Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Особенности понятия «вид» и «популяция» у водорослей (обзор литературы) 8
1.1. Современные концепции вида у водорослей 8
1.1.1. Морфологическая концепция 8
1.1.2. Филогенетическая концепция 10
1.1.3. Биологическая концепция 12
1.1.4. Полифазный подход в альгологии 14
1.1.5. Значение экспериментальных исследований вида 16
1.2. Особенности популяций водорослей 17
ГЛАВА 2. Характеристика вида Nitzschia pAlea (KTZ.) W. SM 19
2.1. Таксономия 19
2.2. Генетика 22
2.3. Цитология 28
2.4. Морфология 32
2.5. Физиология 34
2.6. Размножение 35
2.7. Экология 36
2.8. География распространения 37
Глава 3. Материалы и методы 39
Глава 4. Результаты и обсуждение 54
4.1. Биологические особенности клонов Nitzschia palea 54
4.1.1. Филогенетический анализ 54
4.1.2. Морфология и морфометрия 57
4.1.2.1. Морфология и морфометрия клонов Nitzschia palea из некоторых местообитаний 57
4.1.2.2. Морфологические изменения клона Че3ч Nitzschia palea в 64 процессе онтогенеза
4.1.3. Особенности репродуктивных отношений некоторых клонов Nitzschia palea 67
4.1.4. Онтогенез и жизненный цикл Nitzschia palea 72
4.1.5. Количественный состав липидов некоторых клонов Nitzschia palea 74
4.2. Воздействие некоторых экологических факторов на
Ntzschia palea (Ktz.) W. Sm. 77
4.2.1. Влияние солености на скорость размножения и смертность некоторых клонов Nitzschia palea 77
4.2.2. Воздействие антибиотиков и фунгицидов на Nitzschia palea и ее сопутствующую микрофлору 88
4.2.3 Взаимоотношение некоторых клонов Nitzschia palea c
микромицетами видов Fusarium oxysporum и Bipolaris
sorokiniana 93
4.3. Экспериментальный анализ возможности миксотрофного питания у клонов Nitzschia palea 98
4.4. Анализ влияния географического распространения и местообитаний клонов Nitzschia palea (Ktz.) W. Sm. на их биологию и экологию 106
Выводы 112
Литература 114
- Биологическая концепция
- Цитология
- Морфология и морфометрия
- Влияние солености на скорость размножения и смертность некоторых клонов Nitzschia palea
Введение к работе
Актуальность (введение). Представители отдела
Bacillariophyta встречаются в различных водных и наземных экосистемах. Они составляют более 80% альгофлоры, создают 50% всей биомассы морей и океанов и почти глобальной продукции Земли. При этом они ежегодно фиксируют до 25% мировых выбросов диоксида углерода и являются основным звеном трофических цепей водных экосистем (Вассер, 1989; Gordon et al., 2009).
Особенности биологии и экологии диатомовых водорослей сильно зависят от таксономической принадлежности. На сегодняшний день морфология, морфометрия и генетика Nitzschia palea (Ktz.) W. Sm. детально изучены у популяций из других регионов мира (Trobajo et. al., 2009; 2010), однако подробные исследования клонов этого вида с территории Российской Федерации ранее не проводились.
Цель работы – проанализировать биологию и экологию
клональных популяций Nitzschia palea (Ktz.) W. Sm.
(Bacillariophyta) из различных местообитаний Урала и
Центральной России для уточнения пластичности и
таксономических границ вида.
Задачи исследования:
-
Провести анализ особенностей генетики, морфологии и морфометрии некоторых клонов Nitzschia palea.
-
Исследовать у этих клонов репродуктивные отношения, онтогенез и жизненный цикл, а также количественный состав липидов.
-
На примере NaCl изучить воздействие одного из важных абиотических факторов на цитологию, смертность и скорость размножения некоторых клонов Nitzschia palea.
-
На примере антибиотиков, фунгицидов, микромицетов рассмотреть влияние некоторых биотических факторов на клональные популяции Nitzschia palea.
-
Исследовать возможность миксотрофного питания некоторых клонов Nitzschia palea.
-
Провести анализ влияния географического распространения и местообитаний клонов Nitzschia palea на их
биологию и экологию.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Клоны Nitzschia palea, выделенные с территории Урала и Центральной России, отличаются по участку гена rbcL и морфологии от представителей данного вида из других регионов мира.
-
Широкое распространение и устойчивость клонов Nitzschia palea к абиотическим и биотическим факторам обусловлены их высоким адаптационным потенциалом.
-
Некоторые клоны Nitzschia palea способны к гетеротрофному питанию при отсутствии освещенности.
Научная новизна. Из различных местообитаний и географических областей Урала и Центральной России впервые были выделены 16 клонов Nitzschia palea, изучены их биологические и экологические особенности.
Практическая ценность новых научных результатов. У 10 клонов выявлено высокое содержание липидов (до 62 % от сухой массы), зависящее от длины клеток и фазы онтогенеза. Последовательности гена rbcL двух клонов были включены в GenBank: Че3ч под номером KJ729150.1. и Вb5 под номером KJ729149.1. ().
Связь работы с плановыми исследованиями и научными
программами. Исследования были выполнены при поддержке
гранта РФФИ мол_нр № 15-34-50571 «Изучение репродуктивных
отношений между аллопатрическими популяциями вида
диатомовой водоросли Nitzschia palea» (2015 г.); стипендии Главы Республики Башкортостан 2015-2016 гг.
Декларация личного участия. Автором определены цель и
задачи исследования, проведены экспедиции в период с 2013 по
2015 гг., в ходе которых отобрано свыше 35 проб, проведено
определение вида, получены 16 клонов чистых культур Nitzschia
palea, осуществлена постановка экспериментов. Часть
исследований выполнена в соавторстве, что отражено в
совместных публикациях. Ряд теоретических положений
сформулирован совместно с научным руководителем.
Апробация. Результаты исследований были представлены на 8 конференциях: Всероссийская молодежная научно-практическая конференция «Экология родного края: проблемы и пути их
решения» (Киров, 2011); III Всероссийская школа-конференция
молодых ученых УНЦ РАН и Волго-Уральского региона по
физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика – наука
XXI века» (Уфа, 2012); X Международная научно-практическая
конференция «Татищевские чтения: актуальные проблемы науки и
практики» (Тольятти, 2013); Всероссийская молодежная научно-
практическая конференция «Экологические проблемы регионов»
(Уфа, 2013); Abstracts of BIT’s 3rd Annual International Congress of
Algae – 2014 (Dalian (China), 2014); I международная молодежная
научная конференция «Популяционная экология растений и
животных» (Уфа, 2015); Всероссийская научная конференция с
международным участием «Биоразнообразие и механизмы
адаптации организмов в условиях естественного и техногенного
загрязнения» (Сибай, 2015); Всероссийская научно-практическая
конференция с международным участием «Морские
биологические исследования» (Севастополь, 2016).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, из них 5 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для защиты кандидатских и докторских диссертаций, включая 2 статьи в переводных журналах, входящих в список Web of Science.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы (145 наименований, в том числе 101 – на иностранных языках) и приложений. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, включая 16 таблиц и 29 рисунков. Приложение включает 2 таблицы и 16 рисунков и составляет 14 страниц.
Биологическая концепция
Филогенетическая концепция вида Концепция филогенетического распознавания вида близка биологической концепции тем, что разделяет виды по наличию или отсутствию обмена генетической информацией между индивидами и группами. По этой концепции вид является конечным таксоном на кладистическом филогенетическом дереве. Кладистами признаются два типа филогенетических концепций вида: первый – определяет вид как группу организмов, обладающих хотя бы одним общим признаком, а второй – рассматривает вид как монофилетическую группу организмов, обладающих одним или более наследуемыми признаками. В контексте вида термин «монофилетический» имеет два значения: все потомки общего предка вместе с этим предком, и организмы, более тесно связанные друг с другим, чем с каким-либо другим (Паламарь-Мордвинцева, Царенко, 2007).
Характерной особенностью кладистической практики является использование так называемого кладистического анализа (строгой схемы аргументации при реконструкции родственных отношений между таксонами), в строгом понимании монофилии и требования взаимно однозначного соответствия между реконструированной филогенией и иерархической классификацией (Павлинов, 2005).
Но надо отметить, что на топологию получаемых филогенетических деревьев очень значительно влияет выбор молекулярного маркера. Адекватный выбор маркера в соответствии с рассматриваемым таксономическим уровнем представляет собой очень серьезную проблему, на которой редко останавливаются исследователи. Алгоритмы филогенетического анализа (самые широко используемые методы: ближайшего соседа, максимальной экономии и максимального правдоподобия) вне зависимости от качества и количества данных, в любом случае воспроизведут какие-либо деревья. Необходимость тщательного подбора признака или группы признаков, адекватных таксономическому статусу изучаемой группы, хорошо известна морфологам. Эта задача до настоящего времени остается нерешенной. Неправильный выбор маркера со слишком высокой скоростью эволюции в сочетании с коротким фрагментом анализируемой последовательности и небольшими выборками неизбежно приведет к завышенным оценкам уровней дивергенции и в итоге – к необоснованной филогенетической и таксономической схеме (Абрамсон, 2009).
Несмотря на это филогенетическая концепция с каждым годом все шире применяется для решения таксономических проблем у водорослей на более высоком уровне, чем вид. Ряд ученых использовали кладистику также для ревизии низших таксономических групп. Например, в исследованиях зеленой водоросли Avrainvillea (Littler, 1992), где использованы анатомические признаки, выделена только одна группа видов, и показано углубление проблемы с морфологически пластичными водорослями (Паламарь-Мордвинцева, Царенко, 2007). Кладистические методы были широко применены для изучения большой группы Zygnematophyceae хлорофитной линии эволюции (Гончаров, 2005), а также для изучения рода Scenedesmus (Tsarenco et al., 2005).
Отдел Bacillariophyta также тщательно исследуется молекулярно-генетическими и филогенетическими методами (Evans et. al., 2004, Edgar, Theriot, 2004; Quijano-Scheggia et. al., 2009; Amato, Montresor, 2008; Kaczmarska et. al., 2006; Trobajo et al., 2009; Trobajo et al., 2010). В России большое внимание уделяется изучению молекулярными методами эндемичных видов диатомей из озера Байкал (Щербакова 2004; Kulikovskiy et al., 2014; Андреева, 2015).
Концепция биологического вида сводит всю проблему к репродуктивной изоляции. Один из «основателей» концепции биологического вида Е. Майр писал, что вид – это группа фактически или потенциально скрещивающихся природных популяций, репродуктивно изолированных от других подобных групп (Mayr, 1963). В подобном определении имеется ряд недостатков. Прежде всего, такая точка зрения автоматически ведет к отрицанию вида у всех агамных и апогамных форм, существование которых доказано многочисленными прямыми наблюдениями. Для многих групп водорослей характерно только вегетативное размножение, потому биологическая концепция может быть использована только для тех водорослей, у которых известен половой процесс. Д. Манн (Мann, 1995) считает, что биологическая концепция вида может использоваться как практическое руководство для интерпретации модели разнообразия у водорослей. Однако это руководство может быть использовано только для биопарентальных, сексуально репродуктивных организмов.
Н.А. Давидович и О.И. Давидович (2010) исследовали закономерности определения и наследования пола у вида Tabularia tabulata (Ag.) Snoeijs. Авторами было установлено, что у раздельнополого (в генетическом смысле) вида гомоталлизм проявляется у обоих полов. Подобные результаты, ввиду отсутствия иных методов анализа (например, молекулярно-генетических, которые бы позволили идентифицировать гены, отвечающие за проявление пола) могут быть получены только путем изучения полового воспроизведения водоросли в экспериментах с клоновыми культурами. Изучение пола потомства, полученного в результате внутриклонового воспроизведения, показало, что мужской пол является гетерогаметным, а женский – гомогаметным. По мнению авторов, биологическую концепцию вида возможно применять только к разнополым симпатрическим организмам, так как в природе, где таксоны не сталкиваются друг с другом (либо потому, что они растут в разные временные периоды или имеют разные местообитания), или являются бесполыми, не может произойти обмен генов (Давидович, Давидович, 2010).
Биологическая концепция вида, как одна из самых теоретически обоснованных, находит все большее применение в отношении диатомовых водорослей (Amato, 2007). Она позволяет определить наличие репродуктивных границ между популяциями там, где морфологический и генетический критерий не работают, и тем самым установить возможность или невозможность переноса между ними генетической информации.
Цитология
По данным египетских (Abdel-Hamid et al., 2013) и багдадских (Hassan, 2013) ученых содержание липидов в клетках Nitzschia palea сильно зависит от состава минеральной среды, на которой культивируют водоросли, и может составлять от 25 % до 40% биомассы.
Египетские фикологи (Abdel-Hamid et al., 2013) выявили, что липидная фракция этого вида в основном состоит из С16:0 пальмитиновой кислоты (41,13%), пальмитолеиновой кислоты С16:1 (29,25%), С14:0 миристиновой кислоты (9,01%), С15:0 пентадецелиновой кислоты (8,26%), С18:0 стеариновой кислоты (2,32%) и на 3,22% из C18:1 олеиновой кислоты.
Анализ гельпроникающей хроматографии (ГПХ) показал, что липидная фракция, состоит в основном из свободных карбоновых кислот (28,9%), диглицеридов (27,3%), триглицеридов (24,3%) и моноглицеридов (16,3%).
Кроме того, у этого вида высокие значения свободных жирных кислот (FFA) (28,9%) и кислотного числа (57,6 мг КОН / г масла).
Основываясь на профиле GC / MS жирных кислот, а также на физических и химических характеристиках н-гексан липидной фракции, Nitzschia palea оказалась перспективным сырьем для создания биодизеля.
В 2009 г. группа багдадских ученых провела исследования по выявлению антибактериальных свойств у вида Nitzschia palea (Binea, 2008). В этой работе сырой экстракт микроводоросли был протестирован против 10 патогенных и референтных штаммов бактерий (Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15422, P. aeruginosa ATCC 6750, P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli, Serratia marescens). Результаты испытания показали, что грамположительные бактерии в сыром экстракте Nitzschia palea были активны, а вот у грамотрицательных бактерий наблюдалась ограничение активности. Наиболее высокий эффект экстракта был отмечен для тестовых штаммов Micrococcus luteus (зона ингибирования 37 мм) и Staphylococcus aureus (30 мм). Все штаммы Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus epidermidis показали умеренную восприимчивость к экстракту. Самая низкая активность была отмечена у штаммов Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, а вот на E. coli и Serratia marescens экстракт вообще не оказал никакого воздействия.
Опираясь на эти и другие исследования (Findlay et al.,1984; Kellam, Walker, 1989; Aubert et al., 1979), можно утверждать, что вид Nitzschia palea может быть использован для создания антибиотиков.
В работе Р. Тробахо с соавторами (Trobajo et al., 2009) впервые было описано половое воспроизведение вида Nitzschia palea. Авторы указывают, что особям данного вида характерна физиологическая анизогамия (гетерогамия), которую подробно описывал в своих работах Гейтлер (Geitler, 1928; 1968). Две сблизившиеся клетки с разными типами спаривания (тип «+» и тип «–») выделяют слизь, в каждой клетке ядро редукционно делится на 4. Затем 2 ядра дегенерируют, и образуется две гаметы. Одна гамета неподвижна (женская), другая (мужская) способна к амебообразным движениям. Мужские гаметы, амебообразно двигаясь, выползают из раздвинувшихся створок панциря, копулируют и образуют зиготу. Зигота быстро растет, увеличивается в размерах и превращается в ауксоспору. В конце роста она становится крупнее исходной клетки, принимает типичную для вида форму. У нее вырабатывается кремнеземная оболочка.
Диатомовые водоросли – надежные биологические индикаторы состояния окружающей среды, в том числе и солености (Trobajo et al., 2011), которая является одним из важных факторов, влияющих на распределение этих организмов в различных местообитаниях. Вид Nitzschia palea отличается очень большой экологической амплитудой и высоким полиморфизмом (Trobajo et al., 2009). Он широко распространен в бентосе пресноводных водоемов практически на всех континентах, встречается в цианобактериально-водорослевых ценозах (ЦВЦ) почв, пещер и аэрофитона (Trobajo et al., 2009; Абдуллин, Миркин, 2015). Согласно данным С.С. Бариновой с соавторами (2006), по отношению к солености Nitzschia palea является олигогалобом-индифферентом, т.е. солоновато-водным видом.
Сведения об экологии вида Nitzschia palea являются противоречивыми, А.М. Сильва-Бенавидес пишет, что рассчитанный индекс сапробности составляет 0,7, таким образом, вид является индикатором природно-чистой воды (Silva-Benavides, 2001).
Морфология и морфометрия
В исследовании использовался световой микроскоп Микмед-1 (ЛОМО, Россия). Подсчитывали количество живых и мертвых клеток методом прямой микроскопии в 45 полях зрения микроскопа при 20-кратном увеличении. Площадь поля зрения определяли с помощью окуляр-микрометра (Асташкина, 2015).
На основании полученных данных рассчитывали скорость размножения (делений/сутки) и смертность (число мертвых клеток/общее число клеток) различных клонов Nitzschia palea.
Мертвые клетки отличали от живых по наличию пустых панцирей диатомей, не содержавших хроматофоров, или имеющих зеленый хроматофор. Подсчет проводился на вторые и седьмые сутки эксперимента. Скорость размножения рассчитывали по формуле экспоненциального роста: Nt = N0 ert, где Nt – численность клеток в момент времени t, N0 – начальная численность клеток, e – основание натурального логарифма, r – коэффициент размножения, t – время. Полученные данные были обработаны с помощью программ Statistica 8.0 и Microsoft Office Excelle 2007. Методика определения воздействия антибиотиков и фунгицидов на диатомовую водоросль Nitzschia palea и ее сопутствующую микрофлору Материалом для исследования послужили 2 клона (Бр, Пк9ж). Их выращивали на жидкой минеральной среде DM (Mann, Chepurnov, 2004). Посев клонов на картофельный агар с глюкозой (20 г/л) показал их загрязнение бактериальной и грибной микрофлорой.
В исследовании использовали антибиотики (тетрациклин, фуразолидон, ципролет) и фунгициды (нистатин, флуконазол, амфотерицин В) широкого спектра действия.
Отдельные антибиотики, фунгициды и их комбинации добавляли в жидкую питательную среду, разливали в пробирки и вносили исследуемый клон водоросли с концентрацией 2 104 клеток/см3.
Для контроля использовали минеральную среду без антибиотиков и фунгицидов. Клоны культивировали при дневном освещении в течение 5 суток при комнатной температуре, затем оценивали их рост визуально и под световым микроскопом Микмед-1 (ЛОМО, Россия). Для выявления роста сопутствующей микрофлоры клоны после культивирования в среде с антибиотиками и фунгицидами пересевали на картофельный агар с глюкозой (20 г/л).
Взаимоотношение некоторых клонов Nitzschia palea c микромицетами Fusarium oxysporum и Bipolaris sorokiniana
Материалом для исследования послужили 3 клона N. palea (Шт18 – наземный клон; Св26ж, Пк10ж – пещерные клоны) диатомовой водоросли Nitzschia palea.
Перед началом эксперимента клоны были очищены от грибов и бактерий с помощью комбинированного препарата (флуканазол 100 мг/л + ципролет 40 мг/л).
В качестве тест-объектов были использованы 3 штамма микромицетов из музея культур лаборатории прикладной микробиологии УИБ РАН: Bipolaris sorokiniana ИБ Г-12 (фитопатоген, вызывает болезни у злаковых культур), Fusarium oxysporum ВКМ F 51 (фитопатоген, вызывает болезни у злаковых культур и дикорастущих растений), Fusarium oxysporum IB-St-8 (скальные обнажения, очаг биогенной коррозии кальцита, пещера Шульган-Таш, Башкортостан).
Культуры микроорганизмов поддерживали на средах: водоросли на 2% агарозной минеральной среде Громова №6 с силикатом натрия, грибы – на картофельно-сахарозном агаре.
Эксперимент проводили тремя различными методами (Нетрусов и др., 2005): 1) Метод штриха: Водоросли засевали на одну половину чашки Петри с опытной средой (2% агарозная среда Громова №6 с силикатом с добавлением 1% глюкозы) и инкубировали в люминостате в течение 2 суток при комнатной температуре. Затем в чашки с подросшими колониями водорослей на линию границы подсевали уколом культуры микромицетов. Вторая половина чашки Петри оставалась пустой для наблюдения за поведением гриба и направлением его роста. Контролем являлись штаммы грибов, культивируемые на опытной среде без водорослей, посеянные на линию границы. Раздельное и совместное культивирование микромицетов и водорослей продолжалось в люминостате в течение 7 суток при комнатной температуре. 2) Метод капли: Чашка Петри с опытной средой засевалась суспензией гриба с плотностью от 1 105 до 1 106 спор в см3. После этого на газон гриба раскапывалась суспензия водорослей. Экспериментальные чашки культивировались при температуре 20-22 C в течение 7 дней. 3) Метод лунки: Чашка Петри с сахарозно-картофельной средой засевалась суспензией гриба с плотностью от 1 105 до 1 106 спор в см3. После этого в агаре микробиологическим сверлом вырезались лунки, которые заполнялись водорослевым инокулятом. Экспериментальные чашки культивировались при температуре 20-22C в течение 7 дней.
Методика исследования миксотрофии водорослей
Материалом для исследования послужили 3 клона Nitzschia palea (Св30ж, Шт18, СвШ3-2). Перед началом эксперимента клоны были очищены от грибов и бактерий с помощью комбинированного препарата (флуканазол 100 мг/л + ципролет 40 мг/л).
Контролем была среда Dm (Маnn, Chepurnov, 2004), опытной – среда Dm с добавлением глюкозы в концентрации 20 г/л.
Для эксперимента было подготовлено 18 стерильных чашек Петри с контрольной средой и 18 – с опытной средой. Затем стерильными пипетками добавили в каждую чашку по 1 мл накопительной культуры. 9 опытных и 9 контрольных чашек завернули в светонепроницаемую бумагу и убрали в темное место. Оставшиеся аналогичные чашки поставили на затемненный подоконник. Эксперимент длился на протяжении 41 суток.
В исследовании использовался световой микроскоп Микмед-1 (ЛОМО, Россия). Подсчитывали количество живых и мертвых клеток методом прямой микроскопии в 45 полях зрения микроскопа при 20-кратном увеличении. Площадь поля зрения определяли с помощью окуляр-микрометра (Асташкина, 2015).
На основании полученных данных рассчитывали скорость размножения (делений/сутки) и смертность (число мертвых клеток/общее число клеток) различных клонов Nitzschia palea. Мертвые клетки отличали от живых по наличию пустых панцирей диатомей, не содержавших хроматофоров, или имеющих зеленый хроматофор. Подсчет проводился на вторые и седьмые сутки эксперимента. Скорость размножения рассчитывали по формуле экспоненциального роста: Nt = N0 ert, где Nt – численность клеток в момент времени t, N0 – начальная численность клеток, e – основание натурального логарифма, r – коэффициент размножения, t – время. Полученные данные были обработаны с помощью программ Statistica 8.0 и Microsoft Office Excelle 2007.
Влияние солености на скорость размножения и смертность некоторых клонов Nitzschia palea
Клоны Пк9ж и Че3ч ни с одним клоном не вступили в половой процесс, что может быть обусловлено размером клеток клонов. По видимому, клон Пк9ж, имеющий длину створок более 27 мкм, еще не достиг репродуктивной фазы жизненного цикла, а клон Че3ч имеющий длину створки меньше 13 мкм, находится уже в пострепродуктивной фазе.
Осенью 2016 года, когда длина клеток клона Пк9ж начала подходить к репродуктивной стадии развития, была предпринята попытка скрестить его с клонами Пк10ж и Бр. На третий день эксперимента несколько (единичное число) клеток в смеси клонов Пк10ж и Пк9ж начали образовывать гаметангиальные пары, однако ауксоспоры не образовались.
Таким образом, для успешного полового воспроизведения должны быть соблюдены следующие условия: время года (весна, осень), жизненная стадия развития (репродуктивная), и должна быть обеспечена встреча особей разного пола.
Для особей Nitzschia palea характерна зависимость длины инициальных клеток от длины вегетативных клеток, чем длиннее родительская особь, тем длиннее будет инициальная клетка.. Онтогенез и жизненный цикл Nitzschia palea Жизненный цикл пенантных диатомей ранее описывался многими авторами (Drebes, 1977; Mann, 1993; Рощин, 1994; Chepurnov, 2004; Давидович, 2002), в данной работе он подробно рассматривается для вида Nitzschia palea. Онтогенез особи Nitzschia palea состоит из нескольких фаз развития: 1) Дорепродуктивная фаза развития – вегетативная клетка характеризуется размерами клеток от 56 мкм до 25 мкм. Особи имеют линейно-ланцетную форму клеток, концы клювовидные или оттянуто-клювовидные. 2) Репродуктивная стадия развития – вегетативная клетка характеризуется размерами от 25 мкм до 14 мкм. Клетки имеют форму от линейно-ланцетной до ланцетной. Концы клеток могут быть клювовидными, оттянутыми, реже клиновидными. Особи более устойчивы к стрессу, имеют более высокую скорость размножения и обладают способностью вступать в половой процесс. К этой стадии относят ауксоспору и инициальную клетку. 3) Пострепродуктивная стадия развития – вегетативная клетка характеризуется размерами от 14 мкм до 8,5 мкм. Особи имеют форму клетки от ланцетной, эллиптической до широкоэллиптической. Концы клеток – от клювовидных до широкозакругленных. Особи теряют способность к половому воспроизведению. Размер 9-8,5 мкм является критическим – в клетке происходят необратимые процессы: нарушается деление, появляются морфологические уродства, накапливаются генетические мутации, все это в итоги приводит к смерти особи.
Жизненный цикл Nitzschia palea подчиняется закону Мак Дональда – Пфицера: медленное уменьшение размеров клеток в ходе вегетативного размножения, обусловленное вставочным механизмом образования новых половинок панциря при каждом клеточном делении и быстрое восстановление максимальных размеров клеток за счет ауксоспор (Рощин, 1994).
Основная часть цикла развития проходит в диплоидной фазе с гаметической редукцией (рис. 15).
Жизненный цикл Nitzschia palea (Ktz.) W. Sm.: 1 – вегетативное деление клетки, 2 – уменьшение размера клетки в процессе вегетативного деления; 3 – гаметогенез; 4 – ауксоспорообразование; 5 – формирование инициальной клетки; 6 – деление инициальной клетки; 7 – взрослая вегетативная особь; 8 – фертильная клетка (переход в пострепродуктивную стадию развития). Аукоспорообразование можно рассматривать как часть полового процесса в широком понимании. Передача гамет осуществляется при помощи копуляционных каналов. Наличие копуляционных каналов свидетельствует о том, что Nitzschia palea является истинной Nitzschia (sensu stricto) (Рощин, 1994; Trobajo et al., 2009).
Половое размножение у представителей этого вида начинается тогда, когда клетки находятся в подходящих экологических условиях и соответствуют репродуктивной фазе жизненного цикла. Nitzschia palea Было выявлено, что максимальное количество липидов содержалось в клетках клонов ПкБ2-1, СвШ3-2 и Пк9ж. Особи этих клонов находились на дорепродуктивной стадии жизненного цикла (табл. 9, рис. 16). Известно, что именно на этой стадии диатомовые водоросли имеют наибольшую длину (Рощин, 1994).
Морфологические параметры и содержание липидов у некоторых клонов Nitzschia palea (Ktz.) W. Sm. Наименование клона Средняядлина,мкм Средняя ширина, мкм Среднее содержание липидов, % ПкБ2-1 50,61 3,35 51,53 Св26ж 24,69 3,36 39,87 Пк9ж 29,89 3,29 46,69 Пк10ж 21,07 3,03 35,13 Бр 24,85 3,21 41,87 Продолжение таблицы Чх23 15,57 3,17 31,75 Че70р 13,92 3,13 30,60 Св30ж 20,97 3,30 34,58 Шт18 23,28 3,27 37,53 СвШ3-2 44,28 3,32 48,43
Корреляционный анализ выявил статистически значимую положительную взаимосвязь между длиной и содержанием липидов в клетках диатомей всех исследованных клонов (коэффициент Пирсона – 0,9125, р 0,05). Статистически значимая корреляция между шириной клеток и содержанием липидов у всех исследованных клонов отсутствовала (р 0,05) (рис. 16).
Рис 16. Содержание липидов у разных клонов Nitzschia palea на различных стадиях жизненного цикла.
Все клоны были разбиты на три группы в зависимости от их местообитания: пещерные – Пк9ж, Пк10ж, Чх23, Че70р, Св30ж, Св26ж; наземные – Бр, Шт18; лабораторные – ПкБ2-1, СвШ3-2. Различия между содержанием липидов у лабораторных клонов как с пещерными, так и наземными клонами оказались значимыми (р 0,05), статистически значимые различия содержания липидов у пещерных и наземных клонов отсутствовали (р 0,05). По-видимому, это связано, с тем, что все лабораторные клоны находились на дорепродуктивной стадии жизненного цикла и имели наибольшую длину, а пещерные и наземные клоны (кроме Пк9ж) находились на репродуктивной стадии развития (рис. 16).
В безазотной среде количество липидов у клона Св30ж увеличилось с 34,58 % до 44,38 %, у клона Шт18 – с 37,53 % до 47,52 %, у клона СвШ3-2 – с 48,43 % до 61,99 % (табл. 10). Это объясняется тем, что в неблагоприятных условиях клетки начинают больше запасать липидов (Hassan, 2013). Таким образом, наши результаты совпали с данными литературы.