразие периферических популяций. Выявлена роль понтийских степей как барьера для миграций мезофильных видов, а также рефугиумов Среднедунайской низменности и Понто-Каспийского региона, как источников расселения этих видов в позднеледниковье. Показана необоснованность выделения узко понимаемых и локально распространенных таксонов в составе Primula vulgaris s.l. и
Helianthemum nummularium s.l. Впервые посредством совместного применения молекулярно-генетических и морфометрических методов проанализирована структура гибридных зон между Picea abies и P. obovata, а также между приморскими осоками из группы Carex salina, возникших при расселении растений на освободившихся от ледникового покрова территориях Восточной Европы и контакте разных эволюционных линий. Показано, что в обоих случаях возникающие гибридные комплексы следует трактовать как единый биологический вид.
Теоретическая значимость работы. Выявлены основные закономерности миграций сосудистых растений в Восточной Европе в позднеледниковье, продемонстрирована эффективность использования молекулярно-генетических данных для подобных реконструкций. Показана существенная роль Восточной Европы и сопредельных территорий Кавказа и Урала как источника расселения сосудистых растений в позднеледниковье по всему континенту.
Практическая значимость работы. Полученные данные позволяют оценить влияние происходящих изменений климата на миграционные пути видов, их генетическую изменчивость и биоразнообразие в целом. Показана применимость филогеографических методов для прояснения систематики таксономически сложных групп видов растений и оценки статуса изолированных популяций. Материалы диссертации использованы при составлении региональных флор: "Флора Владимирской области", "Panarctic flora checklist", "Аннотированный список флоры Алтачейского заказника", "Флора Средней полосы Европейской части России", 11-е изд. и при составлении Красных книг (данные по таксономической структуре группы Carex salina учтены во втором издании Красной книги Мурманской области; данные по систематике Primula vulgaris s.l. и Helianthemum nummularium s.l. подготовлены для включения в следующие издания региональных Красных книг нашей страны и - в случае солнцецвета - Красной книги РФ). Полученные данные используются при создании учебных курсов по биологической эволюции, систематике и биогеографии растений.
Методология и методы исследования отражены в разделе «Материалы и методы», включая описания методов сбора материала, анализа генетической и морфологической изменчивости исследованных видов. Анализ данных в
представляемой работе проведен в соответствии с общепринятыми современными алгоритмами.
Положения, выносимые на защиту.
-
Филогеография (анализ пространственной структуры молекулярно-генетических данных) - эффективный подход не только для изучения миграционных путей растений в позднеледниковье, но и для прояснения систематики таксономически сложных групп видов;
-
Для растений Восточной Европы в позднеледниковье характерны миграции в западном и северном направлениях;
-
Долготный градиент континентальное во многом определяет фитогеогеографию Европы; понтийские степи выполняют функцию эффективных барьеров для миграций мезофильных растений, что приводит к аллопатрической дивергенции эволюционных линий;
-
В формировании миграционных путей растений в Европе значительную роль сыграли криптические северные (вне-средиземноморские) рефугиумы и рефугиумы Понто-Каспийского региона;
-
Периодические оледенения находящихся в высоких широтах территорий могут приводить не только к снижению, но и к увеличению генетического разнообразия в разных группах растений. Первое происходит за счет заселения освободившихся от оледенения территорий небольшими группами особей (эффект основателя, эффект «бутылочного горлышка»), причина второго - формирование гибридных зон при контакте популяций мигрантов из разных эволюционных линий.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов обусловлена анализом ряда модельных видов с разными экологическими предпочтениями, большими объемами выборок и применением широкого спектра современных методов получения и анализа данных.
Материалы диссертации были представлены в устных и стендовых докладах на совещаниях и конференциях: XVII Международном ботаническом конгрессе (Вена, Австрия, июль 2005 г.); VI Международной конференции «Биологическое разнообразие Кавказа» (Нальчик, Россия, ноябрь 2005 г.); VII Научном совещании по флоре Средней России (Курск,
Россия, январь 2011 г.); X Ежегодном совещании Академии наук штата Северная Дакота (Бисмарк, Северная Дакота, США, апрель 2012 г.); Международной конференции «Глобальная биосистематика» (Вена, Австрия, февраль 2013 г.); I Междисциплинарном симпозиуме по биогеографии Карпат (Краков, Польша, сентябрь 2013 г.); Международной конференции BioDivEvo (Дрезден, Германия, март 2014 г.); IV Международной конференции по молекулярной филогенетике (Москва, Россия, сентябрь 2014 г.); III Рабочем совещании по биологии растений (Дебрецен, Венгрия, ноябрь
2014 г.).
Основные результаты, выводы и положения диссертации опубликованы в 31 работе, в том числе 22 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, восьми глав, списка литературы (314 названий, в том числе 259 на иностранных языках) и 9 приложений. Работа изложена на 226 страницах машинописного текста, включая 10 таблиц и 24 рисунка. В приложениях общим объемом 40 страниц приведены перечни исследованных популяций разных видов растений с указанием их точного географического положения, морфологических и генетических параметров.
Благодарности. Я глубоко признательна моему научному консультанту И.А. Шанцеру. Благодарю А.Б. Шипунова (государственный университет г. Минот, США), открывшего для меня методологию научных исследований, и С. Brochmann (Национальный центр биосистематики, Осло), под руководством которого я освоила методы и идеи филогеографии. Часть материала собрана в рамках весенних учебных практик, летней практики на биостанции «Озеро Молдино» и Беломорской экспедиции Московской гимназии на Юго-Западе № 1543, проводимых под руководством СМ. Глаголева. Я благодарю директора гимназии Ю.В. Завельского за постоянную поддержку, которую он оказывает мне, начиная с пятого класса по сей день. Часть исследований была проведена на территориях следующих заповедников: Астраханского, Байкальского, Дальневосточного Морского, Ильменского, Кандалакшского, Костомукшского, Северная Сосьва, Хинганского, Шульган-Таш, а также на территориях природно-исторического заповедника «Аркаим», Сочинского национального парка и Алтачейского федерального заказника. Я признательна И.Г. Мещерскому (ИПЭЭ РАН) за помощь при секвенировании образцов и сотруднице
Национального центра биосистематики г. Осло V. Mirre за обучение работе в молекулярной лаборатории. Я благодарна всем коллегам в экспедициях и коллекторам за помощь в сборе образцов.
Работа частично поддержана программой «Живая природа» Президиума РАН, программой научного сотрудничества между Норвегией и Северо-Западной Россией, Московским институтом открытого образования, национальным центром биосистематики Норвегии, а также грантами Министерства науки и образования РФ (№ 16.51811.7076), фонда «Современное естествознание» (№ Р11-018 и ДП75-13), Министерства национального образования Румынии (№ PN-II-ID-PCE-2012-4-0595) и исследовательского консульства Норвегии.
Выбор оптимальных генетических маркеров для филогеографических реконструкций у растений
В течение кайнозойской эры (начиная с 65 млн. лет назад) климат на планете в целом становился холоднее. Имели место его флуктуации, амплитуда которых увеличилась, что завершилось серией ледниковых эпох в четвертичном периоде (антропогене, начиная с 2,4 млн. лет назад). В начале четвертичного периода Арктика покрылась льдом, и до примерно 900 000 лет назад занятая ледником площадь изменялась с периодичностью в 41 000 лет, затем период колебаний стал равным 100 000 лет, а их амплитуда заметно усилилась. Сухие и холодные периоды оледенений сменялись влажными и теплыми межледниковьями, причем эти колебания климата были достаточно быстрыми. Так, анализ многолетнего льда в Гренландии показал, что во время потеплений средняя температура увеличивалась примерно на 10 С за несколько десятилетий (Hewitt, 2000). Основная причина этих климатических флуктуации - периодические изменения характеристик земной орбиты (прецессии, эксцентриситета, угла наклона земной оси), так называемые циклы Миланковича. Это приводило к вариации количества солнечной энергии, получаемой нашей планетой, а, следовательно, к изменениям климата (Hays et al., 1976). Последнее похолодание закончилось по геологическим меркам совсем недавно (около 10 000 лет назад), а его максимум был отмечен около 20 000 лет назад. В это время ледник покрывал всю Фенноскандию, Данию, Исландию, а также Альпы и Пиренеи (Svendsen et al., 2004). Так что относительное постоянство климата, которое имеет место последние 8 000 лет - скорее исключение, чем норма (Taberlet et al., 1998). В настоящее время происходит интенсивное потепление климата, вызванное во многом и антропогенными факторами (Harrison, Sanchez Goni, 2010). Методы исследования динамики ареалов
Де Кандолль (De Candolle, 1820) первым предположил, что современное географическое распределение живых организмов зависит как от экологических («действующих в настоящее время»), так и исторических («действовавших в прошлом») факторов. Экологические причины вскоре были признаны недостаточными для объяснения географического распределения организмов, поскольку, например, области разных континентов со сходными условиями могут быть заселены совершенно разными таксонами (Morrone, Crisci, 1995). Влияние исторических факторов на ареалы в целом и миграционные пути видов в частности традиционно оценивали при помощи биогеографических реконструкций. Основной метод подобных исследований - это сравнительный анализ географического распределения таксонов разного уровня. Посвященный растениям раздел биогеографии назван М.Г. Поповым (1963) флорогенетикой - дисциплиной, «которая изучает историю флор земного шара, их зарождение (генезис), миграции и трансформации [...] в связи с гео-историческими условиями». Важно подчеркнуть, что флорогенетика анализирует современные ареалы таксонов, она «как сокол, питается живой пищей; ей не нужно, как палеоботанике, мумий, трупов растений, погребенных в геологических слоях» (Попов, 1963).
Другой классический метод исследований динамики ареалов видов -это обобщение палеонтологических данных. Серьезный недостаток таких данных - это их неравномерная представленность, неполная сохранность (очевидно, что сохранение хотя бы части организма в палеонтологической летописи - случайность, счастливая для палеонтологов) и во многом недостаточная изученность. Даже наиболее полные данные палеопалинологии, на которые во многом опираются реконструкции растительности прошлого, не свободны от серьезных недостатков. Во-первых, представленность ископаемой пыльцы зависит во многом не от обилия растений определенных видов в прошлом, а от обилия продуцируемой ими пыльцы (так, обычен «перевес» в сторону, например, злаков и полыней). Во-вторых, определение ископаемой пыльцы редко идет до видов, что снижает разрешение метода. Наконец, основанные на ископаемой пыльце реконструкции затруднены из-за переноса пыльцы на дальние расстояния (Толмачев, 1986; Гричук, 1989; Willerslev et al., 2014). Недостаток палинологической информации представляет серьезную проблему. Так, общее число и плотность палинологических данных в Восточной Европе (а тем более в Азии) довольно малы и в целом недостаточны для реконструкций ареалов евроазиатских видов в прошлом (Гричук, 1989; Эволюция экосистем Европы..., 2008).
В последнее время в качестве альтернативы палеонтологическим данным (Beany, Provan, 2011; Schorr et al, 2012) или в дополнение к ним (Alsos et al., 2009) используют модели ареалов видов в прошлом, основанные на детальных реконструкциях палеоклиматов и информации об экологии видов. Таким же образом можно моделировать и ареалы видов в будущем, чтобы, например, предсказать влияние глобальных изменений климата на генетическое разнообразие популяций (Alsos et al., 2009; Beany, Provan, 2011). Необходимо, однако, отдавать себе отчет в условности подобных моделей (Schorr et al., 2012).
Гибридные зоны на подвергавшихся четвертичным оледенениям территориях (на примере Северной Карелии и юга Мурманской области)
Форма семенных чешуи елей проанализирована при помощи метода тонких пластин - одним из методов геометрической морфометрии, основанной на постановке точек (т.н. «меток») на исследуемом контуре (Zelditch et al., 2004). Этот подход позволяет охарактеризовать форму как таковую, без учета размерных характеристик (Bookstein, 1991; Adams et al., 2004). Публикации по применению этого сравнительно недавно описанного метода для характеристики формы живых объектов выходят преимущественно на английском языке (например, Ray, 1992; Kores et al., 1993; Volkova et al., 2007; Volkova, Shipunov, 2007; Volkova et al, 2011), немногочисленные русскоязычные статьи по этой тематике посвящены в основном зоологическим объектам (например, Павлинов и др., 1994; Павлинов, 1999; 2000; Царёв и др., 2011). Результаты единичных исследований формы ботанических объектов начали публиковаться на русском языке лишь недавно (например, Волкова и др., 2005; Волкова, 2008; Хикматуллина, 2013). Мы использовали полуметки, расставленные равномерно по всему контуру семенной чешуи (против часовой стрелки, начиная от основания). Расстановку полуметок и снятие их координат проводили в программе tpsDig2 (Rohlf, 2010а). Значения главных трансформаций, характеризующих меру отличия образца от эталона, вычисляли в программе tpsRelw (Rohlf, 2010b), усредненные контуры семенных чешуи для каждого вида получали в программе tpsSuper (Rohlf, 2004).
ДНК у солнцецветов, осок и примул была выделена из дегидратированных листьев при помощи СТАВ (бромид цетилтриметиламмония) метода (Doyle & Doyle 1987; Schonswetter et al., 2002). Листья осок после добавления СТАВ буфера были заморожены на 15 минут при -80С. В основном мы использовали высушенные в силикагеле листья, в редких случаях ДНК выделяли из гербаризированных листьев. Мы не обнаружили существенных отличий между результатами AFLP анализа, проведенного для высушенных в гербарии и в силикагеле листьев приморских осок с одних и тех же растений (также см. раздел 3.2.4). При AFLP анализе приморских осок мы выделили ДНК 19 случайно выбранных растений дважды. Эти повторные экстракты наряду с отрицательными контрольными образцами (дистиллированной водой) были использованы для контроля за воспроизводимостью образцов и загрязнением образцов чужеродной ДНК (см. Bonin et al., 2004).
У елей выделение ДНК было проведено из высушенных в силикагеле иголок при помощи коммерческого набора МО BIO PowerPlant DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Carlsbad, California, USA). Сухие иголки ( 0.1 г) были растерты в порошок при помощи стерильных ступки и пестика и затем обработаны в соответствие с рекомендациями производителя.
У кандыков ДНК выделяли из дегидратированных фрагментов листьев при помощи коммерческого набора ZR Plant/Seed DNA kit (Zymo Research) согласно рекомендациям производителя. Листья, из которых извлекали ДНК, были высушены в силикагеле или между слоями абсорбирующей бумаги, или же хранились в спирте.
Анализ AFLP для приморских осок из группы Carex salina был проведен по стандартной методике Gaudeul et al. (2000) с небольшими модификациями: объем реагентов для полимеразной цепной реакции (ПНР) был уменьшен вдвое и продукты неизбирательной ПНР были разбавлены в десять раз. Мы протестировали 24 пары праймеров на восьми растениях разных таксонов. Затем пять наиболее перспективных пар праймеров были протестированы на 32 растениях из разных таксонов. Наконец, были выбраны те три пары праймеров, которые позволяли получить большое число полиморфных и хорошо разделенных ДНК-маркеров: ЕсоШ AGA (6FAM)-MseI CTG, ЕсоШ АТС (VIC)-Mvel СТА и ЕсоШ ААС (NED)-Mvel CAT. Для каждого образца смешивали 2.0 ці 6-FAM, 2.0 ці VIC и 3.0 ці NED флуоресцентно-меченных продуктов избирательной ІТЦР с 11.7 ці формамида и 0.3 ці GeneScan ROX 500 стандарта длин фрагментов и анализировали полученную смесь на секвенаторе (Applied Biosystems).
Полученные данные были проанализированы в программе ABI prism GeneScan 3.7 (Applied Biosystems) и импортированы для подсчета фрагментов в программу Genographer (http://sourceforge.net/projects/genographer/). Фрагменты длиной 70-500 пар оснований были подсчитаны как присутствующие или отсутствующие. Средняя воспроизводимость, подсчитанная как средняя доля корректно воспроизведенных фрагментов по всем повторностям (Bonin et al., 2004), составила 97% для трех пар праймеров. Мы не отметили статистически значимых различий в средней доле воспроизведенных пиков AFLP-профиля между гербаризированными и высушенными в силикагеле листьями с одного растения (протестировано 12 растений) (тест Стьюдента: р = 0.6).
Были секвенированы два участка ДНК: хлоропластный интрон trlLrnF при помощи праймеров trnttrnfcnew (5 -GGAGGATAATAACATTGCAT-3 , Tollefsrud, 2008b) и trnttrnfd (5 -GGGGATAGAGGGACTTGAAC-3 , Taberlet et al., 1991) и второй интрон митохондриального гена nad\ при помощи праймеров nadlfor (5 -CTCTCCCTCACCCATATGATG-3 , Sperisen et al, 2001) и nadlrev (5 -AGATCCCCATATATTCCCGG-3 , Sperisen et al., 2001, с учетом корректив, внесенных Dr. Mari Mette Tollefsrud, Norwegian Forest and Landscape Institute, личное сообщение в 2013 году). Полимеразная цепная реакция была проведена в реакционной смеси объемом 20 uL следующего состава: 5.2 uL Taq смеси реагентов для ПЦР (QIAGEN Corporation, Germantown, Maryland, USA), 1 uL прямого и обратного праймеров с концентрацией 10 цМ, 1 uL раствора исследуемой ДНК и 11.8 uL воды. Смесь для ПНР была инкубирована при следующем температурном режиме: 35 циклов при 94 в течение 1 минуты; 1 минута при 47 или 53 (для хлоропластной и митохондриальной ДНК соответственно), 2 минуты при 72, и, наконец, 10 минут при 72. Продукты ПНР были очищены и секвенированы с двумя праймерами (митохондриальная ДНК) или одним праймером (хлоропластная ДНК) в компании Functional Biosciences, Inc. (Madison, Wyoming, USA) согласно стандартным протоколам. Отдельные электроферограммы были отредактированы и объединены при помощи программы Sequencher 4.5 (Genes Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan, USA). Выравнивание хлоропластных сиквенсов проведено в программе ClustalX (Thompson et al., 1997) с последующей ручной корректировкой; митохондриальные сиквенсы были выровнены вручную.
Амплификация и секвенирование участков ДНК
Хотя Н. nummularium - и не типичное степное растение, наличие двух разделенных по долготе гаплотипов А и С (рис. 16) указывает на наличие некоторого генетического барьера для степной растительности на востоке Европы. Этот барьер, возможно, обусловлен флуктуациями климата в четвертичном периоде, которые вызвали трансгрессии Каспийского моря с бореальной и неморальной растительностью на их северной оконечности (Franzke et al., 2004). Единственное известное нам исследование филогеографии степных растений в масштабах Евразии (Clausia aprica: Franzke et al., 2004) выявило лишь гораздо более восточный меридиональный генетический барьер в западной Сибири (примерно 70 Е). Таким образом, биогеография степных растений в Евразии должна быть более сложной, чем считалось ранее, заслуживая дальнейших исследований.
Наличие редкого концевого в сети гаплотипа Н в двух популяциях на юге Апеннинского полуострова указывает на то, что они были заселены с севера восточной эволюционной линией солнцецвета (клада 2-1, гаплотип С). Хотя палеоботанические данные для восточной Европы чрезвычайно скудны, ископаемая пыльца Helianthemum spp. была обнаружена в перигляциальной кустарничковой тундре, покрывавшей север Восточной Европы, включая Кольский полуостров (Культина, Спиридонова, 1972) и южную оконечность Швеции во время межстадиальных потеплений бёллинг-аллерёд около 11-12 тыс. лет назад (Эволюция экосистем Европы..., 2008). Однако Н. nummularium не смог проникнуть в западную Данию, поскольку она все еще находилась подо льдом (Эволюция экосистем Европы..., 2008).
Рассеянное распределение современных северо-восточных популяций Н. nummularium согласуется с их предполагаемым реликтовым статусом, поскольку они были почти полностью вытеснены пост-гляциальными лесами (Proctor, 1958), что подтверждается палеоботаническими данными для этой территории (Vasari, Vasari, 1999). Реликтовый характер выходов горных пород на склонах, где произрастает Н. nummularium в Южной Карелии, обсуждался еще более века назад (Литвинов, 1902), уникальные условия обитания на Турьем мысу Кольского полуострова также благоприятны для произрастания ряда реликтовых видов (Бубенец и др., 1993). Таким образом, обнаруженное нами отсутствие генетической дифференциации изолированных периферических популяций Н. nummularium трудно объяснить без знания их эволюционной истории (см. Lesica, Allendorf, 1995; Eckert et al., 2008).
Вторая серия миграций Н. nummularium изначально была направлена с Балкан на север. Начало этой серии миграций маркировано распределением гаплотипа D и его производного М (клада 1-6). Позже представители этой эволюционной линии распространились по всей Западной Европе (гаплотип Е и его производные В, L, К и J) в основном в южном направлении, но также колонизировали Данию после отступления последнего оледенения. Растения с гаплотипом В быстро распространялись на юг по бассейну р. Рона и на восток вдоль северных склонов Альп, достигнув также их южных склонов. Распределение гаплотипа В совпадает с распределением окружающего Альпы гаплотипа Н14, выявленного на основании анализа микросателлитов Soubani et al. (2014b).
Таким образом, наши результаты предоставляют еще один пример хорошо известной роли Альп, вершины которых были покрыты льдом во время последнего ледникового максимума, как «контактной зоны» (эффективного барьера для распространения, где разные генетические группы контактируют): Hewitt, 2000. Распределение двух эволюционных линий Н. nummularium на северных (гаплотип В) и южных (гаплотип С) склонах Альп, то есть «вдоль альпийской дуги» согласуется с распределением других кальцефильных видов, обусловленным наличием известняковых пород в этом горном массиве (Alvarez et al., 2009).
Еще одна «контактая зона» была обнаружена в Дании. Ее наличие, по всей видимости, обусловлено неравномерным отступлением ледника во время последнего ледникового максимума, что позволило контактировать западным и восточным мигрантам. Существование этой контактной зоны наложило отпечаток на морфологическую изменчивость современных популяций Н. nummularium в Южной Скандинавии. В Дании встречается почти только subsp. obscurum, а наиболее обычная морфа в Южной Швеции -subsp. nummularium. Эти два подвида формируют широкую гибридную зону в юго-западной Швеции, где они свободно скрещиваются (Soubani et al, 2014а, 2014b). Западный гаплотип D, представленный subsp. obscurum, распространился на освободившихся от ледника первыми областях Скандинавии (западная Дания), тогда как популяции, характеризующиеся гаплотипом С и морфологией subsp. nummularium, заселились на эту территорию с востока (ср. Van Rossum, Prentice, 2004). Распределение таксонов и гаплотипов в современной гибридной зоне не соответствует друг другу (ср. Soubani et al., 2014а, 2014b), возможно, из-за «захвата хлоропластов» (Jacob, Blattner, 2006). Сходная контактная зона была ранее описана для нескольких видов в центральной Швеции (Hewitt, 2000; Van Rossum, Prentice, 2004), вне современного ареала Я. nummularium.
Происхождение генетически дифференцированной адриатической популяции кандыка и предложения по ее охране
AFLP анализ выявил 101 полиморфный маркер. Анализ главных координат, основанный на коэффициенте сходства Дайса (рис. 17) выявил единое «облако» образцов, где три «чистых» вида (С aquatilis, С. subspathacea и С. paleacea) находились по краям, образуя треугольник. Интересно, что географически удаленный образец С. subspathacea со Шпицбергена расположен в пространстве главных координат близ образца этого вида из Мурманской области. Растения, определенные как С. salina, были, за тремя исключениями, расположены между С. subspathacea и С. paleacea. Растения, отнесенные к С. recta s.L, заняли на диаграмме центральную позицию, но в основном между С. aquatilis и С. paleacea, а три растения, определенные как гибрид С. paleacea х recta, расположились на диаграмме между их предполагаемыми родителями. Четыре растения, которые были определены как гибрид С. nigra х subspathacea, расположились между С. aquatilis и С. subspathacea. Наконец, растения, отнесенные по морфологии к гибриду С. aquatilis х salina, разделились согласно их географическому происхождению: карельские образцы расположились между С. aquatilis и С. subspathacea, а мурманские - между С. aquatilis и С. paleacea. Анализ главных координат, основанный на коэффициенте сходства простого сочетания, дал весьма сходные результаты (не показано).
Анализ в программе STRUCTURE позволил уверенно разделить образцы на три группы, которые далее в тексте названы по входящим в них «чистым» видам (рис. 17, 18). К "раїеасеа-группе" относятся все растения, определенные как С. paleacea, С. paleacea х recta и С. aquatilis х salina из Мурманской области, наряду с некоторыми растениями, отнесенными к С. recta s.l. К "subspathacea-группе" относятся все растения, определенные как С. subspathacea и С. salina, наряду с некоторыми растениями, определенными как С. recta s.l. К "aquatilis-группе" отнесены все растения, определенные как С. aquatilis, С. nigra х subspathacea, карельские С. aquatilis х salina и оставшиеся растения, определенные как С. recta s.l. Таким образом, растения, определенные как С. recta s.l., были распределены между тремя генетическими группами.
Образцы разделены на три группы согласно анализу в программе STRUCTURE. Три предполагаемых «родительских» вида показаны заполненными символами.
Анализ молекулярной дисперсии (AMOVA: табл. 10), показал, что наибольшая доля генетической изменчивости заключена внутри таксонов (78%) и внутри трех «чистых» видов (61%). Аналогично, гораздо больше генетической изменчивости отмечено внутри трех групп, выделенных в в программе STRUCTURE (78%), чем между ними. Генетическая изменчивость между локациями была примерно равна изменчивости внутри них (57%).
Оценка вероятности классификации при числе групп (К), варьирующем от одного до 10. запусков программы STRUCTURE, вычисленные согласно Rosenberg et al. (2002). Круги - усредненный коэффициент сходства для попарных сравнений между результатами десятью запусков программы, треугольники -стандартное отклонение.
Для проверки гипотезы о гибридном происхождении образцов был применен тест назначения, в котором AFLP-фенотип был отнесен к какой-либо группе, если вероятность принадлежности к данной группе была в 10 раз выше, чем вероятность принадлежности к другой группе, в противном случае AFLP-фенотип не был отнесен ни к какой группе. Перед проведением тестов растения, определенные как С. recta s.l., были разделены на три группы, согласно результатам анализа в программе STRUCTURE (рис. 17, 19).
Первый тест назначения был проведен для обнаружения наиболее вероятных родителей для этих трех групп. Растения С. recta s.l. из "paleacea-группы" были отнесены или к симулированному гибриду С. aquatilis х paleacea первого поколения (два растения) или к С. salina (одно растение; пять растений не были отнесены ни к одной из групп). Растения из "subspathacea-группы" были отнесены к С. salina (два растения; еще два не были отнесены ни к одной из групп). Все три растения, относящиеся к "aquatilis-rpynne" были отнесены к симулированному гибриду С. aquatilis х salina первого поколения. Второй тест назначения был проведен для поиска наиболее вероятных родительских видов для С. salina. Большинство этих растений (7; 9 не были отнесены ни к одной из групп) были отнесены к симулированному гибриду первого поколения между С. recta из "paleacea-группы" и С. subspathacea. В последнем тесте для растений, определенных как гибрид С. aquatilis х С. salina, только два карельских растения (остальные пять не были отнесены ни к одной из групп) и большинство растений из Мурманской области (6; три не были отнесены ни к одной из групп) были отнесены к симулированному гибриду первого поколения между С. aquatilis и С. salina.
Три «чистых» вида (С aquatilis, С. subspathacea и С. paleacea) можно различить по комбинации морфологических признаков (прил. 6). Растения, отнесенные к С. paleacea, отличаются от двух других видов по длинным остям на колосковых чешуях (в среднем 5.8 мм, отсутствует у других таксонов) и по гораздо более длинным ножкам женских колосков (46 мм по сравнению с 0-9 мм у двух других видов). Растения, отнесенные к С. subspathacea, можно отличить от С. aquatilis в основном по количественным признакам, таким как длина генеративных побегов (178±34 мм и 387±130 мм соответственно), ширина верхнего листа (2.7±0.6 мм и 4.0±0.7 мм) и длина нижнего женского колоска (9±1 мм и 39±15 мм).
Морфология двух предположительно гибридогенных таксонов (С salina и С. recta s.l.) была чрезвычайно изменчивой, их невозможно уверенно отличить друг от друга или от «чистых» видов по измеренным признакам (прил. 6). Также не было обнаружено морфологических различий между тремя генетическими группами С. recta s.l. или между растениями, предварительно отнесенными к С. recta s.str. и С. halophila.
Две генетические группы, выявленные внутри образцов, определенных как С. aquatilis х salina, по морфологии различались слабо (прил. 6). Например, карельские растения были немного мельче мурманских (длина генеративных побегов: 433±155 мм и 702±204 мм соответственно) и имели более короткие ножки женских колосков (10±5 мм и 44±9).
Растения, отнесенные предварительно к трем «чистым» видам (С aquatilis, С. paleacea и С. subspathacea) сформировали крайние части морфологического и генетического континуума; все остальные образцы характеризовались промежуточной морфологией и генетической изменчивостью. Этот результат является ясным свидетельством в пользу интенсивного потока генов, подтверждая представление обо всей группе С. salina, включая С. aquatilis, на Кольском полуострове как о едином биологическом виде (Elven et al., 2005).
Результаты анализа генетических данных в программе STRUCTURE и с помощью тестов назначения показали, что растения, относимые к С. recta s.L, генетически гетерогенны и полифилетичны (рис. 19). Наши данные согласуются и с американскими представлениями о происхождении С. recta (Cayouette, Morisset, 1985; Standley, 1990) (то есть гибрид С. aquatilis х paleacea, называемый С. recta s.str.), и с европейскими представлениями (Elven et al., 2005) (гибрид С. aquatilis х salina, называемый С. halophila). Кроме того, некоторые растения, определенные как С. recta s.L, в результате анализа в программе STRUCTURE были отнесены к "subspathacea-rpynne", оказавшись генетически очень близкими к растениям, определенным как С. salina. Однако это разделение С. recta s.L на три группы не согласуется ни с морфологической изменчивостью, ни с предварительным разделением растений на С. recta s.str. и С. halophila.