Молекулярные и генетические аспекты диагностики и лечения нозокомиальной пневмонии Кузовлев Артем Николаевич

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Нозокомиальная пневмония - современные принципы диагностики и лечения (обзор литературы)

Определения понятий

Эпидемиология

Этиология и патогенез

Морфологические изменения легких

Генетическая предрасположенность к развитию нозокомиальной пневмонии и острого респираторного дистресс-синдрома

Диагностика нозокомиальной пневмонии

Диагностика острого респираторного синдрома при нозокомиальной пневмонии

Принципы лечения нозокомиальной пневмонии

Принципы лечения острого респираторного синдрома при нозокомиальной пневмонии

Глава 2. Материалы и методы исследования СТР- - -

Материалы и методы клинического исследования СТР- -3-3

Материалы и методы экспериментального исследования СТР-

Глава 3. Белок клеток Клара - новый молекулярный биомаркер наличия " Pseudomonas aeruginosa при нозокомиальной пневмонии

Глава 4. Сурфактантные протеины А и D - новые молекулярные биомаркеры повреждения альвеолярного эпителия II типа при нозокомиальной пневмонии, осложненной острым респираторным дистресс-синдромом

Глава 5. Новые генетические биомаркеры предрасположенности к развитию СТР- "

нозокомиальной пневмонии и острого респираторного дистресс-синдрома

Глава 6. Ингаляционный тобрамицин в качестве дополнения к системной СТР- антибиотикотерапии в лечении нозокомиальной пневмонии

Глава 7. Протективное действие перфторана при повреждении легких, вызванном липополисахаридом (экспериментальное исследование)

Глава 8. Алгоритм диагностики и лечения нозокомиальной пневмонии и нозокомиальной пневмонии, осложненной острым респираторным дистресс-синдромом, у больных абдоминальной хирургической инфекцией

Заключение СТР- Выводы СТР- 175

Практические рекомендации СТР

Список сокращений

• Генетическая предрасположенность к развитию нозокомиальной пневмонии и острого респираторного дистресс-синдрома
• Принципы лечения нозокомиальной пневмонии
• Белок клеток Клара - новый молекулярный биомаркер наличия " Pseudomonas aeruginosa при нозокомиальной пневмонии
• Протективное действие перфторана при повреждении легких, вызванном липополисахаридом (экспериментальное исследование)

Введение к работе

Актуальность проблемы

Несмотря на достижения современной реаниматологии, нозокомиальная пневмония (НП) остается одной из наиболее актуальных проблем и широко распространена в категории больных абдоминальной хирургической инфекцией. Это вторая по встречаемости нозокомиальная инфекция в отделениях реаниматология (25-44%). Нозокомиальная пневмония в значительной степени ухудшает течение абдоминальной хирургической инфекции. Около 50% антибиотиков, назначаемых в отделениях реаниматологии, используются для лечения НП. Нозокомиальная пневмония увеличивает длительность пребывания больных в отделении реаниматологии и летальность [Карпун Н.А. и соавт., 2007; Чучалин А.Г., 2009; Bekaert М. и соавт., 2011; Белобородова Н.В., 2013].

Острый респираторный дистресс-синдром - частое осложнение нозокомиальной пневмонии у больных абдоминальной хирургической инфекцией. В данной категории больных ОРДС 1 стадии развивается в 43,4% случаев, 2 стадии - в 20,0% случаев, в среднем на 3,2±1,2 сут. течения нозокомиальной пневмонии. Летальность при развитии ОРДС на фоне НП составляет 21,0% [Bauer Т. et al., 2006; Мороз В.В. и соавт., 2006, 2007, 2011, 2013; Марченков Ю.В. и соавт., 2012].

В настоящее время наиболее актуальными являются проблемы диагностики нозокомиальной пневмонии и ОРДС, развивающегося на ее фоне, лечения НП и ОРДС, а также оценки рисков развития НП и ОРДС у больных абдоминальной хирургической инфекцией.

Диагностика НП и ОРДС у больных абдоминальной хирургической инфекцией представляет значительные трудности. Имеющиеся в настоящее время клинические, лабораторные и инструментальные методы диагностики не обладают достаточной чувствительностью и специфичностью. Микробиологические методы являются обязательными, но всегда связаны с временной задержкой в получении результата [Чучалин А.Г., 2009; Дмитриева Н.В. и соавт. 2013; Berton D. и соавт. 2012; Zagli В. и соавт., 2014].

Молекулярные биомаркеры перспективны для диагностики и мониторинга эффективности лечения НП, так как позволяют в минимальные сроки и наименее инвазивно получить информацию о состоянии больного. Для того чтобы вещество называлось биомаркером, должно быть соблюдено несколько условий: простота забора материала и методики измерения, повторяемость результатов измерения, обоснованность использования данного вещества с позиции патофизиологии, корреляция с наличием заболевания, его стадией или степенью тяжести. Любой биомаркер должен использоваться только в сочетании с клинической оценкой больного, а не изолированно. В качестве кандидатных биомаркеров при НП рассматривают прокальцитонин, копептин, растворимый триггерный рецептор миелоидных клеток первого типа, С-реактивный протеин, интерлейкин-1В, ингибитор активатора плазминогена 1 типа, сурфактантные протеины и др. Ни один из использующихся в настоящее время биомаркеров НП не является специфичным для патологического процесса в легких, а доступных в клинике биомаркеров ОРДС не существует. Поэтому актуально изучение новых специфических для патологического процесса в легких молекулярных биомаркеров

НП и ОРДС - белка клеток Клара и сурфактантных протеинов А и D [Matthay М.А., 2015; Hellyer Т.Р. и соавт., 2015].

Вклад генетических факторов в предрасположенность, особенности течения и исходы лечения при инфекционных осложнениях критических состояний неоспорим. Предрасположенность к развитию НП и ОРДС у больных абдоминальной хирургической инфекцией остается практически неизученной. Выявление генетических маркеров предрасположенности к развитию НП и ОРДС у больных абдоминальной хирургической инфекцией позволит выделить группы риска, что откроет возможности для применения алгоритмов профилактики НП и ОРДС, а также для персонализированного лечения больных. Изучение генов детоксикации ксенобиотиков, окислительно-восстановительного статуса и сосудистого гомеостаза открывает перспективы в отношении прогнозирования развития и исходов лечения НП и НП, осложненной ОРДС [Голубев A.M. и соавт., 2010; Мороз В.В. и соавт., 2012; Salnikova L.E. и соавт., 2015].

Рациональная антибиотикотерапия - основа лечения нозокомиальной пневмонии. Правильный выбор эмпирического режима антибиотикотерапии в значительной степени определяет исход лечения. Доказано, что неадекватный начальный режим антибиотикотерапии при тяжелой инфекции увеличивает риск летального исхода в 2-3 раза. Рекомендованные режимы антибактериальной терапии НП включают в себя внутривенные карбаменемы, цефалоспорины III-IV поколения, защищенные пенициллины с антисинегнойной активностью, аминогликозиды, фторхинолоны, гликопептиды и их комбинации [Белобородов В.Б., 2014].

Традиционное внутривенное введение антибиотиков широкого спектра действия не позволяет добиться их бактерицидной концентрации в легких, что приводит к увеличению резистентности микроорганизмов и длительности антибиотикотерапии. Поэтому перспективным направлением антибиотикотерапии НП является использование ингаляционных антибиотиков [Авдеев С.Н. и соавт., 2009; Белобородов В.Б., 2014; Palmer L., 2011; Zampieri F. и соавт., 2015].

Таким образом, данное исследование посвящено решению актуальной проблемы - разработке новых методов диагностики и лечения нозокомиальной пневмонии и нозокомиальной пневмонии, осложненной острым респираторным дистресс-синдромом, у больных абдоминальной хирургической инфекцией.

Цель исследования

Улучшить результаты диагностики и лечения нозокомиальной пневмонии у больных абдоминальной хирургической инфекцией.

Задачи исследования

1. Обосновать диагностическую информативность белка клеток Клара при нозокомиальной пневмонии у больных абдоминальной хирургической инфекцией.

2. Доказать возможность применения сурфактантного протеина А и сурфактантного протеина D в качестве молекулярного биомаркера повреждения альвеолярного эпителия II типа при нозокомиальной пневмонии, осложненной

острым респираторным дистресс-синдромом, у больных абдоминальной хирургической инфекцией.

3. Выявить генотипы предрасположенности к развитию нозокомиальной пневмонии и нозокомиальной пневмонии, осложненной острым респираторным дистресс-синдромом.

4. Обосновать эффективность и целесообразность применения ингаляционного тобрамицина в качестве дополнения к системной антибиотикотерапии при нозокомиальной пневмонии у больных абдоминальной хирургической инфекцией.

5. Изучить в эксперименте протективное действие перфторана при повреждении легких, вызванном липополисахаридом.

6. Разработать на основе полученных данных алгоритм диагностики и лечения нозокомиальной пневмонии и нозокомиальной пневмонии, осложненной острым респираторным дистресс-синдромом, у больных абдоминальной хирургической инфекцией.

Научная новизна

1. Доказано, что содержание в крови белка клеток Клара информативно в качестве молекулярного биомаркера наличия Pseudomonas aeruginosa при нозокомиальной пневмонии у больных абдоминальной хирургической инфекцией.

2. Доказано, что повышение содержания в крови сурфактантных протеинов А и D информативно в качестве молекулярных биомаркеров повреждения альвеолярного эпителия II типа при нозокомиальной пневмонии, осложненной острым респираторным дистресс-синдромом, у больных абдоминальной хирургической инфекцией.

3. Выявлены ранее не изученные влияния рисковых аллелей в генах детоксикации ксенобиотиков и ренин-ангиотензиновой системы на развитие и исходы лечения нозокомиальной пневмонии и нозокомиальной пневмонии, осложненной острым респираторным дистресс-синдромом.

4. Установлена эффективность ингаляционного тобрамицина в качестве дополнения к системной антибиотикотерапии при нозокомиальной пневмонии у больных абдоминальной хирургической инфекцией.

5. В экспериментальной модели доказано протективное действие перфторана при повреждении легких, вызванном липополисахаридом.

6. Разработан на основе результатов исследования новый алгоритм диагностики и лечения нозокомиальной пневмонии и нозокомиальной пневмонии, осложненной острым респираторным дистресс-синдромом, у больных абдоминальной хирургической инфекцией.

Практическая значимость

1. Установлено, что для диагностики наличия Pseudomonas aeruginosa при нозокомиальной пневмонии у больных абдоминальной хирургической инфекцией целесообразно оценивать содержание в крови белка клеток Клара.

2. Обоснована оценка содержания в крови сурфактантного протеина D (изолированно или в комплексе с индексом оксигенации и индексом внесосудистой воды легких) и сурфактантного протеина А для диагностики и прогнозирования исходов лечения нозокомиальной пневмонии, осложненной острым респираторным дистресс-синдромом, у больных абдоминальной хирургической инфекцией.

3. Выявлено, что исследование ассоциаций рисковых аллелей в генах детоксикации ксенобиотиков и ренин-ангиотензиновой системы информативно для оценки риска развития нозокомиальной пневмонии и нозокомиальной пневмонии, осложненной острым респираторным дистресс-синдромом.

4. Разработана и внедрена методика применения ингаляционного тобрамицина в качестве дополнения к системной антибиотикотерапии в лечении нозокомиальной пневмонии у больных абдоминальной хирургической инфекцией.

5. Обосновано использование перфторана в виде ингаляций в качестве цитопротектора нозокомиальной пневмонии, осложненной острым респираторным дистресс-синдромом, у больных абдоминальной хирургической инфекцией.

6. Разработан и внедрен новый алгоритм диагностики и лечения нозокомиальной пневмонии и нозокомиальной пневмонии, осложненной острым респираторным дистресс-синдромом, у больных абдоминальной хирургической инфекцией.

Научные положения, выносимые на защиту

1. Белок клеток Клара, сурфактантный протеин D и сурфактантный протеин А информативны для диагностики и прогнозирования исходов лечения нозокомиальной пневмонии и нозокомиальной пневмонии, осложненной острым респираторным дистресс-синдромом, у больных абдоминальной хирургической инфекцией.

2. Аллельные варианты генов детоксикации ксенобиотиков и ренин-ангиотензиновой системы сопряжены с риском развития нозокомиальной пневмонии. При максимально возможном числе рисковых аллелей равном 12, увеличение количества рисковых аллелей до четырех и более у больных нозокомиальной пневмонией сопряжено с риском развития острого респираторного дистресс-синдрома.

3. Ингаляционный тобрамицин эффективен в качестве дополнения к системной антибактериальной терапии при лечении нозокомиальной пневмонии у больных абдоминальной хирургической инфекцией.

4. Перфторан при ингаляционном введении оказывает протективное действие при повреждении легких, вызванном липополисахаридом.

Реализация результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практическую работу и курсы лекций для ординаторов и врачей циклов усовершенствования Федерального государственного бюджетного научного учреждения "Научно-исследовательский институт общей реаниматологии им. В.А. Неговского", Федерального государственного казенного учреждения "Главный военный клинический госпиталь им. академика

Н.Н. Бурденко" и Медицинского института Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта».

За выполнение данного научного исследования автор был дважды награжден Стипендией Президента РФ молодым ученым и аспирантам, осуществляющим перспективные научные исследования и разработки по приоритетным направлениям модернизации российской экономики: на 2012-2014 гг. (Приказ №948, 21.11.2012, тема исследования "Новые биомаркеры тяжелых инфекционных осложнений критических состояний""), на 2015-2017 гг. (Приказ №184, 10.03.2015, тема исследования "Новые аспекты диагностики и лечения нозокомиальной пневмонии у больных хирургической абдоминальной инфекцией").

Апробация диссертации

Работа выполнена в соответствии с планом НИР в ФГБНУ «НИИОР». Тема диссертации утверждена на заседании Учёного совета ФГБНУ «НИИОР» от 28 июня 2011 г., Протокол №10. Регистрационный номер НИОКР 01201253333.

Результаты диссертационного исследования были доложены на следующих научных мероприятиях: конференция молодых ученых "Новое в диагностике и лечении в реаниматологии" (Москва, 2010); Всероссийская научно-практическая конференция "Неотложная медицинская помощь (состояние, проблемы, перспективы развития" (Москва, 2011); XIX Российский Национальный Конгресс "Человек и лекарство" (Москва, 2012); XIV Съезд Федерации анестезиологов и реаниматологов РФ (Казань, 2014); XIII Всероссийская конференция "Жизнеобеспечение при критических состояниях" (Москва, 2011); XV Всероссийская конференция "Жизнеобеспечение при критических состояниях" (Москва, 2013); XVI Всероссийская конференция с международным участием "Жизнеобеспечение при критических состояниях" (Москва, 2014); 30-й Симпозиум "Современные аспекты анестезиологии, хирургии и периоперационной медицины" (Пуэрто-Рико, 2012); конгресс "Евромедика" (Ганновер, Германия, 2013); конгресс "Евромедика" (Ганновер, Германия, 2014); конгресс "Евромедика" (Ганновер, Германия, 2015); 33-й Международный симпозиум по интенсивной и неотложной медицине (Брюссель, Бельгия, 2013); 34-й Международный симпозиум по интенсивной и неотложной медицине (Брюссель, Бельгия, 2014); 35-й Международный симпозиум по интенсивной и неотложной медицине (Брюссель, Бельгия, 2015).

Материалы проведенных исследований представлены в 35 научных работах (статьи, тезисы, методические рекомендации, учебные пособия), в том числе 12 из них опубликованы в журналах, входящих в перечень ВАК российских рецензируемых научных журналов, в которых должны быть опубликованы основные результаты диссертаций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 206 страницах машинописного текста. Состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения с

микрофотографиями и указателя литературы. Указатель литературы включает 352 источника, из которых 61 отечественных. Работа иллюстрирована 18 таблицами, 49 рисунками, 9 микрофотографиями в приложении.

Генетическая предрасположенность к развитию нозокомиальной пневмонии и острого респираторного дистресс-синдрома

Больные абдоминальной хирургической инфекцией подвержены наибольшему риску развития НП. Частота развития НП в данной группе больных достигает 64%. К основным патогенетическим факторам НП в данной категории больных являются: длительная ИВЛ, повторные операции и анестезии, широкое применение инвазивных лечебных и диагностических процедур, наличие синдрома кишечной недостаточности, возможность гематогенного и лимфогенного инфицирования из септических очагов в брюшной полости. Кроме того, важный вклад в патогенез НП у больных абдоминальной хирургической инфекцией вносят нарушения фагоцитоза, работы системы комплемента, активности нейтрофилов, дисфункция Т-клеток и моноцитов [30].

На основе знания патогенеза базируется организация методов профилактики НП. Борьба с эндогенным инфицированием заключается в обработке полости рта и профилактике аспирации, раннее удаление инвазивных устройств, использование неинвазивной вентиляции при наличии показаний. Борьба с экзогенным инфицированием заключается в соблюдении санитарно-эпидемиологического режима в отделении реаниматологии, гигиене рук персонала (регулярное мытье рук, обработка рук спиртовыми растворами после каждого контакта с больным) и другие мероприятия инфекционного контроля в стационаре [13].

В основе патогенеза ОРДС лежит повреждение эндотелия микроциркуляторного русла легких (непрямыми повреждающими факторами) и альвеолярного эпителия (прямыми повреждающими факторами) эндогенными и экзогенными факторами агрессии с развитием некардиогенного отека легких [6, 20-21, 27].

Повреждение структур аэрогематического барьера ведет к привлечению в легкие макрофагов и нейтрофилов, выделяющих большие количества биологически-активных веществ, нарушению микроциркуляции в легких, повышению проницаемости легочных капилляров, развитию некардиогенного отека легких (интерстициального и альвеолярного. В последующем прогрессируют нарушения респираторных и нереспираторных функций легких: снижается продукция и изменяется состав легочного сурфактанта, уменьшается эластичность легких и проходимость бронхиол, развиваются ателектазы, нарушаются реологические свойства бронхиального секрета и мукоцилиарный клиренс, повреждается реснитчатый эпителий, система антибактериальной и противовирусной защиты легких. Указанные изменения являются причиной ухудшения биомеханики легких, нарушения вентиляционно-перфузионных отношений, что ведет к ухудшению газообмена в легких, развитию и нарастанию гипоксемии, респираторной гипоксии. Клинически это проявляется развитием и прогрессированием острой дыхательной недостаточности [6, 20-21, 27].

Этиология ОРДС может быть обусловлена двумя группами факторов, оказывающих повреждающее действие на структуры аэрогематического барьера (Рис. 3): прямые повреждающие факторы - пневмония, аспирация, утопление, ингаляция токсических веществ (высокие концентрации кислорода, дым, едкие химикалии - двуокись азота, соединения аммония, кадмия, хлора, фосген), тупая травма груди, жировая эмболия, радиационный пневмонит и др. Острый респираторный дистресс-синдром, вызванный прямыми повреждающими факторами, более распространен, чем ОРДС, вызванный непрямыми повреждающими факторами, и составляет 55-75% случаев ОРДС. непрямые повреждающие факторы - шок, сепсис, панкреонекроз, тяжелая сочетанная неторакальная травма, массивная кровопотеря, массивные гемо- и плазмотрансфузии, отравления, искусственное кровообращение, ишемия-реперфузия, уремия, эклампсия, внутриутробная гибель плода, лимфатический карциноматоз, гипо- и гипертермия и др. Сепсис, тяжелая сочетанная травма, ушиб лёгких, пневмония, ингаляция дыма, гемотрансфузии, положительный жидкостный баланс, гипоальбуминемия, аспирация желудочным содержимым, - наиболее важные факторы риска развития ОРДС [6, 20-21, 27].

В ряде случаев у одного больного регистрируются как прямые, так и непрямые повреждающие факторы, приводящие к развитию ОРДС. В последнее время в хирургической клинике наиболее частой причиной развития ОРДС становятся заболевания поджелудочной железы (панкреатит, панкреонекроз) и абдоминальный сепсис [6, 20-21, 27].

Особенности патогенеза ОРДС, вызванного прямыми повреждающими факторами. При ОРДС, вызванном прямыми повреждающими факторами, происходит в первую очередь повреждение бронхиального и альвеолярного эпителия, что ведет к обтурации бронхов, появлению дистелектазов, ателектазов, развитию альвеолярного и интерстициального отека. У этих больных преобладает альвеолярный отек, отмечается накопление фибрина в альвеолах, на поздних стадиях отмечается большое количество волокон коллагена и апоптотических нейтрофилов. При действии прямых факторов участки повреждения представлены очаговыми уплотнениями в «зависимых» областях легких.

Развитие ОРДС при нозокомиальной пневмонии может быть обусловлено свойствами микроорганизмов, макроорганизма (иммунодефицит) и ятрогенными факторами (ИВЛ, токсическое действие кислорода, лечебные мероприятия) [6, 20-21, 27].

Микроорганизмы играют ведущую роль в развитии ОРДС при пневмонии, вызывая пневмонии тяжелого течения, с выраженным повреждением структур аэрогематического барьера, бактериемией и иммуносупрессией. К типичным возбудителям пневмонии, осложняющихся ОРДС, относятся Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Leptospira interrogans, Mycobacterium tuberculosis, Haemophilus influenzae, кишечные грам-отрицательные бактерии, Staphylococcus aureus, Pneumocystis jiroveci, Chlamydophila pneumonia, вирус гриппа, респираторно-синцитиальный вирус, Varicella-zoster вирус, вирусы гриппа, коронавирусы, Plasmodium falciparum; бактерии, ассоциированные с аспирационной пневмонии. Вероятность ОРДС повышается, если пневмония вызвана микробной ассоциацией, что актуально для большинства случаев НП [6, 20-21, 27; 33-35].

Свойства микроорганизмов играют ведущую роль в нарушении отграниченное инфекции в легких с последующим развитием ОРДС. Например, способность Pseudomonas aeruginosa вызывать ОРДС была показана в ряде экспериментальных и клинических исследований. Pseudomonas aeruginosa обладает множеством факторов вирулентности: капсулоподобный экзополисахарид, пили, ЛПС наружной мембраны, фосфолипазы, две эластазы и щелочная протеаза. Протеазы Pseudomonas spp. разрушают соединительную ткань, межклеточные контакты и сосуды, что приводит к расширению зоны повреждения легких. Липаза и фосфолипаза С индуцируют выделение провоспалительных медиаторов из нейтрофилов, тромбоцитов и базофилов. Токсины А и S - важнейшие токсины данного микроба, действующие аналогично дифтерийному токсину (ингибирование синтеза белка на рибосомах за счет инактивации фактора элонгации). Эластазы Pseudomonas aeruginosa повышают проницаемость альвеолярного эпителия вследствие разрушения плотных контактов между альвеолоцитами. Повышение проницаемости, в свою очередь, облегчает проникновение воспалительных клеток, привлеченных ЛПС, в просвет альвеол. В исследовании Le Berre R. и соавт. показано, что при НП, вызванной Pseudomonas aeruginosa, усилен апоптоз альвеолоцитов. Exo-U фактор с активностью фосфолипазы А2 обладает прокоагулянтными свойствами, а также повреждает альвеолоциты и альвеолярные макрофаги. Инстилляция культуры Pseudomonas aeruginosa в легкие вызывает развитие отека легких [6, 20-21, 27; 33-38]. Ключевое звено патогенеза ОРДС при НП - повреждение альвеолоцитов. Степень повреждения альвеолоцитов в большой степени определяет исход ОРДС. Роль микроорганизмов заключается в том, что они вызывают структурные повреждения аэрогематического барьера и нарушают ограниченность воспалительного процесса в легких. ОРДС при НП развивается при диффузном повреждении альвеолоцитов и снижении иммунитета, когда нарушается структура аэрогематического барьера и создаются условия для проникновения цитокинов и микроорганизмов в кровь [6;20-21].

Принципы лечения нозокомиальной пневмонии

Диагностика сепсиса осуществлялась в соответствии с критериями the Surviving Sepsis Campaign 2012 [248].

Диагностика абдоминальной хирургической инфекции осуществлялась в соответствии с Национальный практическими рекомендациями, изложенными в руководстве "Абдоминальная хирургическая инфекция: клиника, диагностика, антимикробная терапия" (2006) [30].

Анализ газового состава артериальной и смешанной венозной крови осуществлялся на Bayer 865 Blood Gas Analyzer (Bayer, Германия). Соотношение РаСЬ/НСЬ рассчитывалось как соотношение напряжения кислорода в артериальной крови к фракции кислорода во вдыхаемой смеси. Общий анализ крови выполнялся на автоматическом гематологическом анализаторе Advia 60 (Bayer, Германия). Общий анализ крови выполнялся на автоматическом гематологическом анализаторе Advia 60 (Bayer, Германия).

Параметры центральной гемодинамики и индекс внесосудистой воды легких измерялись по методике транспульмональной термодилюции с использованием модуля инвазивного мониторинга М1012А#С10 "Pulsion PiCCO Plus" (Pulsion Medical Systems, Германия), интегрированного в монитор Philips IntelliVue серии CMS2001 (Philips Medizin Systeme, Германия). Для осуществления инвазивного мониторинга производилась пункция и катетеризация бедренной артерии (набор Pulsiocath PV2015L20 + РССО Monitoring kit 5uV/V/mmHg PV8115). Длительность нахождения катетера в бедренной артерии не превышала 10 сут. Промывание артериальной линии проводилось периодическими болюсами физиологического раствора с добавлением гепарина 1 ЕД/мл. Перед первой калибровкой измерялись рост и вес больного с помощью кроватных электронных весов (Seca, Vogel&Halke, Германия). В качестве холодового индикатора использовалось 15 мл физиологического раствора натрия хлорида t 0 С. При калибровке прибора выполнялось три последовательных Холодовых термодилюции. Калибровку прибора проводили 2 раза в сут. или чаще при нестабильном состоянии больного. Измерялись следующие параметры: частота сердечных сокращений (ЧСС), артериальное давление систолическое (АДсист), артериальное давление диастолическое (АДдиаст), артериальное давление среднее (АДср), центральное венозное давление (ЦВД), ударный объем (УО), сердечный выброс (СВ), общее периферическое сосудистое сопротивление (ОПСС), глобальный конечно-диастолический объем (ГКДО), внутригрудной объем крови (ВГОК), внесосудистая вода легких (ВСВЛ) и соответствующие индексированные показатели, индекс проницаемости легочных сосудов (ИПЛС).

Рентгенография органов грудной клетки выполнялась в палате отделения реаниматологии портативным рентгеновским аппаратом Siemens Polymobil 10 (Siemens, Германия), КТ - на аппарате Somatom Sensation 16 (Siemens, Германия).

Больным всех групп проводилась стандартизированная комплексная этиотропная, патогенетическая и симптоматическая интенсивная терапия и динамический мониторинг, включающие в себя: респираторную поддержку (см. ниже), антибиотикотерапию (см. ниже), инфузию инотропных и вазопрессорных препаратов (норадреналин), инфузионную (кристаллоидные растворы), трансфузионную (эритроцитная масса, свежезамороженная плазма, альбумин), антисекреторную (блокаторы протонной помпы, сандостатин), седативную и анальгетическую (гипнотики, опиоиды, нестероидные противоспалительные препараты, парацетамол, эпидуральное обезболивание), антикоагулянтную (низкомолекулярные гепарины) терапию, парентеральное (трехкомпонентные питательные смеси) и энтеральное питание с добавлением комплексов витаминов и микроэлементов, хирургические вмешательства.

У всех больных (НИ, в т.ч. при развитии ОРДС) применяли респираторную поддержку в соответствии с концепцией безопасной ИВ Л, приемы "открытие легких" по пошаговой методике (по показаниям), ограничение инфузий/трансфузий и диуретики (фуросемид - 800-1000 мг в/в в течение 24 ч.), специализированную нутритивную поддержку. Раннее энтеральное питание начинали у всех больных после стабилизации гемодинамики (в течение 6-8 ч. от поступления в отделение реаниматологии). Использовались специализированные смеси типа Пульмо в объеме 1,0-1,5 л/сут. + энтеральное питание, обогащенное омега-3 жирными кислотами (до 500 мл/сут., суммарно 2000-2500 ккал/сут.) + фармаконутриенты (глутамин 100 мл в/в 1 р/сут., омегавен 100 мл в/в 1 р/сут.). Энтеральное питание проводили через назогастральный зонд с использованием помп для энтерального питания. Несколько раз в сутки оценивали эффективность проводимой нутритивной поддержки путем оценки остаточного объема содержимого желудка. При невозможности полноценного обеспечения энергетических потребностей больного путем энтерального питания его комбинировали с парентеральным (формулы "три в одном").

Респираторная поддержка проводилась на аппаратах Engstrom Carestation (GE Healthcare, США) в режиме SIMV с контролем по давлению (Synchronized Intermittent Mandatory Ventilation, синхронизированная перемежающаяся принудительная вентиляция). При проведении респираторной поддержки обеспечивали пиковое давление в дыхательных путях не более 35 см водн. ст.; дыхательный объём не более 6-8 мл/кг должной массы тела; частоту дыхания и минутный объём вентиляции минимально необходимые, для поддержания РаСОг на уровне 30-40 мм рт.ст.; скорость пикового инспираторного потока в диапазоне от 30-40 до 70-80 л/мин; нисходящий профиль инспираторного потока; фракцию кислорода в дыхательной смеси - минимально необходимую для поддержания достаточного уровня оксигенации артериальной крови; выбор ПДКВ осуществлялся в соответствии с концепцией «оптимального ПДКВ»; отношение вдох/выдох не инвертировали более 1,5:1. Контроль газового состава артериальной крови осуществляли 2 р/сут.

Больные всех групп были обследованы по следующему алгоритму (день включения в исследование, 3, 5 и 7 сут.): оценка по шкале APACHE II (в день включения в исследование), SOFA, CPIS, Murray, физикальное обследование, оценка газов артериальной крови, параметров центральной гемодинамики, индекса внесосудистой воды легких, общего анализа крови; рентгенография органов грудной клетки. Материалы и методы генетического исследования. Выборка составила 419 больных и пострадавших (81,1% мужчин в возрасте 42,9±0,9 года). В данную группу были включены также травмированные (тяжелая сочетанная травма).

Характеристика исследованных групп представлена в Табл. 7. Группы больных были сравнимы по полу, возрасту, этнической принадлежности. В каждой из групп превалировали кавказоиды, преимущественно восточные славяне (85,6% и 80,4 %), к которым относятся русские (на 73,7% и 68,2 %). Наиболее частое осложнение в исследованной группе - НП составила 268 (63,9%) случаев. Очевиден и тот факт, что в группе с НП частота развития критических состояний существенно выше, чем у пациентов без НП, в частности, ОРДС составил - 69 (25,8%) и 3 (2,0%) случаев соответственно. Поэтому в группе НП применение респираторной поддержки было более частым и длительность ИВЛ более продолжительной по сравнению с группой без НП, что, в свою очередь, приводило к увеличению времени пребывания в отделении реаниматологии и в стационаре.

Белок клеток Клара - новый молекулярный биомаркер наличия " Pseudomonas aeruginosa при нозокомиальной пневмонии

Белок клеток Клара исследовался во многих работах как маркер непрерывности эпителиального барьера легких и активности местной иммунной системы легких при идиопатическом легочном фиброзе, саркоидозе, хронической обструктивной болезни легких, астме, облитерирующем бронхиолите, у курильщиков и т.д. Содержание ССР в плазме крови снижено при хронических заболеваниях легких вследствие деструкции клеток Клара, но значительно повышено при острых заболеваниях легких. Учитывая биологическую функцию клеток Клара и ССР, повышение содержания ССР в плазме крови больных в критических состояниях без НП связано, вероятно, с активацией местной иммунной системы легких, пролиферацией клеток Клара, а также усилением синтеза ССР. Необходимо учитывать, что содержание ССР в крови зависит также и от скорости выведения данного белка почками с мочой. Кроме того, на содержание ССР в крови оказывают влияние биологические ритмы, возраст, этническая принадлежность и др. Содержание ССР повышается в крови спортсменов после физической нагрузки, у пловцов после воздействия дезинфектантов для очистки воды, его содержание снижено в БАЛ у больных аллергией и хроническими вирусными инфекциями, при избыточных физических нагрузках у спортсменов [261-267].

Белок клеток Клара широко обсуждается в качестве молекулярного биомаркера как при ОРДС, так и при НП [265-270]. Исследований по диагностической информативности ССР при НП, осложненной ОРДС, в доступной литературе нами найдено не было.

Имеются отдельные исследования на небольших гетерогенных выборках больных и с противоречивыми результатами по информативности ССР в диагностике НП [261-267]. По данным исследования Vanspauwen М. и соавт. (2011) содержание ССР в БАЛ было выше у больных НП по сравнению с больными без НП, но в данном исследовании, в отличие от нашего, изучали содержание ССР в БАЛ [263].

Повышение содержания ССР в крови при ОРДС связано с повреждением структур аэрогематического барьера и терминальных бронхиол с последующим проникновением белка в кровь. Показано, что содержание ССР в БАЛ может выступать в роли предиктора развития ОРДС у больных в критических состояниях [268]. По данным проспективного многоцентрового исследования Lesur Р. и соавт. (2006) содержание ССР было выше у умерших по сравнению с выжившими [269]. Значительный вклад в повышение уровня ССР в БАЛ у больных ОРДС играет ИВ Л [270]. По данным Determann R. и соавт. (2009) развитие ОРДС при НП сопровождается трехкратным приростом ССР в плазме [267].

По результатам нашего исследования не было получено данных об информативности белка клеток Клара в качестве молекулярного биомаркера НП или ОРДС. Различия результатов нашего исследования и других исследований связаны, вероятно, с различными выборками больных. Кроме того, необходимо отметить, что в большинстве исследований по данной проблеме измерение содержания ССР выполнялось в БАЛ, что снижает достоверность, поскольку забор БАЛ не стандартизирован.

Полученные нами данные по информативности ССР для диагностики наличия Pseudomonas aeruginosa в БАЛ при НП у абдоминальных хирургических больных представляют значительную научную новизну и имеют практическое значение. В доступной нам литературе не было найдено аналогичных клинических исследований в аналогичной категории больных.

Около 20% НП вызвано Pseudomonas aeruginosa. Исходы лечения НП в данной группе больных наиболее плохие, общая летальность достигает 70%, атрибутивная - 40%. В настоящее время выделяют около 20 серотипов Pseudomonas aeruginosa [271].

Описанное снижение содержания ССР в плазме крови больных НП, вызванной Pseudomonas aeruginosa, представляет собой новые данные по патогенезу НП у больных абдоминальной хирургической инфекцией и связано, вероятно, не с деструкцией клеток Клара, а со снижением синтеза ССР в клетках Клара. Результаты нашего исследования подтверждаются данными ряда экспериментальных работ, в которых показано, что Pseudomonas aeruginosa выраженно угнетает экспрессию проксимальной части промотора гена ССР в альвеолоцитах. Угнетение активности промотора данного гена вызвано главным образом ФНО-а, секретируемым Pseudomonas aeruginosa. Известно, что инфекция легких, вызванная Pseudomonas aeruginosa, сопровождается значительным повышением содержания в плазме и мокроте ФНО-а, который в свою очередь ингибирует синтез ССР в клетках Клара. В работе Harrod К. и соавт. показано, что нейтрализующие антитела против человеческого ФНО-а вызывают реверсию данного эффекта на промотор гена ССР. Возможно и обратное объяснение - у мышей, дефицитных по экспрессии ССР, клеточная реакция на ингаляцию ЛПС Pseudomonas aeruginosa значительно более выражена. Наше исследование впервые подтвердило результаты данных экспериментальных исследований в клинике [264; 272-274].

Использование белка клеток Клара в качестве молекулярного биомаркера обладает несомненными преимуществами по сравнению с другими молекулярными биомаркерами НП: 1. Включенность ССР в патогенез НП (специфичный для легких биомаркер). 2. Ассоциация содержания в крови ССР с наличием конкретного микроорганизма {Pseudomonas aeruginosa), что определяет тактику антибиотикотерапии.

Доказано, что белок клеток Клара является чувствительным и специфичным диагностическим молекулярным биомаркером наличия Pseudomonas aeruginosa при нозокомиальной пневмонии у больных абдоминальной хирургической инфекцией (содержание белка клеток Клара 17,5 нг/мл, диагностический диапазон 4,5-15,2 нг/мл, чувствительность 92,7%, специфичность 72,0%, площадь под кривой 0,84; 95% доверительный интервал 0,713-0,926; р=0,0001). Полученные данные по информативности белка клеток Клара позволяют включить его в алгоритм диагностики наличия Pseudomonas aeruginosa при нозокомиальной пневмонии у больных абдоминальной хирургической инфекцией.

Содержание сурфактантных протеинов класса D (SP-D) у здоровых доноров Медиана содержания SP-D в плазме крови здоровых доноров составила в плазме крови здоровых доноров составила 88,1 нг/мл (25-75 IQR 80,5-97,8 нг/мл). Содержание данных веществ в плазме крови здоровых доноров отражает, вероятно, физиологический процесс проникновения данного вещества в кровь через аэрогематический барьер, которое описано в ряде исследований.

Протективное действие перфторана при повреждении легких, вызванном липополисахаридом (экспериментальное исследование)

Таким образом, был проведен анализ влияния полиморфных вариантов в генах детоксикации ксенобиотиков и сосудистого гомеостаза на развитие и течение НП и ОРДС в сравнительно однородных группах больных, проживающих в Центральной части России и являющихся европеоидами по происхождению. Выявлены новые генетические маркеры предрасположенности к развитию НП и ОРДС.

Наиболее интригующим результатом исследования является совокупное влияние рисковых аллелей в генах, содержащих гены-партнеры (детоксикации ксенобиотиков: CYP1A1 и AhR и ренин-ангиотензиновой системы: АСЕ, AGT, AGTR1) на вероятность развития НП и ОРДС.

В доступной литературе исследований, аналогичных данному, найдено не было. В большинстве работ изучены факторы генетической предрасположенности к развитию ОРДС на фоне сепсиса, но не ОРДС при НП. В исследованиии Matsuda А. и соавт. было показано, что полиморфизм гена АСЕ I/D не был ассоциирован с риском развития ОРДС, но был связан с риском летального исхода при ОРДС в азиатской популяции [251-252]. Также было показано, что D аллель гена АСЕ ассоциирована с развитием ОРДС (OR 4,75, 95% СІ 1,02-22,20, р=0,048) [253]. В работе Ahasic А. и соавт. было показано, что гомозиготы по минорному аллелю rs2082940 гена адипонектина ассоциированы с развитием летального исхода у больных ОРДС (HR 2,61, 95% доверительный интервал 1,36-5,00, р=0,0039) [254]. В работе Tsantes А. и соавт. [256] было установлено, что D-аллель гена ангиотензин-превращающего фермента ассоциировано с повышенной летальностью при ОРДС (OR 1,76, 95% CI 1,19-2,59).

Результаты исследований, выполненных совместно НИИ общей реаниматологии им. В.А. Неговского и НИИ общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, дополнительно указывают на роль генов детоксикации ксенобиотиков (особенно CYP1A1) и генов системы гемостаза в предрасположенности к пневмониям различного генеза. В исследованиях Сальниковой Л.Е., Смелой Т.В. соавт. по внебольничной пневмонии была установлена система молекулярно-генетических маркеров предрасположенности к внебольничной пневмонии с площадью под ROC-кривой 68.38%, что является очень высоким показателем для генетических маркеров (диапазон в литературе 45-63%). Та же группа исследователей выявила кумулятивные генетические маркеры (в генах АСЕ, IL6, CYP1A1) предрасположенности к риску развития внебольничной пневмонии, независимо от других факторов риска (возраст, пол, возбудитель инфекции, искусственная вентиляция легких). Анализ в группах, стратифицированных по возбудителям {Streptococcus pneumonia и Staphylococcus aureus), и в целой выборке показал аналогичные результаты

Принимая во внимание то, что ферменты системы цитохрома Р450 играют важную роль в метаболизме экзогенных и эндогенных химических веществ, выявленные эффекты гена CYP1A1 кажутся не случайными. Фермент CYP1A1 принимает участие в регуляции функций бронхиального и альвеолярного эпителия; кроме того, ферменты системы Р450, в том числе CYP1A1, вовлечены в формирование и дальнейшее регулирование реакций активных форм кислорода, в том числе, и токсические эффекты кислорода [255-256]. Функциональный полиморфизм rs2606345G/T расположен в интроне CYP1A1 и влияет на уровень экспрессии данного гена [257].

Окислительный дистресс играет важную роль в патогенезе значительного числа заболеваний. Важными компонентами защиты клеток от окислительного дистресса являются антиоксидантные ферменты, активность которых генетически детерминирована. Активные формы кислорода необходимы для энергетического обеспечения, а также для борьбы с инфекционными агентами, детоксикации ксенобиотиков, регуляции структурных процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза). Вместе с тем, высокая реакционная способность кислорода, особенно его активных форм, участвующих в разнообразных патологических процессах (воспаление, лихорадка, ишемия и другие), определяет целесообразность включения многоуровневой системы антиоксидантной защиты. Полиморфные варианты генов антиоксидатной системы, обусловливая функциональную вариативность белковых продуктов, влияют на широкий спектр биохимических реакций, направленных на активацию антиоксидатной системы, детерминируя тем самым риск реализации широкого спектра патологических состояний.

Результаты поиска генетических детерминантов антиоксидатной системы, указывают на наличие наследственной предрасположенности к дисбалансу в ней [255-257]. Легкие наиболее уязвимы в отношении окислительного повреждения, так как непосредственно подвергаются действию кислорода и его активных форм, обусловленных дисбалансом в системе оксиданты-антиоксиданты.

Хорошо известно, что активность гена CYP1A1 регулируется транскрипционным фактором AhR. Повышение базального уровня цитохрома Р450 (CYP) может быть обусловлено, в частности, полиморфизмом гена рецепторного белка AhR. Выявлено 10 наиболее распространенных вариантов гена AhR, влияющих на активность CYP. В частности, повышенная активность обнаруживается при наличии варианта в кодирующей области AhR (аллель G1721 А), причем у мужчин в большей степени, чем у женщин [325].

Кроме того, мы дополнительно изучили функциональный вариант (rs2066853) в домене трансактивации гена AhR. Выявление ассоциации полиморфизма AhR с риском развития ОРДС поддерживает гипотезу о причастности обоих генов к регуляции сигнальных каскадов, контролирующих прогрессирование воспаления в легких вплоть до развития ОРДС или возникновение НП на фоне ОРДС. Поэтому, мы полагаем, что полиморфные варианты генов CYP1A1 и AhR могут быть генетическими факторами риска развития ОРДС.

Изначально считалось, что AhR участвует в основном в метаболизме химических веществ из окружающей среды. Известно несколько физиологических лигандов для AhR, например, медиаторы острого воспаления лейкотриены и простагландины. Экспрессия AhR в большинстве типов клеток иммунной системы влияет на активность множества ксенобиотик- или диоксин-чувствительных элементов (XREs/DREs), которые регулируют иммунный ответ, что подчеркивает важность этого рецептора в иммунологических процессах, в частности при воспалении [325-327].

В результате проведенного исследования установлено значение генов еще одного важного метаболического пути (ренин-ангиотензиновой системы) в связи с риском возникновения ОРДС. Известно, что функциональная активность компонентов ренин-ангиотензиновой системы, в том числе генов ангиотензиногена (AGT), ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) и рецептора 1 типа ангиотензина II (AGTR1), влияет на артериальное давление и тонус сосудов, важна в связи с развитием воспаления [326].

Ангиотензин II (Angll) является основным эффектором ренин-ангиотензиновой системы и, как известно, благодаря сосудосуживающему эффекту вызывает значительное увеличение системного и локального артериального давления. Помимо прямого влияния Angll на системный кровоток, возможно также опосредованное воздействие белка на сосудистый тонус при травме в условиях окислительного стресса [3 27]. Для критических состояний характерна избыточная продукция свободных радикалов, истощение антиоксидантной защиты, что, в свою очередь, может послужить пусковым механизмом развития системного воспаления и полиорганной недостаточности [328]. Большинство физиологических и патофизиологических эффектов Angll реализуется при взаимодействии с AGTR1 [328]. Выявленная в настоящем исследовании ассоциация полиморфизма AGTR1 с неблагоприятным исходом при НП коррелирует с литературными данными и биологически оправдана.

Сопряженность вариабельности гена АВСВ1 с развитием ОРДС при НП объясняется его значением в фармакокинетике лекарственных препаратов через клеточные мембраны, так как индивидуальные особенности распределения и скорости возникновения терапевтического эффекта конкретного лекарственного средства у больного также генетически детерминированы [329-330].

Все шире признается, что анализируя суммарное влияние генов различных систем, предположительно участвующих в патогенезе критического состояния, можно приблизиться к пониманию механизмов реализации генетических детерминант. Учитывая данное соображение, нами были сгруппировали SNPs в метаболических путях, а затем протестировано совместное влияние комбинаций. Два набора генов-партнеров были проанализированы на основе их вклада в развитие воспаления и критического состояния. Полученные результаты позволяют думать о том, что существует тесная связь между двумя изученными метаболическими путями в отношении развития НП и ОРДС.