Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 8
1.1. Систематическое положение и морфология Dirofilaria immitis 9-12
1.2. Жизненный цикл Dirofilaria immitis 12-14
1.3. Распространенность дирофиляриоза у людей и животных 14-18
1.4. Физико-географические и природно-климатические особенности Астраханской области, способствующие распространению Dirofilaria immitis .18-20
1.5. Дефинитивные хозяева Dirofilaria immitis 20-21
1.6. Промежуточные хозяева Dirofilaria immitis 21 -22
1.7. Патогенетическое воздействие на организм «хозяина» Dirofilaria immitis 23-25
1.8. Диагностика паразитирования Dirofilaria immitis 25-35
ГЛАВА 2. Материалы и методы собственные исследования 36-39
ГЛАВА 3. Биологические аспекты паразитирования dirofilaria immitis среди собак городской популяции
3.1. Дефинитивный хозяин дирофиляриоза (D. immitis). Учет поголовья собак и кошек в городе Астрахани 40-45
3.2. Категории и группы городской популяций собак и кошек 45-48
3.3. Динамика заболеваемости дирофиляриозом (D. immitis). в городе Астрахани в течение 2003-2007 годов. Прижизненная диагностика дирофиляриоза (D. immitis) 48-56
3.4. Фактор передачи дирофиляриоза (D. immitis) 56-57
3.5. Результаты патологоанатомических исследований 58-66
ГЛАВА 4. Разработка метода диагностики паразитирования dirofilaria immitis у плотоядных
4.1. Приготовление антигена 67-69
4.2. Апробация метода 70
4.2.1. Получение антисывороток 70-73
4.2.2.Идентификация антигенов 74-77
4.2.3. Определение иммунологического родства между полученной антисывороткой и тканями инвазированных животных 77-78
4.2.4. Иммуноэлектрофоретическое исследование антигена 79-81
4.2.5 Испытание предлагаемого метода «Способ определения зараженности собак D. immitis» на конкретных животных 82-85
Обсуждение результатов и заключение 86-100
Выводы 101-103
Практические рекомендации 103
Список литературы 104-123
- Физико-географические и природно-климатические особенности Астраханской области, способствующие распространению Dirofilaria immitis
- Категории и группы городской популяций собак и кошек
- Определение иммунологического родства между полученной антисывороткой и тканями инвазированных животных
- Испытание предлагаемого метода «Способ определения зараженности собак D. immitis» на конкретных животных
Введение к работе
Инфекции и инвазии остаются одной из основных причин инвалидности и смертности людей и животных в мире. По данным Всемирной организации здравоохранения, ежегодно инфекционные и паразитарные болезни уносят свыше 15-16 миллионов человеческих жизней. Официальная медицинская статистика отмечает, что ежегодно в России паразитарными болезнями болеют 1,6 млн. человек [86, 106, 176, 208]. В настоящее время известно много задокументированных случаев паразитозов среди населения, при которых источником и резервуаром возбудителей являются дикие и домашние плотоядные.
Научный интерес к современному собаководству в РФ значительно возрос в связи с расширением его породного состава и широким использованием собак в оперативно - розыскной работе и охранной службе. Высокая затратность обучения ценных пород собак обуславливает повышенный интерес к их здоровью, к разработке новых и совершенствованию традиционных методов диагностики заболеваний собак и лечению больных животных.
По мнению ряда отечественных и зарубежных исследователей [28] собаки не только являются соактантами инфекционных и инвазионных паразитарных систем как хозяева возбудителя, но резервуаром и источником возбудителей зоонозных болезней для других видов животных и человека. Будучи паразитами, гельминты наносят вред здоровью собак, а попадая в окружающую среду, загрязняют ее и создают предпосылки пространственной аппликации на территории и расширения популяционных границ. Биологический цикл развития гельминтов в основном протекает в организме животных и человека, а также в природной среде, которые всегда находятся в экологической взаимосвязи.
В условиях крупных городов нозологический профиль заразной патологии собак является показателем нестабильным как по набору нозоформ, так и по уровню биологического проявления. До сих пор многие биологические аспекты проявления заразных болезней собак еще недостаточно изучены и объяснены. К числу таких заразных болезней собак в условиях Астраханской области относится дирофиляриоз, вызываемый нематодой Dirofilaria immitis.
Недостаточная изученность функционирования данной паразитарной системы в условиях Астраханской области, методы ее ранней диагностики и определили выбор темы и направления наших исследований.
Цель исследования: изучение распространения дирофиляриоза, вызываемого D. immitis в условиях Астраханского региона; установление биологических особенностей парзитирования нематоды Dirofilaria immitis у собак и разработка нового метода диагностики паразитирования Dirofilaria immitis у плотоядных.
Для достижения цели, в ходе исследования решались следующие задачи; установить восприимчивое поголовье дефинитивных хозяев Dirofilaria immitis, количественно изучить городскую популяцию собак и кошек в городе Астрахани; дать сравнительную оценку зараженности дирофиляриозом (D. immitis) собак в различных районах города, определить влияние возраста, пола, породы, типа содержания животных на зараженность Dirofilaria immitis. изучить промежуточных хозяев и их зараженность личинками диро-филярий, в различное время года; оценить степень летальности и биологические особенности паразитирования Dirofilaria immitis; - разработать унифицированную методику выявления носительства Dirofilaria immitis у плотоядных. Научная новизна работы заключается в том, что впервые количественно определено поголовье собак и кошек, проживающих в условиях города Астра- хани. Изучен биологический цикл развития нематоды Dirofilaria immitis у собак в условиях конкретного региона. Выяснено влияние пола, породы, условий содержания на зараженность собак дирофиляриями (D. immitis) и летальность. Разработан и внедрен новый метод диагностики дирофиляриоза (D. immitis).
Практическая значимость. Результаты исследований могут быть использованы для дальнейшего изучения данной нозоформы, разработки комплекса противоэпизоотических и эпидемиологических мероприятий при ди-рофиляриозе (D. immitis). Знание биологических особенностей паразитирова-ния D. immitis у собак в конкретном регионе, поможет в постановке диагноза и прогнозировании планирования профилактических и лечебных мероприятий, направленных на снижение заболеваемости и смертности животных.
Метод диагностики паразитирования Dirofilaria immitis, отличается высокой чувствительностью и специфичностью и может быть использован для установления паразитирования на любой стадии болезни и любой интенсивности инвазии.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
Распространение дирофиляриоза, вызываемого D. immitis у собак в г.Астрахани;
Влияние сезона года, пола, возраста, породы и типа содержания собак на зараженность их/), immitis;
Метод определения паразитирования Dirofilaria immitis, как способ диагностики при любой интенсивности инвазии и стадии болезни.
Апробация работы и внедрение в практику. Основные положения диссертационной работы доложены на научно-практических конференциях: «Проблемы ресурсодобывающего производства и переработки экологически чистой сельскохозяйственной продукции» (Астрахань, 2006 г.); «Актуальные проблемы современных аграрных технологий» (Астрахань, 2006 г.); «Актуальные проблемы современных аграрных технологий» (Астрахань, 2007 г.); научно-практическом симпозиуме «Лабораторная медицина: инновационные технологии в аналитике, диагностике, образовании, организации» (Москва, 2008 г.); объединенном иммунологическом форуме (С-Петербург, 2008 г.), V Международной научно-практической конференции «Aktualne problem no-woczesnych nauk -2009» (Przemysl, 2009), научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (Москва, 2009).
Результаты проведенных исследований были апробированы и используются в лабораториях следующих кафедр: молекулярной биологии, генетики и биохимии ГОУ ВПО «Астраханский государственный университет»; общей и биоорганической химии ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия». Предлагаемый метод диагностики был апробирован на группе собак, внедрен в практику в клиниках ветеринарной медицины города Астрахани и применяется в работе профильной лаборатории ГУ АО «Астраханская областная ветеринарная лаборатория».
По результатам исследований подана заявка на изобретение №2007131172 от 15.08.2007г. и получен патент на изобретение «Способ определения зараженности собак Dirofilaria immitis» № 2371145 от 27.10. 2009г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных статей, в том числе - 4 в изданиях из списка, рецензируемых ВАК Российской Федерации (журналы: «Вестник АГТУ» (2007), «Клиническая лабораторная диагностика» (2008), «Российский иммунологический журнал» (2008), «Ветеринарная Практика» (2008)).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, главы с описанием методов исследования, двух глав собственных результатов, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 123 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 29 таблицами и 12 рисунками. Указатель литературы включает 213 источников, в том числе 162 отечественных и 51 иностранных.
Физико-географические и природно-климатические особенности Астраханской области, способствующие распространению Dirofilaria immitis
Астраханская область расположена на юго-востоке Восточно-Европейской равнины в пределах Прикаспийской низменности, зоне пустынь и полупустынь. Область протянулась по обе стороны от Волго-Ахтубинской поймы на расстоянии более 400 км. Основной ландшафт области - полого-волнистая пустынная равнина, осложненная массивами бугров, песков, сухими ложбинами, озерами, карстовыми формами рельефа и др. Климат Астраханской области умеренный, резко континентальный - с высокими температурами летом, низкими - зимой, большими годовыми и летними суточными амплитудами температуры воздуха, малым количеством осадков и большой испаряемостью. Средняя годовая температура воздуха изменяется с юга на север от 10С до 8С. Самый холодный месяц - январь, средняя температура понижается до минус 5-9С. Самая высокая средняя температура 26-28С отмечается в июле. Амплитуда самого холодного и самого теплого месяцев составляет 29 - 34С, что говорит о высокой континентальное климата. Изменение климата в последние годы на фоне общего потепления все чаще приводит к развитию экстремальных природных явлений - участились тайфуны, стало больше наводнений, засух, расширяется зона опустынивания. Средняя температура воздуха в зимний период постепенно понижалась с 9,3С (1941 - 1950 годы) до 11,0С (2000 - 2007 годы).
При этом в 2006 году отмечен рекордно холодный январь, среднемесячные температуры воздуха в Астрахани составили — 11,2С, что ниже климатической нормы на 5 - 8С. Именно в этот год из-за значительных изменений температурного режима, был нарушен цикл развития комаров, что привело к их уменьшению и так же сказалось на развитии дирофиляриозной инвазии в области. В 2007 году январь был аномально теплым, средние температуры воздуха составили + 2,5С, что привело к значительному увеличению численности комаров и в последующем к увеличению заболеваемости дирофиляриозом. Изменение температурного режима в Астраханской области имеет приоритетное значение в распространении дирофиляриоза - из-за высоких летних температур высыхают и заболачиваюся лиманы и другие мелководные водоемы, что, в сою очередь приводит к новым местам выплода комаров и, следовательно, увеличению их численности. Следует отметить, что возрастание сроков весенне-осенних сезонов приводит к значительному увеличению росту жизнедеятельности кровососущих и, соответственно, увеличению сроков заражения дирофиляриозом. Очаги дирофиляриоза формируются возле водоемов с чистой водой, а также близи мелководных ильменей. Населенные пункты области находятся в прямой близости к воде - рекам Волга и Ахтуба, а также в пойме, что указывает на благоприятные условия распространения дирофиляриоза по всей Астраханской области - как в дикой природе, так и в урбанизированной местности. Растительный мир области небогат. По берегам мелководных участков (ильменей, култуков, пойм) обильно произрастают тростниковые и камышовые, которые служат источником питания комариных. Животный мир области достаточно разнообразен. Во всех районах в степных зонах распространены дикие плотоядные - лисы, волки, енотовид собаки и др., что может способствовать распространению и сохранению очагов дирофиляриоза в дикой природе [45, 139, 140, 142].
На территории области, в непосредственной близости от населенных пунктов, вблизи водоемов с чистой водой, обитают большие популяции комаров, их видовой состав весьма разнообразен — Anopheles maculipennis, A.bifurcatus, Culexpipiens и др. Дирофиляриозом болеют собака, красная лисица, волк, динго, японский волк, домашняя кошка, пантера, рысь, тигр, дикая кошка, тюлень, морской лев, бурый и белый медведи, ондатра, норка, хорек, орангутанг, гиббон [6, 12, 132]. Распространенные на территории России Dirofilaria repens и Dirofi-laria immitis являются облигатными паразитами домашних и диких плотоядных животных семейства псовых, кошачьих и виверровых, Dirofilaria ursi -бурого медведя и амурского тигра [65, 69, 91, 127, 155]. В настоящее время в мире насчитывается более 400 пород собак, которые условно делятся на 4 группы: служебные, охотничьи, комнатно-декоративные и бойцовые. В «десятку» пород, наиболее подверженных заражению дирофиляриозом вошли шесть пород из служебной группы (немецкая, восточноевропейская, среднеазиатская овчарки, ризеншнауцер, доберман-пинчер, боксер), две — из охотничьей (английский кокер-спаниель, афганская борзая), одна — из бойцовой (американский стаффордшир) и беспородные собаки [156, 159, 160]. Некоторые авторы [156, 157, 158], анализируя динамику зараженности дирофиляриями собак по их хозяйственному назначению наиболее часто выявляли дирофиляриоз (D. immitis) у бездомных (7,4%) и служебных (6,8%) собак. Несколько ниже были заражены дирофиляриями охотничьи (5,5%) и бойцовые (3,6%) собаки, спорадические случаи инвазии выявлены у комнат-но-декоративных собак. Заражению дирофиляриозм (D. immitis), подвержены все животные, независимо от пола, возраст зараженных собак составляет — от года и старше. Для человека D. immitis не является облигатным паразитом. Дирофи-ляриоз выявляется среди лиц самых разных возрастных групп. Максимум пациентов приходится на возраст 30-39 лет, однако существенных различий по возрастной заболеваемости не наблюдается. Явный минимум - 1-9 лет. Среди инвазированных преобладают лица женского пола (64,6%) [96].
Категории и группы городской популяций собак и кошек
Исходя из потенциальной возможности заражения животных дирофи-ляриозом (D. immitis), мы условно поделили городские популяции кошек и собак на несколько категорий, по типу их содержания, взяв за основу классификацию, предложенную И. М.Зубаревой, 2001 г. [51]. Поголовье городских кошек в данное время представлено следующими категориями: средой; В — полувольные кошки, живущие иногда в квартирах или в частных домах, имеющие возможность находиться на улице; С — бродячие или бездомные кошки, живущие в подвалах, чердаках и других местах. Породистых кошек незначительное количество - в основном это кошки смешанных пород или беспородные. В настоящее время в мире насчитывается более 400 пород собак, которые А.П.Умельцев, (2001), условно поделил на 4 группы, по хозяйственному назначению: служебные, охотничьи, комнатно-декоративные и бойцовские. По способу содержания поголовье городских собак мы также разделили на категории с учетом вышеперечисленных групп: А — домашние собаки, место обитания — городские квартиры и дома, места прогулок - улицы города и дворы; в данной группе - в основном породистые животные - комнатно-декоративных и служебных пород, бойцовские, а также охотничьи породы собак, хозяева которых имеют дачные участки или выезжают на природу; В - цепные собаки, место обитания и прогулок — частный сектор, изолированные дворы; в данной группе в основном собаки крупных пород -служебные и бойцовские, а также беспородные крупные собаки; С - бродячие или бездомные собаки, местом обитания которых является все свободное жизненное пространство города и пригорода; это, в основном, беспородные животные, хотя есть и породистые собаки, брошенные хозяевами; все различных размеров. С точки зрения функционирования паразитарной системы в городе
Астрахани показательны все категории. На территории Астраханской области 5 городов и значительное количество сел и поселков, но способы содержания животных и их хозяйственное назначение аналогично областному центру, т.е. можно достоверно утверждать, что проведенный анализ восприимчивого поголовья плотоядных к дирофиляриозу (D. intimitis) в г. Астрахани идентичен всей Астраханской области. Исходя из полученных ранее учетных данных, поголовье собак и кошек г. Астрахани мы распределили на категории по районам города; полученные результаты отражены в таблице 3 (на 1000 человек). Наиболее многочисленной категорией у собак является «В» - «цепные» собаки, как в Кировском - 24,2%, так и в Советском - 49% районах; у кошек -категория «В» - полувольные кошки - как в Кировском - 21,2%, так и в Советском — 42%. Эти категории животных значительное время пребывают на улице и подвержены укусам комаров. В Советском районе преобладание животных из категорий «В» в сравнении с Кировским районом — в 2 раза. Так же заметно, что процент бродячих животных - категория «С», остается высоким, и превалирует в 2 раза над домашними животными. Эта категория животных наиболее мобильна и может способствовать распространению дирофиляриоза (D. immitis) не только на территории города, но и по всей области. В период курортного летнего сезона многочисленная группа бродячих животных мигрирует в места отдыха людей — дачные поселки, базы отдыха, детские лагеря и другие места, перемещаясь при этом на значительные расстояния в разные районы области и увеличивая зону распространения дирофиляриоза (D. immitis) и риск заражения людей и привозных животных.
Чаще всего заболевание собак дирофиляриозом (D. immitis) протекает бессимптомно, так как взрослые гельминты в незначительном количестве могут локализоваться в правом желудочке сердца, легочной артерии и по разным данным от 4 месяцев до двух лет не вызывают видимых клинических изменений. Начиная с 2003 года, в Астраханской области наблюдается тенденция к нарастанию числа случаев гибели собак от дирофиляриоза, (А immitis) что, в свою очередь, усилило внимание к этой проблеме со стороны ветеринарной и медицинской службы. В различные периоды мы проводили исследования крови собак, различных категорий и групп из районов города (табл. 4). Целью наших исследований было проанализировать и осветить все группы и категории собак, встречающихся на наблюдаемой территории. Методом толстой раздавленной капли провели исследования у 50 собак (6,25%), микрофилярии обнаружили в 4 случаях (2,5%), в остальных случаях (93,75%)) исследования проводили методом тонкого фиксированного мазка с последующей окраской по Романовскому-Гимзе. Всего микрофилярии обнаружены у 159 собак. Морфологические и анатомические признаки микрофилярии изучали после окраски мазков (155 проб). Размеры микрофилярии составили от 0,158 до 0,223 мм, в среднем 0,193±0,01 мм в длину, и от 0,004 до 0, 006 в среднем 0,005±0.0002 мм в ширину.
Головной конец микрофилярии слегка вытянут, конической формы, затемнен, крупнее остальной части тела, хвостовой конец длинный, конической формы сильно ссужен на конце, экскреторная и анальная поры неокрашены. Обнаруженных микрофилярии дифференцировали до вида, проводя дифференциальную диагностику. Так микрофилярии D. repens значительно крупнее, имеют размер 0,270-0,375 мм в длину, и ширину - 0,006-0,008 мм, головной конец имеет округлую форму, он короткий и прозрачный, большой каудальный конец, экскреторная пора остается неокрашенной и четко выделяется только анальная пора. Микрофилярии Dipetalontma reconditum имеют тонкий и длинный хвостовой конец, их длина - 0,241-0,287 мм, ширина 0,003-0,004 мм. В 135 мазках крови (87%) обнаруженные микрофилярии идентифицированы как микрофилярии/). immitis, микрофилярии в 20 мазках крови (13%) из-за плохой видимости вызывали сомнения, но по клиническим признакам у больных животных (учащенное дыхание, блуждающий взгляд, отдышка, быстрая утомляемость и т.д) были приравнены к идентифицированным как D. immitis. Проведенные исследования крови собак за 2003 - 2007 годы показали, что заболеваемость собак дирофиляриозом (D. immitis) в г. Астрахани от года к году возрастает; исключение составляет 2006 год - именно в этот год в связи со значительным изменением климатических условий (холодное лето) бы
Определение иммунологического родства между полученной антисывороткой и тканями инвазированных животных
Иммунологическое родство между различными антигенами можно оценить, проводя реакции преципитации в соседних лунках. Образованные каждым из антигенов линии могут либо полностью сливаться - это указывает на иммунологическую идентичность, либо сливаться частично и образовывать так называемую «шпору» - это свидетельствует о частичном родстве антигенов, либо, в случае неродственных антигенов, пересекаться. Для установления иммунородства нами использовался пул сывороток крови инвазированных собак и антиген-экстракты сердца и легких. Лунки в агаровом геле заполняли по следующей схеме (рис 10). Для проведения данного анализа мы приготовили антиген-экстракты из сердца и легких, взятых у погибших животных, инвазированных D. immitis. Экстракты готовили вышеописанным способом, содержание белка, определенное рефрактометрическим методом составило: сердце - 13,3 ± 0,1 г/л (Р 0,01); легкое - 12,8 ± 0,1 г/л. (Р 0,01) Также от больных дирофиляриозом (D. immitis) собак брали кровь для приготовления сывороток. Проведение данного исследования мы считали необходимым, так как половозрелые гельминты паразитируют именно в кровеносных сосудах этих органов. Иммунодиффузию проводили в трех повторениях во влажной камере при температуре + 4 С. Через 24 часа определяли результаты реакции. Линия преципитации образовалась между антисывороткой и антигеном, других линий преципитации нет, что доказывает отсутствие иммунологического родства между полученным нами антиген-экстрактом и сывороткой инфицированных животных. В связи с тем, что чувствительность иммунодиффузного метода не всегда может достаточно точно свидетельствовать об отсутствии реакции идентичности или же частичной идентичности между антигенами, следующим этапом нашей работы было проведение иммуноэлектрофореза.
При иммуноэлектрофорезе исследуемый антиген сначала фракционируют электрофоретически, а затем полученные фракции анализируют на той же пленке методом двойной иммунодиффузии при помощи антисыворотки, внесенной в траншею, которая расположена параллельно направлению элек-трофоретического разделения. Электрофорез проводили в агаровом геле, содержащем буфер рН (8,6) и ионной силы (0,1). Белки в агаровом геле быстро мигрируют, легко экстрагируются, хорошо окрашиваются, возможно денситометрирование электро-фореграмм. В качестве буферной смеси использовали буфер (аналог меди-нал-вероналового). Буферный раствор в соответствии с инструкцией готовили заранее. Содержимое флакона с концентратом буферного раствора переносили в мерную колбу (цилиндр) объемом 500 мл, добавляли дистиллированную воду до метки и перемешивали. Готовый раствор выдерживали сутки в холодильнике, после чего готовили на нем 1% агаровый гель, который разливали на стеклянные пластины 18x13 см, заранее рассчитав его количество, чтобы получилась пленка толщиной 1 мм. После того, как агар-агар застывал, резцом вырезали в нем лунки. В камеру для электрофореза буферный раствор заливали холодным. Для внесения антигена использовали лунки круглой формы, вносили в них антиген в объеме 20 мкл, приготовленный из нематод D. immitis. Дальнейшая пробоподготовка была стандартной, для проведения подобного рода исследований.
После электрофоретического разделения вырезали продолговатые траншеи для антисывороток, в качестве которых использовался пул сыворо ток иммунизированных кроликов, сыворотки собак, инвазированных Dirofi-laria immitis, пул сывороток здоровых собак, экстракты из сердца и легких больных дирофиляриозом (D. immitis) собак. После внесения антисывороток в траншеи пластинку ставили на 7 дней в герметически закрытую влажную камеру. После появления дуг преципитации для удаления балластных белков пластинку отмывали в течение 3 дней в 5% растворе хлорида натрия, высушивали и окрашивали Амидо черным, для чего пластинку помещали на 5 минут в раствор красителя, а затем в 5% раствор уксусной кислоты до отбеливания фона. Было установлено, что дуги преципитации сформировались только между лунками с антигеном из дирофилярий (D. immitis) и траншеями, в которые была добавлена сыворотка иммунизированного нами кролика, а так же между антигеном и сыворотками инфицированных собак. Во всех остальных случаях подобные дуги отсутствовали. На рисунке 11 представлена схема электрофореза полученного при использовании описанного метода (вариант с антигеном из дирофилярий (D. immitis) и сывороткой кролика). Таким образом, в результате проведенных испытаний, получено достоверное подтверждение высокой иммунологической частоты (отсутствие перекрестно реагирующих антител, проверенной в два этапа — иммунодиффу-зией по Ухтерлони, а затем, с использованием иммуноэлектрофореза) и эффективности предлагаемого нами метода. Только его достоверно подтвержденная иммунологическая чистота позволила нам рекомендовать его к широкому применению. «Способ определения зараженности собак D. immitis» является высоко специфичным и чувствительным (98% и 97% соответственно) методом диагностики паразитирования нематод D. immitis у собак, также этот метод можно использовать и для диагностики паразитирования данных гельминтов и у других животных.
Испытание предлагаемого метода «Способ определения зараженности собак D. immitis» на конкретных животных
Для проведения дальнейшей апробации нами была выбрана группа животных, спонтанно зараженных дирофиляриозом (D. immitis), выявленных по клиническому осмотру, аускультации. При выборе контрольных групп животных учитывали породу и возраст. Возраст животных составил - от 7 до 13 лет. 25 собак из общей группы — это животные, содержащиеся в собачьем питомнике, остальные животные - у частных владельцев. Всех собак разбили на группы по породам. Перед началом эксперимента у всех животных взяли венозную кровь и исследовали на наличие микрофилярий D. immitis по модифицированному методу Кнотта. У всех животных параллельно вышеописанным исследованиям получали венозную кровь и приготовляли сыворотки путем отстаивания и удаления сгустков. Сыворотки хранили в холодильнике при температуре +2...+4С. Далее проводили постановку реакции преципитации в агаровом геле, согласно методике «Способ определения зараженности собак D. Immitis». Ранее приготовленный антиген из Dirofilaria immitis и сыворотки крови наблюдаемых собак вносили в вырезанные пробойником лунки агара, по следующей схеме: в центральную лунку вносили антиген (АГ) по периферии помещали сыворотки (С) собак опытной группы, как показано на рис. 12. Постановку реакции проводили во влажной камере в трех повторениях; реакции на трех стеклах прошли идентично. Тех собак, сыворотка которых преципитировала с антигеном, оставили для наблюдения. Животных контрольной группы (10 собак), с согласия владельцев не лечили, они служили в качестве контроля. За животными проводили еженедельное наблюдение, вели журнал учета, где фиксировали проявление клинических признаков дирофиляриоза (D. immitis) и гибель животных. В результате проведенного эксперимента за период 2006 - 2008 года диагноз, поставленный реакцией преципитации, был подтвержден патолого-анатомически, все животные контрольной группы были заражены именно Di-rofilaria immitis.
Структура инфекционной и инвазионной патологии в последние годы претерпела существенные изменения, обусловленные как открытием новых неизвестных агентов, так и изменением роли и удельного веса, известных ранее возбудителей. Паразиты — простейшие и черви - по некоторым оценкам [72] поражают от 20 до 30 % человечества. Собаки являются соактантами сформировавшихся паразитарных систем. В то же время не налаженная система их учета и отсутствие данных об их количестве в конкретных регионах об объективных параметрах этой популяции и в частности об их эпизоотологической и эпидемической опасности. В настоящее время данные о численности собак носят весьма приблизительный характер. Одной из целей наших исследований было выявление восприимчивого к дирофиляриозу (D. immitis) поголовья плотоядных (собак и кошек) на территории города Астрахани. Внимание к изучению дирофиляриоза (D. immitis) собак в последние годы, наблюдается со стороны биологов, медиков и ветеринаров многих государств мира, где эта инвазия подлежит официальной регистрации и разработаны законодательные акты по контролю над ней. Хотя Dirofilaria immitis давно известна специалистам, тем не менее, ее роль в инвазионной патологии животных и человека значительно изменилась, причем расширился как удельный вес этой инвазии, так и географический ареал ее распространения. Этому способствует, с одной стороны, определенный прогресс в области лабораторной и клинической диагностики, с другой - антропогенная трансформация среды, влияющая на условия репродукции возбудителя, пути передачи инфекции и восприимчивость отдельных групп риска.
Как нам представляется, место и роль дирофилярий (D. immitis) в инвазионной патологии человека и животных, а также теоретические предпосылки к разработке достоверных методов наличия инвазии на любой стадии наиболее полно можно охарактеризовать со следующих позиций: изучение иммунологических методов диагностики гельминтозов — одно из первых направлений, по которому вели экспериментальные исследования специалисты в нашей стране и за рубежом. При гельминтозах, возбудители которых обитают непосредственно в тканях или мигрируют по кровеносному руслу и внутренним органам хозяина, наиболее эффективными оказались иммунологические реакции, в настоящее время их применяют при некоторых парентеральных гельминтозах (эхинококкоз, шистозоматоз, трихинеллез, и др.), а также энтеральных (аскаридоз) [38, 56, 70, 134, 144, 150, 177, 205, 209]. Иммунологические методы диагностики гельминтозов (в данной работе - способ диагностики дирофиляриоза (D. immitis) собак), будучи самостоятельной проблемой современной ветеринарии, связывает ряд смежных проблем: природной очаговости болезней, паразитирования гельминтов у животных и человека, факторов передачи инвазий, иммунного ответа при паразитозах. Весьма актуальная сегодня, эта проблема может многократно обостриться в результате климатических изменений и дальнейшего усиления миграционных процессов. В последние годы большое значение придается изучению взаимоотношений в системе паразит-хозяин. Известно, что эволюция отношений паразита и хозяина привела к появлению у первого специфических механизмов контроля физиологического статуса хозяина, направленных на перестройку его организма в целях создания оптимальных условий для развития и размножения паразита. Характер иммунного ответа, индуцированного гельминтами, во многом определяется их морфологическими и биологическими особенностями. Иммунитет при гельминтозах отличается слабой напряженностью и низкой специфичностью. В литературных источниках [57, 76, 87, 89, 154, 174] содержатся сведения, что иммунологические реакции при гельмин
